專利名稱：一株無色桿菌及其不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法
技術領域：
本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一株無色桿菌并應用該菌轉化 (Z) -3-芳基-3-氰基-丙烯酸，環狀酰亞胺和不飽和硝基化合物制備光學純缺電子烷烴化合物的方法，是無色桿菌屬首次應用于不對稱催化還原碳碳雙鍵。
背景技術：
光學純缺電子烷烴化合物是有機合成中的重要合成塊，可以用來制備光學純手性藥物。碳碳雙鍵還原酶(enoate reductase)不對稱催化還原帶有強吸電子基團的碳碳雙鍵，可同時得到具有一個或兩個手性中心的光學純缺電子烷烴化合物，是廣泛用來制備手性缺電子烷烴類的方法之一(Stuermer et al. 2007 Asymmetric bioreduction of activated C = C bonds using enoate reductases from the old yellow enzyme family. [Review], Curr Opin Chem Biol 11:203-213)。近幾十年來，隨著不對稱催化還原帶有強吸電子基團的碳碳雙鍵的快速發展，越來越多合成家開始關注碳碳雙鍵還原酶的新酶源的開發及底物譜的擴增。經過數十年的探索，已經從許多不同的生物來源中得到了碳碳雙鍵還原酶，如高等植物(地錢，長春花，煙草，番茄等)，細菌和真菌(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases. Chemcatchem 2:892-914)。由于微生物具有培養簡單，周期短等特點，所以在全細胞催化的生物轉化中，絕大數為微生物。相比之下，植物細胞培養比較復雜，不僅需要光照，而且周期較長，因此很少用于生物轉化中。碳碳雙鍵還原酶不對稱催化還原的底物類型主要有烯醛、烯酮、炔酮、不飽和硝基、不飽和硝基酯、不飽和腈、不飽和羧酸及其衍生物(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases. Chemcatchem 2:892-914)。與生物催化羰基還原相比， 生物催化碳碳雙鍵還原的研究較少，商品化的碳碳雙鍵還原酶更少(Chaparro-Riggers et al. 2007Comparison of three enoate reductases and their potential use for biotransformations. Adv Synth Catal 349 :1521-1531)。其主要原因是酶的活力低、穩定性差，不適合應用。因此，新型酶源的發掘對于發展碳碳雙鍵還原酶具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是公開一株無色桿菌，該菌于2011年10月31日在中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2011369，分類命名=AchromcAacter sp. JA81，并利用該菌具有生產高活力、高對映選擇性的碳碳雙鍵還原酶的特性，還原底物 (Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸制備光學純(R)-3-芳基-3-氰基丙酸，該(R)型產物是合成光學純Y-氨基丁酸的關鍵手性中間體。同時，該菌還可以催化環狀酰亞胺和不飽和硝基化合物制備光學純缺電子烷烴類化合物。為無色桿菌首次用于不對稱催化還原碳碳雙鍵。本發明無色桿菌(AchromcAacter sp. JA81)的篩選方法
以檸檬醛和(Z)-2_苯基丁 -2-烯腈為唯一碳源對來自成都龍泉果園和四川師范大學果園的土壤樣品進行富集，得到純培養菌株46株，以此46株菌株對模式底物馬來酰亞胺進行生物轉化，得到活力菌株16株，將此16株菌株對目標底物(Z) -3-苯基-3-氰基-丙烯酸進行生物轉化，對目標底物有活性的菌株進行進一步的鑒定。經篩選得到本發明涉及的無色桿菌JA81。具體方案見實施例。以無色桿菌JA81作為生物催化劑，轉化目標底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸生成相應的(R)-3-苯基-3-氰基丙酸。具體方法如下1.菌株培養斜面保存培養基組分為胰蛋白胨lg/100mL;酵母提取物0. 5g/100mL;NaCl lg/IOOmL ；瓊脂粉 2g/100mL ；液體發酵培養基組成為胰蛋白胨lg/100mL;酵母提取物0.5g/100mL;NaCl lg/IOOmL ；溶于去離子水，用NaOH調pH值為7. 0，105kPa，121°C，滅菌20分鐘。斜面培養將篩選得到的純培養菌株接種于斜面保存培養基上，30°C培養 24-48h ；種子培養將單菌落無菌條件下用滅菌槍頭接種于約IOml液體發酵培養基中， 300C，230rpm,培養Mh，制得種子液；搖瓶培養以的接種量將種子液接入新鮮的液體發酵培養基中，30°C， 230rpm，培養 36h02.收集菌體取步驟(1)中的搖瓶培養的菌液在4°C、7000轉/分鐘條件下離心8 分鐘，收集菌體，并用濃度為0. 79g/100mL的生理鹽水充分洗滌2次，得到濕菌體作為生物催化劑。3.生物轉化將步驟O)中得到的濕菌體以pH7. 0,0. IM磷酸鉀緩沖液配成細胞濃度為100-300g/L的菌懸液，加入底物(Z) -3-苯基-3-氰基-丙烯酸(底物溶于二甲亞砜，用量為100g/L)，終濃度為l-10g/L，按每IOOmL加入Ig的葡萄糖和5mL的異丙醇作為輔酶再生底物。生物轉化條件為30°C，230rpm，轉化時間為48h。4.分離樣品調反應液pH為6. 0-6. 5左右，分別用一倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，所得產品經Meglich酯化 (Neises and Steglich 1978 Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids. Angew Chem Int Ed 17: 522-5 )，得到甲酯化產物，分離純化，所得物充分溶于 ImL異丙醇(HPLC級)溶劑為備用檢測樣品。5.HPLC檢測取步驟中IyL樣品進樣，利用手性色譜柱測定(R)_3_苯基-3-氰基丙酸甲酯的含量，最后計算ee值。檢測ee值時手性色譜柱為Daicel Chiralcel 0D_!K250X4. 6mm)，流動相正己烷異丙醇=90 10，流速0.8ml/min，(R) _3_苯基-3-氰基丙酸甲酯和(S)-3-苯基-3-氰基丙酸甲酯的保留時間分別為11. 480min和14. 809min。其反應式如下
權利要求
1.一株無色桿菌(AchromcAacter sp.) JA81，保藏于中國武漢武漢大學，中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2011369。
2.以權利要求1所述的無色桿菌應用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于培養無色桿菌CCTCC M 2011369，離心收集菌體，經生理鹽水洗滌后，獲得濕菌體，并重懸于磷酸鉀緩沖液，制成菌懸液，加入生物催化的底物，并加入葡萄糖和異丙醇作為輔酶再生底物，轉化后得產物。
3.根據權利要求2所述的無色桿菌應用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于30°C培養無色桿菌CCTCC M 2011369，至36h，離心收集菌體，經濃度為0. 79g/100mL的生理鹽水洗滌2次后，獲得濕菌體，并重懸于0. 1M、Ph6. 0 8. 0的磷酸鉀緩沖液制成細胞濃度為100-300g/L的菌懸液，加入l-10g/L生物催化的底物，并按每IOOmL加入0 IOg 的葡萄糖和0 IOmL的異丙醇作為輔酶再生底物，于30°C，230rpm，轉化4 獲得產物。
4.根據權利要求3所述的無色桿菌應用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于所述磷酸鉀緩沖液的拖7. 0，按每IOOmL加入Ig的葡萄糖和5mL的異丙醇作為輔酶再生底物。
5.根據權利要求2-4所述的無色桿菌應用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于生物催化的底物為(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸或(Z)-3-(4-氯芳基)-3-氰基-丙烯酸或2-甲基-N-苯基-馬來酰亞胺或(E) -2-苯基-1-硝基-1-丙烯或(E)-1-苯基-2-硝基-1-丙烯或(E) -2-氰基-3-苯基-丙烯酸。
全文摘要
本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一株無色桿菌(Achromobacter sp.)JA81，保藏號為CCTCC M 2011369，以及利用該無色桿菌作為生物催化劑轉化(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸，環狀酰亞胺和不飽和硝基化合物，獲得缺電子烷烴化合物的方法，而且可獲得的最高對映體過量達到＞99％，最高轉化率達到100％。本發明的催化劑無色桿菌菌體易于制備，反應條件溫和，是綠色制造手性缺電子烷烴化合物的有效方法之一。
文檔編號C12P13/00GK102559553SQ201210004039
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月8日 優先權日2012年1月8日
發明者劉艷杰, 吳中柳, 林暉 申請人:中國科學院成都生物研究所