專利名稱：共轉染藥物代謝酶和轉運體的細胞模型的構建及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及共轉染藥物代謝酶CYP3A4和轉運體MDRl細胞模型的構建及用途。
背景技術：
口服給藥是臨床上最為常用的給藥方式之一。口服后藥物通常在小腸部位被吸收，透過小腸壁進入人體血液循環，到達靶部位而發揮療效。小腸是藥物吸收進入血液這一過程中主要的生理屏障。新藥研發中，候選化合物在小腸中的透過性可影響口服藥物的生物利用度，是決定化合物能否成為新藥的關鍵因素之一。目前廣泛應用的腸道模型為Caco-2細胞(人結腸癌上皮細胞)，但Caco-2細胞并不能完全模擬人體腸道模型，因為它不能產生粘液且只表達極少量的細胞色素P450酶 (CYP450)。Crespi等用含有人CYP3A4基因的P220. 2載體轉染Caco-2細胞，而使其CYP3A4 的表達量比未轉染的細胞高100倍。但該細胞系中CYP3A4的活性會在傳代過程中以3-4 周為半衰期而丟失。Cynthia Brimer等以pcDNA3. I和pR印10為載體將CYP3A4基因轉入 LLC-PKl細胞(豬腎上皮細胞)以獲得高表達CYP3A4的細胞系。但LLC-PKl細胞作為腸道體外模型也存在一些缺陷和不足，缺少腸道上重要的轉運蛋白。膜轉運蛋白對藥物的吸收、排泄甚至是代謝，都起著至關重要的作用。它可以保護細胞免受外來毒性物質侵害。1968年，Kessell等首次報導小鼠白血病細胞系中具有多藥耐藥(MDR)現象。Bielder和Reiehm在1970年就首次提出MDR的概念。1976年， Juliano和Ling在中國倉鼠卵巢細胞突變體細胞膜上發現了一種與MDR有關的糖蛋白，即 P-gp (P-glycoprotein,P-糖蛋白)，Genbank 編號為 NM_000927。P_gp 是一種跨膜糖蛋白， 由mdr基因編碼，屬于ABC轉運蛋白超家族，是具有1280個氨基酸，相對分子量170kDa的膜蛋白。P-gp的二級結構包括12個穿越細胞膜區，2個ATP結合/利用位點。它分為兩部分，每一部分均包括6個跨膜螺旋折疊組成的疏水區和一個ATP結合/利用位點的親水區。 Aller等人在2009年首次P-gp的晶體結構，為轉運蛋白的研究跨進很大一步。在人體中， 有外排作用的P-gp由MDRl基因編碼。P-gp分布廣泛,一般位于小腸、肝細胞、結腸和膽小管等組織的柱上皮細胞，腎臟近端小管的刷狀緣，腦部的毛細管內皮細胞。這種極化的定位，有利于它發揮作用，抑制外源物吸收、幫助其消除或者保護敏感組織(如腦或胎兒)與外源物的接觸。小腸上存在的多種藥物外排蛋白其中最為主要的一種即P-gp。人細胞色素P450 (CYP)是廣泛存在于生物體中的一類蛋白超家族，是一種含有鐵卟啉輔基的b族細胞色素。CYP450細胞色素超家族中根據同源性不同被劃分為多個家族和亞族，其中CYP1A2，2B6，2C9，2D6，和3A4被認為對于大部分藥物的代謝相較于其他I相氧化酶貢獻最多。人CYP3A家族包括CYP3A4，3A5，3A7，和3A43，其中CYP3A4在肝臟( 40% )和腸道中含量最高，代謝超過50%的臨床使用藥物。它參與了大多數藥物的代謝并導致其首過作用，從而使藥物的生物利用度降低，其中CYP3A4為其主要的亞型。。人類的 CYP3A4基因位于第7號染色體q22. 1，包括13個外顯子及12個內含子，cDNA長度為1512個堿基，Genbank編號為NM017460。CYP3A4的晶體結構已于2004年得到解析，現在已經得到了 CYP3A4單獨和與藥物結合的多種晶體結構(蛋白數據庫1W0E)。MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞系為馬丁達比狗腎上皮細胞發展的一種細胞間連接非常緊密的細胞系，低水平表達轉運蛋白，低代謝活性。MDCK細胞被認為是在遺傳學方面以及在細胞的脂質、蛋白質組成方面較為理想的上皮細胞系。此外，MDCK細胞很大的一個優點就是培養周期短，只要3 5天即能成熟(Caco-2則要21天)，這樣可以大大縮短實驗周期，提高效率。Caco-2和MDCK之間有很好的相關性，因此常用MDCK細胞作為腸道模型研究藥物在腸道的吸收情況。MDCK-MDR1細胞系是由MDCK細胞穩定轉染人源MDRl基因，極性過表達P-gp的細胞系，它所表達的P-gp是位于極性細胞膜的一側。早在1988年，Pasten等用人類的MDRl基因穩定轉染MDCK細胞建立了一個能大量表達P_gp 的細胞系。用MDRl轉染MDCK細胞建立的MDCK-MDR1細胞表達產生的P_gp主要是位于單層細胞細胞膜的頂側，Caco-2和MDCK-MDR1細胞用于藥物轉運實驗所得到的一些參數也比較一致，因此，MDCK-MDR1細胞作為模擬藥物腸道吸收模型比MDCK細胞更優越。由于腸道中，除了參與藥物轉運的P-gp外，還存在參與藥物代謝的CYP3A4， MDCK-MDR1細胞只能用于篩選評價藥物的吸收特性，不能反映藥物在腸道的代謝情況。因此，有必要建立MDRl和CYP3A4的雙轉染細胞模型，用于篩選和評價藥物在腸道的吸收和代謝性質。目前，沒有穩定共轉染MDRl與CYP3A4的細胞模型，因此將MDRl與CYP3A4共轉染至MDCK細胞，獲得既穩定高表達P-gp又有高代謝活性的轉基因細胞，作為一個更完善的體外腸道模型來研究研究藥物的跨膜轉運和體外代謝都有重大的研究意義，同時對了解藥物在腸道的吸收情況有實際指導作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種共轉染藥物代謝酶CYP3A4和轉運體MDRl的細胞模型的構建方法，主要是先將P-gp的基因MDRl克隆到pcDNA3. I (+) (invitrogen)上，轉染MDCK 細胞(ATCC)，經過G418篩選出單克隆細胞，得到MDCK-MDR1細胞株，然后將CYP3A4克隆到帶有潮霉素B篩選標記的載體pcDNA3. I (+) /Hygro (invitrogen)上,轉染MDCK-MDR1細胞， 經過潮霉素B篩選，得到共轉染CYP3A4和MDRl細胞。犬腎細胞MDCK-MDR1/CYP3A4目前已由中國典型培養物保藏中心(武漢大學)保藏；地址中國武漢武漢大學；保藏日期2011 年12月15日；培養物名稱犬腎細胞MDCK-MDR1/CYP3A4，保藏編號為=CCTCC C2011119。本發明的共轉染CYP3A4和MDRl細胞模型通過以下方法構建(I)將MDCK細胞以IO5/孔種于六孔板，培養48小時，用Lipofectamine 2000試劑(invitrogen)將表達載體pcDNA3. I (+)/MDRl轉染MDCK細胞，方法參考轉染試劑說明書，轉染24小時后換液，并加G418進行篩選，以濃度600ug/mL篩選96小時后升至800ug/ mL篩選24小時，(2)將存活的細胞轉移至培養瓶內培養，以600ug/mL的濃度培養二十天左右，按有限稀釋法接種于96孔板，獲得抗性單克隆，通過在mRNA，蛋白等水平檢測，篩選出活性較高的MDCK-MDR1細胞，(3)將MDCK-MDR1細胞以相同的密度種植于6孔板中，當細胞達50-70%匯合時進行轉染,使用Lipofectamine LTX轉染試劑(invitrogen)將表達載體 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4轉染至MDCK-MDR1細胞，方法參考轉染試劑說明書，轉染6小時后換含10% FBS的DMEM培養基，培養24小時后將培養基換成400ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培養基，(5)隔一天換新鮮的含400ug/mL潮霉素B和10 % FBS的DMEM培養基，篩選14天左右將存活的細胞按有限稀釋法接種于96孔板，獲得抗性單克隆MDCK-MDR1/ CYP3A4 細胞。在步驟(2)中，在mRNA水平驗證MDRl基因轉錄水平，采用的引物序列分別為MDRl 5’ -CCCATCATTGCATATGCAGG-3 ’5’ -GTTCAAACTTCTACTCCTGA-3’β-actin 5，-CCCCTGAATCCCAAAGCC-3 ’5’ -GATGTCACGCACGATCTCCC-3。在步驟(3)中，構建表達載體pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4中CYP3A4的引物序列為5，-CGGGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC-3，5， -ATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTGC-3，。本發明的另一個目的是提供所述共轉染細胞模型在P-gp和CYP3A4共同底物初步篩選中的應用，所述篩選可以模擬藥物在腸道中的吸收和代謝過程。本發明提供的雙轉染CYP3A4和MDRl的MDCK細胞株與已報道的Caco_2/CYP3A4 細胞株比較，具有(1)本發明構建的轉基因細胞MDCK-MDR1/CYP3A4細胞穩定表達P-gp和 CYP3A4蛋白，而部分報道的經誘導或瞬時轉染得到高表達CYP3A4的細胞，多次傳代后高表達性狀會消失，而MDCK-MDR1/CYP3A4細胞多次傳代后還將保持高表達的特征；(2)本發明構建的轉基因細胞MDCK-MDR1/CYP3A4細胞與已報道的Caco_2/CYP3A4細胞相比，培養周期短，且細胞較之Caco-2細胞更易于培養；Caco-2細胞中含有多種轉運蛋白，而MDCK-MDR1 細胞含單一的轉運蛋白P-gp，因此MDCK-MDR1/CYP3A4細胞對于研究藥物的吸收外排機理方面更有優勢；(3)有研究報道構建的LLC-PK1/CYP3A4細胞作為腸道模型，缺乏腸道上重要的轉運蛋白。而本發明構建的MDCK-MDR1/CYP3A4細胞共轉染轉運蛋白與代謝酶，作為模擬腸道的體外模型更為優越。本發明提到的雙轉染細胞模型可以用來模擬藥物載腸道的吸收和代謝過程，進而初步篩選P-gp和CYP3A4共同底物。


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圖況。
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質粒pcDNA3. I (+)/MDRl的鑒定電泳圖。質粒 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4 連接電泳圖。
;根據Rhol23細胞內積聚量篩選MDCK-MDR1單克隆的結果圖。
6ffestern blotting 檢測 MDCK-MDR1/CYP3A4 細胞中 CYP3A4 的表達量。
7底物BFC在MDCK-MDR1/CYP3A4單克隆細胞株中的代謝活性及抑制劑作用情
8底物睪酮在MDCK-MDR1/CYP3A4單克隆細胞株中的代謝情況。
9底物咪達唑侖在MDCK-MDR1/CYP3A4單克隆細胞株中的代謝情況。
10MTT實驗測定環磷酰胺對四種細胞的毒性結果。
IlMTT實驗測定GA(17:1)對三種細胞的毒性結果，根據IC50值篩選P-gp和CYP3A4的底物。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明。通過下列實施例對本發明的技術特征做詳細的描述，但不限制本發明。實施例I表達質粒pcDNA3. I (+) /MDRl 的鑒定及 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4 重組質粒的構建質粒pcDNA3. I (+) /MDRl作為表達載體，用感受態細菌E. coli DH 5 α擴增質粒， QIAprep Spin Miniprep試劑盒提取純化質粒，EcoR I酶切鑒定，并對質粒pcDNA3. I (+) / MDRl中的MDRl全長進行DNA序列測定。設計含Kpn I、Xho I酶切位點的PCR引物，上下游引物序列分別為 5’ -CGGGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC-3’ ；5’ -ATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTGC-3’。從本實驗室基因庫中釣取CYP3A4基因，T-A連接至pMD19_T Vector,經轉化、挑菌、搖菌、提取質粒后進行酶切鑒定及測序鑒定。Kpn I, Xho I雙酶切pMD9-T/CYP3A4，得到帶粘性末端的CYP3A4 cDNA，將其與Kpn I、Xho I雙酶切后得到的pcDNA3. I (+)/Hygro 載體連接，經轉化、挑菌、搖菌、提取質粒、酶切鑒定后進行連接區域DNA測序，從而構建出 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4 表達載體。表達載體pcDNA3. I (+) /MDRl電泳得9. 9kb條帶，用EcoR I酶切鑒定，得I. 2kb、
3.3kb、5. 4kb條帶(結果參見圖I)通過DNA測序發現，在表達載體中MDRl基因全長無有意義的堿基突變。重組質粒pcDNA3. I (+)/Hygro進行Xho I、Kpn I雙酶切鑒定正確(結果參見圖2)，挑選b號和d號進行測序鑒定，鑒定正確后-80°C保持以備后續實驗使用。 圖 I 中，A-質粒 pcDNA3. I (+)/MDRl 電泳圖，I 和 2 為 pcDNA3. I (+)/MDRl,大小是 9900bp ； B-質粒pcDNA3. I (+) /MDRl經EcoRI酶切鑒定圖，1、2和3為三個樣品酶切條帶，大小分別是 5400bp、3300bp、1200bp。圖 2 中，1-5 pcDNA3. I (+)/Hygro/CYP3A4 雙酶切電泳圖(KpnI, XhoI) ；6 pcDNA3. 1(+)雙酶切電泳圖(KpnI、XhoI)。實施例2 MDCK細胞轉染及功能鑒定將MDCK細胞以IO5/孔種于六孔板，培養48小時。用Lipofectamine 2000試劑將表達載體pcDNA3. I (+) /MDRl轉染進MDCK細胞內，方法參考轉染試劑說明書。轉染24小時后換液，并加G418進行篩選，以濃度600 μ g/ml篩選96小時后升至800 μ g/ml篩選24小時。然后將存活的細胞轉移至培養瓶內培養，以600 μ g/ml的濃度培養二十天左右。按有限稀釋法接種于96孔板，獲得19個抗性單克隆，為MDCK-MDR1細胞，分別以小寫字母a s命名。l.Rhol23在細胞內的積聚MDCK和MDCK-MDR1細胞以2X IO5/孔種于24孔板，48小時后，加入含4μ mol/L Rho123的DMEM完全培養液，孵育lOOmin，吸棄上清，用冰冷的PBS洗3次，吸凈剩余的PBS， 每孔加O. 25ml O. 2mol/L NaOH裂解細胞，IOmin后加O. 25ml O. 2mol/L HCl中和，反復吹打混勻，收集裂解液于離心管中。13000rpm離心lOmin，取上清200 μ I在激發波長485nm、發射波長530nm處檢測熒光強度，用BCA蛋白試劑盒檢測每個樣品的總蛋白量。在P_gp抑制劑對MDCK-MDR1細胞內積聚影響的研究中，在加入Rhol23之前先加入含O. lmmol/L維拉帕米的DMEM完全培養液預孵育lOmin，然后棄孵育液，加入含O. lmmol/L維拉帕米的4mol/L Rho 123孵育2h，其他步驟同上所述。每個樣品以所測得細胞內藥物Rhol23的量(RFU relative fluorescence units)除以總蛋白量(g)來表示其在細胞內的積聚量，以RFu/g表示。以MDCKKFU/g與MDCK_MDRlKFU/g的比值表征細胞對Rhol23的外排能力，比值越大說明細胞對 Rhol23的外排能力越強。用P-gp的抑制劑維拉帕米和Rhol23共孵育后，對其外排也有明顯的抑制作用(結果參見圖3)。圖3中，C為MDCK細胞Rhol23攝取量作陰性對照組，在 IOOmin的攝取實驗中以對照組(37. 26 ±4. 82) RFU/g的絕對值作為相對量1，1-17為抗性單克隆細胞株，林*P < O. 001，**P < O. 01，與陰性對照組相比;_P < O. 001**P < O. 01，藥物組與抑制劑組相比。通過統計學分析，由結果可看出單克隆株a、b、d、f、h、j、m、q、s對Rhol23有明顯的外排作用，且它們和對照之間的差異有統計學意義，此外在P-gp抑制劑存在的條件下， 單克隆株a、b、d、f、h、j、q、s外排作用顯著減弱，與單克隆株Rhol23孵育后細胞內的積聚量進行比較，也有顯著的統計學差異，進一步證明外排作用是P-gp所引起的，且蛋白表達水平及活性上有很大的差異。2. RT-PCR 檢測 mRNA 的表達使用Trizol提取MDCK和MDCK-MDR1細胞的mRNA，cDNA合成反應體系以及PCR反應體系如下(表I和表2)表I. cDNA合成反應體系RNA 模板3 μ gOligo (dT) 18O. 5 μ g經DEPC 處理的水 to 11 μ I70°C孵育5min，然后置于4°C 5min后加入37°C孵育 5min 后加入 200units 的 M-MuLv Reverse Transcriptase lul,42°C孵育60min后，70°C孵育lOmin，最后置于4°C。表2. PCR 反應體系(25 μ I)
5 X緩沖液
4μ1
2μ1
0.5μ1 (40υ/μ1) to 19μ1
IOmMdNTP RNase 抑制劑 C20U)
經DEPC處理的水
cDNA
Taq DNA聚合酶
PCR反應緩沖液
2μ1
0.5μ1
MgCl2
H2O
引物
21.5μ1
2μ1
15.5μ1
2μ1
PCR反應條件94°C下初次變性3min，然后進行30個循環的反應(94°C 30s，56°C 下退火30s，72°C延伸35s)，72°C lOmin。選用β-actin為內參基因，使用Primer 5. O進行引物設計如下(表3):表3.弓I物序列，擴增條帶大小和PCR反應條件
權利要求
1.一種共轉染藥物代謝酶CYP3A4和轉運體MDRl細胞模型，通過以下構建步驟實現(1)將MDCK細胞以IO5/孔種于六孔板，培養48小時，用Lipofectamine 2000試劑將表達載體pcDNA3. I (+) / MDRl轉染MDCK細胞，方法參照轉染試劑說明書，轉染24小時后換液，并加G418進行篩選，以濃度600ug / mL篩選96小時后升至800ug / mL篩選24 小時；(2)將存活的細胞轉移至培養瓶內培養，以600ug/ mL的濃度培養二十天左右，按有限稀釋法接種于96孔板，獲得抗性單克隆，通過在mRNA，蛋白等水平檢測，篩選出活性較高的 MDCK-MDR1 細胞；(3)將MDCK-MDR1細胞以相同的密度種植于6孔板中，當細胞達50-70%匯合時進行轉染，使用Lipofectamine LTX轉染試劑將表達載體pcDNA3. I (+)/Hygro/CYP3A4轉染至 MDCK-MDR1細胞，方法參照轉染試劑說明書，轉染6小時后換含10%FBS的DMEM培養基，培養 24小時后將培養基換成400 ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培養基；(5)隔一天換新鮮的含400 ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培養基，篩選14天左右將存活的細胞按有限稀釋法接種于96孔板，獲得抗性單克隆MDCK-MDR1/CYP3A4細胞，由中國典型培養物保藏中心保藏；地址中國武漢武漢大學；保藏日期2011年12月15日； 培養物名稱犬腎細胞MDCK-MDR1/CYP3A4，保藏編號為CCTCC C2011119。
2.根據權利要求I所述的一種共轉染藥物代謝酶CYP3A4和轉運體MDRl細胞模型，其特征在于，步驟(2)中，在mRNA水平驗證基因轉錄水平，采用的引物序列分別為MDRl 5’ - CCCjKrCATTGCjATATGCAGG-S'5’- GTTCAAACTTCTACTCCTGA-S1β-actin 5'- CCCCTGAATCCCAAAGCC-3'。5’- GATGTCACGCACGATCTCCC-3
3.根據權利要求I所述的一種共轉染藥物代謝酶CYP3A4和轉運體MDRl細胞模型，其特征在于，步驟(3)中，構建表達載體pcDNA3. l(+)/Hygro/CYP3A4中CYP3A4的引物序列為 5’-CGGGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC-3’ ；5’-ATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCC ACTTACGGTGC-3’。
4.根據權利要求I所述的一種共轉染藥物代謝酶CYP3A4和轉運體MDRl細胞模型在 P-gp和CYP3A4共同底物篩選中的應用。
全文摘要
本發明提供一種共轉染CYP3A4和MDR1細胞模型的構建，是先將P-gp的基因克隆到pcDNA3.1(+)上，轉染MDCK細胞，經過G418篩選出單克隆細胞，得到MDCK-MDR1細胞株，然后將CYP3A4克隆到帶有潮霉素B篩選標記的載體pcDNA3.1(+)/Hygro上，轉染MDCK-MDR1細胞，經過潮霉素B篩選，得到共轉染CYP3A4和MDR1細胞。MDCK-MDR1/CYP3A4被中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCC2011119，保藏日期2011年12月15日。本發明構建的模型，可用于模擬藥物載腸道的吸收和代謝過程，進而篩選P-gp和CYP3A4共同底物。
文檔編號C12Q1/02GK102586191SQ201210006590
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者何新, 余露山, 劉瑤, 周慧, 徐思云, 曾蘇, 王鷺, 胡海紅, 蔣惠娣 申請人:浙江大學