專利名稱：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分離的制作方法
5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分離技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種來源于深海海洋微生物基因組的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分離鑒定，其編碼基因?yàn)锳roA，通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法，將該基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，使宿主細(xì)胞獲得耐受草甘膦的能力。本發(fā)明涉及該基因的核苷酸序列和氨基酸序列。技術(shù)背景
N-膦酰甲基甘氨酸，即草甘膦(glyphosate)，是大家熟知的一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型的廣譜滅生性除草劑，具有對人和牲畜低毒，在土壤中殘留量低，使雜草難以產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，基于這些特點(diǎn)，草甘膦在全世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用。
草甘膦能夠抑制植物或微生物體中芳香族氨基酸合成過程中的一種重要的酶的活性，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，這種酶催化莽草酸途徑(shikimatepathway)的倒數(shù)第二步，將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酰基部分轉(zhuǎn)移到莽草酸三磷酸(shikimate-3-phophate)的第5位輕基形成5_烯醇式莽草酸_3_磷酸(EPSP)和無機(jī)磷。由于草甘膦與PEP具有相類似的結(jié)構(gòu)，可形成EPSP合成酶d-P 草甘膦復(fù)合物，阻遏PEP與酶的結(jié)合，阻斷芳香族氨基酸的合成途徑，影響了植物的正常代謝，從而殺死絕大多數(shù)的植物，雜草和農(nóng)作物都不例外。因此，為了能夠在農(nóng)作物生長的過程中選擇性地除去雜草，農(nóng)作物就必需獲得抗草甘膦的能力(Dill 2005 ；Sun, Li et al.2006)。
目前研究的草甘膦抗性基因AroA主要分為兩類(He，Yang et al.2001)。I類AroA基因主要來源于植物或微生物，天然對草甘膦敏感，經(jīng)改造后能夠?qū)σ欢舛鹊牟莞熟a(chǎn)生耐受性，但對底物PEP的親和力會(huì)受到影響；11類AroA基因主要來源于根癌農(nóng)桿菌CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4),枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和假單胞菌屬PG.2982 (Pesudomonas sp.)等，對底物PEP有高親和力，且天然對草甘膦不敏感，這類基因已在生產(chǎn)實(shí)踐中得到應(yīng)用(參見美國專利453590，4769061，5094945)。這兩類基因序列的氨基酸相同性低于30%。
目前，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用的草甘膦抗性基因主要是上述的II類AroA基因，對I類AroA基因的研究相對較少，且目前發(fā)現(xiàn)的I類AroA基因大多天然對草甘膦敏感，此類研究主要選材于陸地微生物，而對草甘膦抗性較高的AroA基因大多被發(fā)掘并申請專利保護(hù)，給我國的實(shí)際應(yīng)用造成很大的局限性。為解決這一局限性，本發(fā)明選取新的菌種資源，即海洋微生物，此類微生物基因組與陸地微生物基因組存在很大的差異，得到AroA基因與其他同類基因存在很大差異。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來自深 海海洋微生物基因組的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分離鑒定，通過遺傳轉(zhuǎn)化方法，將該基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，使宿主細(xì)胞獲得耐受草甘膦的能力。
本發(fā)明分離克隆的草甘膦抗性基因AroA來自于中國國家海洋局第三研究所篩選得到一株天然深海細(xì)菌Janibacter limosus 1C00094(原始菌株1C00094來自中國海洋微生物菌種保藏管理中心，中國國家海洋局第三研究所，福建，廈門，菌株來源地址:WWW.mccc.0rg.cn),該菌株能在含有150mM草甘膦的平板上生長。申請人通過鳥槍法(Osoegawa, Woon et al.1998)構(gòu)建上述細(xì)菌 Janibacter Iimosus 基因組文庫，在含 20mM草甘膦的 M9 培養(yǎng)基(配方=Na2HPO4 6.8g/L，KH2PO4 3.0g/L, NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L,MgSO4 7H20 0.4929g/L，CaCl2 0.lllg/L，葡萄糖 4.0g/L,補(bǔ)充雙蒸水至 1L，滅菌前調(diào) pH至7.4，在115°C下高壓蒸汽滅菌lOmin，備用)上篩得到一株草甘膦抗性菌株，進(jìn)一步提高草甘膦濃度到IOOmM,該菌株仍能生長。測序結(jié)果顯示，本發(fā)明分離克隆的基因?yàn)锳roA基因，申請人將該基因命名為AroAxlim。。將AroApim。基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌AroA基因缺陷型菌株(轉(zhuǎn)化過程參見實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化的步驟)，得到的重組菌株，申請人將高菌株命名為重組大腸桿菌(Escherichia coli)LZD001,該菌株于2011年12月31日送交湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCCN0:M2011493。經(jīng)功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該重組菌株LZDOOl能在含IOOmM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中生長。酶學(xué)測定結(jié)果表明，草甘膦抗性基因AroApim。在pH 8.0時(shí)活性最高，為該基因轉(zhuǎn)入植物中在偏堿性條件下能正常發(fā)揮作用提供了條件。草甘膦抗性基因Ar0^linro對其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的Km值為90.7 PM，對莽草酸-3磷酸(S3P)的Km值為138 PM，對草甘膦的半抑制常數(shù)IC5tl值為3.115mM，最大反應(yīng)速度(Vmax)為0.226mmolmin 1Ing、
將上述草甘膦抗性基因AroAj.lim。重組到pGEX_6P_l質(zhì)粒表達(dá)載體(購自美國GEHealthcare公司)并位于GST標(biāo)簽后，可以在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)(購自Invitrogen公司)中進(jìn)行異源表達(dá)，表達(dá)出的含GST標(biāo)簽的融合蛋白(命名為GST-EPSPS)大小為71.lkDa，去掉GST標(biāo)簽后的目的蛋白(EPSPS)大小為45.1kDa0
本發(fā)明分離克隆的草甘膦抗性基因AroAxlinro的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:I所示。序列分析結(jié)果表明，草甘膦抗性基因AroAxlim。序列全長為1299bp，它編碼432個(gè)氨基酸(編碼區(qū)位序列表SEQ ID NO:1的第l_1296bp)，將其氨基酸序列與GeneBank上各種AroA氨基酸序列比較,結(jié)果顯示，AroAj limo基因序列與從Janibacter spp.HTCC2649菌株(GenBank:EAP99947.1)基因 組序列中預(yù)測到的AroA基因序列的核苷酸序列同源性最高值僅為67% (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)。根據(jù)草甘膦抗性基因AroAxlinro序列的特點(diǎn)申請人將其歸類為I型，是發(fā)現(xiàn)的一種新基因。將該基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌AroA基因缺陷型菌株(轉(zhuǎn)化過程參見實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化的步驟)，得到的重組菌株命名為重組大腸桿菌(Escherichia coli) LZD001，該菌株于2011年12月31日送交湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO:M2011493。


序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明分離的草甘膦抗性基因AroAxlinw的核苷酸序列，序列全長為1299bp,第l-1299bp處為編碼區(qū)。
序列表SEQ ID NO:2是本發(fā)明分離的草甘膦抗性基因AroAxlinw的氨基酸序列，編碼432個(gè)氨基酸。
圖1:本發(fā)明技術(shù)流程圖。
圖2:Janibacter limosus 基因組 DNA 的酶解過程。
圖中 1.Janibacter limosus 基因組 DNA ;2_7.分別為 5min, lOmin, 15min, 20min,25min,30min的酶解產(chǎn)物；8.DNAMarker ；9.酶解后得到的所需要的片段(4_9kb)。
圖3:用大腸桿菌DE3(BL21)表達(dá)的EPSPS蛋白的SDS-PAGE分析。
圖中1.proteins Marker ;2.空載體pGEX_6P_l 未誘導(dǎo)上清；3.空載體pGEX_6P_l誘導(dǎo)上清；
4.pGEX-6p-1-AroAj limo 未誘導(dǎo)上清；5.pGEX-6p-1-AroAj limo 未誘導(dǎo)沉淀；
6.pGEX-6p-1-AroAj limo 誘導(dǎo)上清；7.pGEX-6p-1-AroAj limo 未誘導(dǎo)沉淀。
圖4:從構(gòu)建的基因組文庫篩選得到的含目的基因的陽性重組克隆子:pUCl 18-1nsert fraction 圖譜。
圖5:含 AroAj.limo 基因的重組質(zhì)粒 pGEX_6p-1-AroAj.limo 的圖譜。
圖6:含大腸桿菌AroA基因的重組質(zhì)粒pGEX-6p-l-AroAE。coli的圖譜。
圖7:蛋白質(zhì)濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖8:無機(jī)磷(KH2PO4)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖9:酶反應(yīng)最適溫度測定曲線。
圖10:酶反應(yīng)最適pH測定曲線。
圖11 =Km(PEP)的測定。
圖12:Km (S3P)的測定。
圖13:半抑制劑量IC5tl值的測定。
圖14:生長曲線，即含有AroAxlim。基因的大腸桿菌AroA缺陷型菌株的草甘膦抗性驗(yàn)證。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分離、克隆
(I)基因組文庫的構(gòu)建及測序，獲得抗性基因
從中國國家海洋局第三研究所篩選得到的一株天然深海海洋細(xì)菌中選定原始的對草甘勝抗性為150mM的Janibacter limosus 1C00094菌株(又稱泥兩面神菌1C00094)(原始菌株來自中國海洋微生物菌種保藏管理中心，即中國國家海洋局第三研究所，中國福建廈門，WWW.mccc.0rg.cn),按照以下的步驟和方法構(gòu)建該菌株的基因組文庫:提取深海海洋細(xì)菌Janibacter limosus即泥兩面神菌1C00094菌株基因組DNA (具體方法見后述)，部分酶解(酶切位點(diǎn)為Sau3A I)獲得所需要的片段(4-9kb)，再與pUC118載體(購自寶生物工程大連有限公司，該載體自帶酶切位點(diǎn)BamH I)進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)DH5a高效感受態(tài)細(xì)胞。參見下面的具體過程。
通過加有20mM草甘膦的M9培養(yǎng)基篩選得到能生長的克隆子，送往南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果與NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)比對后得到目的基因AroA的序列,其編碼的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所不。基因組DNA的提取方法:從劃線平板上挑取上述深海海洋細(xì)菌Janibacterlimosus菌株的單菌落，用裝有IOOml 2216液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)深海細(xì)菌Janibacterlimosus (泥兩面神菌1C00094)的專用培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉浸粉lg/L，乙酸鈉 lg/L，硝酸銨 0.2g/L，NaCl 19.45g/L，MgCl2、MgS04、CaCl2 2 3g/L，KCl 0.55g/L,NaHCO3 0.16g/L,補(bǔ)充雙蒸水至1L,滅菌前調(diào)pH至7.6,在121°C下高壓蒸汽滅菌30min,備用)的三角瓶于37°C過夜培養(yǎng)；用2ml離心管收集菌體2次，棄去培養(yǎng)基，加入200 U LlXTE緩沖液(配方:10mM Tris-HCl，lmM乙二胺四乙酸(EDTA)，加雙蒸水至1L，備用)重懸菌體，加入30-50 u L溶菌酶(濃度為50mg/mL)，于37°C放置30min，每隔5分鐘混勻一次。加入300 ii L 裂解液(配方:50mM Tris-HCl，2.5% NaAc，2% 乙二胺四乙酸鈉(EDTA)，30%十二烷基磺酸鈉(SDS)，8%檸檬酸鈉，20%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，補(bǔ)足雙蒸水至1L，備用)，顛倒混勻；加入150 u L5MNaCl，放入70°C水浴鍋，IOmin0然后放入_20°C冰箱，IOmin0加入苯酚、氯仿/異戊醇(體積比為24: I)各350 yL，在渦旋振蕩器上震蕩30s后，離心IOmin后，吸取上清液。加入氯仿/異戊醇(與上清等體積)，混勻后，離心lOmin，充分除去苯酚，吸取上清；加入上述上清2/3體積的異丙醇，混勻后放-20°C冰箱lOmin，后離心lOmin，棄上清。加入濃度為70%的乙醇700iiL，離心7min，棄上清。置于37°C下烘干后，每管加入30 L雙蒸水溶解。
部分酶解:將提取質(zhì)量較好的Janibacter limosus基因組DNA進(jìn)行部分酶解，回收4-9kb大小的片段。所述的酶解體系為30ii L:3ii L 10XHbuffer,luL Sau3A I (稀釋160倍)(購自寶生物工程大連有限公司)，26 y L基因組DNA。先預(yù)酶切:體系加好后每5分鐘取L，加入I ii L loading buffer終止反應(yīng)，依次取樣直到取完。點(diǎn)樣電泳檢測后，確定最佳酶解時(shí)間為25min。再大量酶解:按照預(yù)酶解的最佳時(shí)間，將反應(yīng)體系擴(kuò)大到300 y L，酶解后電泳，回收大小為4-9kb的片段。結(jié)果如圖2所示。
酶連:10iiL 酶連體系含 T4DNA Iigase (購自 Transgene 公司)I ii L ;5XT4DNAligase buffer 2 y L ;酶切后的基因組 DNA 片段 0.3pmol ；pUC118 (BamHI/EcoRI)載體(購自寶生物工程大連有限公司)0.03pmol ;補(bǔ)足雙蒸水至IOii L，于4°C下過夜酶連。
轉(zhuǎn)化:取酶連產(chǎn)物I UL與50 ii L大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a(購自Invitrogen公司)混合，加入到預(yù)冷的Imm電轉(zhuǎn)杯(購自BioRad公司)中，用2.1KV電壓電擊；然后迅速加入600 u L液體LB培養(yǎng)基，于37°C復(fù)蘇40min ;涂布在含有100 U g/mL氨芐青霉素(Ampicillin,購自北京Transgene公司)的LB平板上,37°C過夜。挑取轉(zhuǎn)化子,接種到液體LB培養(yǎng)基于37°C震蕩培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒并進(jìn)行電泳驗(yàn)證。
質(zhì)粒的提取:從劃線平板上挑取單菌落，用裝有5mL含IOOii g/mLAmpicillin的LB液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。用1.5mL離心管收集菌體，12000rpm離心Imin,棄上清,加入200ii L溶液1(配方:50mM葡萄糖,25mM Tris *HC1,補(bǔ)足雙蒸水至1L,調(diào)pH至8.0，備用，IOmM EDAT,調(diào)pH至8.0)重懸菌體；混勻，加入400mL溶液II (配方:0.2MNaOH, I % SDS，加水補(bǔ)足至1L，備用)，輕輕顛倒混勻，放置時(shí)間不超過5min。加入300mL溶液III (配方:3M KAc,用冰乙酸調(diào)至pH4.8,備用)，顛倒混勻。于12000rpm離心IOmin,取上清，加入上清2/3體積的異丙醇，于12000rpm 4°C低溫離心IOmin ;棄上清,沉淀用70%乙醇洗滌后，于12000rpm 4 °C低溫離心lOmin。棄上清，沉淀用30 y L去離子水溶解。取5uL電泳檢測。
序列分析:以pUC118通用引物M13(由南京金斯瑞測序公司提供，正向引物F:5’ TGTAAAACGACGGCCAGT-3’;反向引物 R:5’ CAGGAAACAGCTATGACC-3’ )為測序引物，以重組質(zhì)粒(pUCl 18-1nsert fraction)為模板，由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。
(2) AroAxlim。基因的克隆
根據(jù)測序結(jié)果，經(jīng)NCBI BLAST比對得到AroAxlim。基因的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，在引物5’端添加BamHI酶切位點(diǎn)，在3’端添加酶切位點(diǎn)EcoRI，所述的引物對的DNA序列如下所示:
正向引物(5，-AroAj.limo-BamHI):5，-CGCGGATCCATGACCAGTCCTGATTGGCATGC-3，，下劃線部分為酶切位點(diǎn)；
反向引物(3，-AroAjlinro-EcoRI):5’ -CCGGAATTCTCAGCCCTCCGACGCCTCG-3’,下劃線部分為酶切位點(diǎn)。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
以按上述抽提的上述深海細(xì)菌即泥兩面神菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增EPSPS。PCR反應(yīng)體系如下:
5 X TransStart FastPfu buffer (購自北京 Transgene 公司) IOuL;
dNTP (10ml,購自北京 Transgene 公司)I ii L ;
泥兩名神菌基因組DNAIuL;
正向引物(5，-AroAxlim。-BamHI,IOuM)IuL;
反向引物(3’-AroAxlim。-EcoRI,IOuM)IuL;
TransStartFastPfu DNAPolymerase (購自北京 Transgene 公司)I U L ;
加雙蒸水至50iiL;
PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 2min ;94°C變性 20s，55°C退火 20s，72°C延伸 50s ;30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min,4°C保存5min結(jié)束。
酶解PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pGEX-6p_l構(gòu)建:將獲得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI/EcoRI (購自寶生物工程大連有限公司)，酶解體系:100 y L中含82 y L PCR產(chǎn)物或PGEX-6P-1質(zhì)粒(生物學(xué)試驗(yàn)中常用的質(zhì)粒,本發(fā)明購自美國GE Healthcare公司，該質(zhì)粒提取方法同實(shí)施例1) ；10u L IOXH Buffer ； 4u L BamHI ；4u L EcoRI ;于371:放置過夜。重組質(zhì)粒pGEX-ep-l-AroAph。的具體構(gòu)建過程如圖1所示,構(gòu)建好的重組質(zhì)粒如圖5所示。
酶切產(chǎn)物的回收使用膠回收試劑盒(購自AxyGen公司)，按照該試劑盒的說明書回收電泳產(chǎn)物。具體過程是:在紫外燈下將目的條帶切下后置于1.5mL的離心管中，每IOOmg加入300 ii L的DE-A緩沖液(該試劑盒自帶)，于70°C水浴鍋溫浴lOmin，直到凝膠全部融化。再加入1/2 倍DE-A緩沖液(該試劑盒自帶)體積的DE-B緩沖液(該試劑盒自帶)，將溶膠液加入到2mL吸附管12000rpm，4°C離心lmin，加入500uLWl緩沖液(該試劑盒自帶)離心洗脫lmin,再加入700uLW2緩沖液(該試劑盒自帶)離心洗脫lmin,將緩沖液棄去后再離心Imin盡可能除去乙醇，加入50ii L雙蒸水洗脫收集DNA。電泳結(jié)果如圖2所/Jn o
克隆酶連:IOii L連接體系中含有:
經(jīng)上述過程構(gòu)建好的含BamHI/EcoRI雙酶切位點(diǎn)的pGEX_6P_l質(zhì)粒載體0.03nmol ;經(jīng) BamHI/EcoRI 雙酶切的目的基因 0.2InmoI ;T4DNAligase (購自 Transgene 公司)liiL ;5XT4DNAligase buffer 2yL;加雙蒸水補(bǔ)至 10 y L，于 4°C 酶連過夜。
將AroA1.limo基因(其核苷酸序列見SEQ ID NO:1所示)插入到pGEX-6P_l載體，將驗(yàn)證正確的陽性克隆子提取重組質(zhì)粒，命名為pGEX-6p-l-AroAnim。，其大小為6280bp (見圖5)。
實(shí)施例2 EPSPS蛋白的表達(dá)、純化與分析
(I)目的蛋白EPSPS的表達(dá)
將重組質(zhì)粒pGEX-ep-l-AroAi；^。轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)。驗(yàn)證陽性克隆，將鑒定正確的陽性克隆子過夜活化，以體積比I %的接種量轉(zhuǎn)接至IL含100 ii g/mLAmpicillin的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)2_3h，直至OD6tltl達(dá)到0.6左右，加入誘導(dǎo)劑異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)終濃度至0.5mM,于22°C，180rpm下培養(yǎng)25h。離心收集菌體,然后用Hepes緩沖液(配方:50mM 4_輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes),2mM 二硫蘇糖醇(DTT)，調(diào)pH至7.0，補(bǔ)足雙蒸水至1L，備用)將菌體洗滌一遍，再用50mLHepes緩沖液懸浮后用高壓細(xì)胞破碎儀(購自GEANiro Soari公司型號(hào):NS10012K)破碎細(xì)胞。將細(xì)胞破碎液于4°C、12000rpm下離心30min，收集上清。用SDS-PAGE法檢測獲得的上清是否含有目的蛋白。
SDS-PAGE 配方如下:
濃縮膠(5%聚丙烯酰胺)，配方如下:
H2O1.4mL ；
30% Acr-Bis (29: I) 0.33mL ；
IM Tris-HCl, pH6.8 0.02mL ；
10% SDS0.02mL ；
10% 過硫酸銨0.02mL;
四甲基乙二銨(TEMED)0.002mL。
分離膠(12%聚丙烯酰胺)，配方如下:
H2O2.45mL ；
30% Acr-Bis (29: I)3mL ；
IM Tris-HCl, pH8.82.5mL ；
10% SDS0.075mL ；
10% 過硫酸銨0.075mL;
四甲基乙二銨(TEMED)0.003mL。
取80iiL細(xì)胞破碎液，加20iiL5X蛋白上樣緩沖液(6mL lmol/L Tris-HCl,pH8.8), 20mL10 % SDS, 50mL50 % 甘油，5mL P -巰基乙醇，ImLl %溴酌 藍(lán)，加雙蒸水至IOOmL,備用)，沸水浴5min，然后點(diǎn)樣10 y L電泳檢測，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果見圖3。圖3表明，目的蛋白EPSPS在大腸桿菌中得到正確表達(dá)，含GST標(biāo)簽和目的蛋白的融合蛋白，申請人將此融合蛋白命名為GST-EPSPS，其大小約為71.lkDa，去掉GST標(biāo)簽后的目的蛋白EPSPS為45.lkDa，符合預(yù)測結(jié)果。
(2)目的蛋白EPSPS的純化
本發(fā)明利用還原型谷胱甘肽(GST)親和純化系統(tǒng)純化重組蛋白(Nilsson，Stahl et al.1997)，具體操作步驟(所有操作均在4°C下進(jìn)行)如下:取2ml柱材料GSHSepharose 4B (購自Amersham-Pharmacia公司)于層析柱中，用50mL Hepes緩沖液洗脫平衡；將細(xì)胞破碎液的上清以1.0ml/min的流速過柱；用300mLHepes緩沖液洗脫沒有結(jié)合的雜蛋白，流速控制在1.0mL/min以下。再取IOy L濃度為10unit/iiL的3C蛋白酶(購自Merck公司)與ImL Hepes緩沖液混勻,加入層析柱混勻后放4°C酶解12小時(shí)。收集上一步驟中經(jīng)酶解后含目的蛋白EPSPS的Hepes緩沖液至1.5ml的離心管中，再加等體積的甘油混合后分裝，置于-80°C保存(Rippert and Matringe 2002)。
(3)目的蛋白EPSPS的濃度定量測定
采用定量Bradford法(Bradford 1976)測定純化的目的蛋白EPSPS的濃度。具體步驟如下:用Bradford蛋白定量試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)測定目的蛋白EPSPS的濃度，按照試劑盒的說明書操作。具體步驟為:取20 u Llmg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品牛血清蛋白(購自上海生工生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司)加Ifepes緩沖液稀釋至lOOyL，使終濃度為0.2mg/mL。取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，6，8，10，15 y L分別加到96孔板中，力口Hepes緩沖液補(bǔ)足到20 u L，每孔蛋白含量分別為0.0,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6, 2.0mg/mL。每組設(shè)計(jì)3個(gè)平行試驗(yàn)。每孔加入200 V- L Bradford Reagent (Bradford蛋白定量試劑盒自帶)，混勻，室溫放置5min后用預(yù)熱的酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司)測定0D595值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如圖7所示的蛋白質(zhì)濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的蛋白濃度。
(4)目的蛋白EPSPS的活性測定
目的蛋白EPSPS活性測定參照文獻(xiàn)(Lanzetta, Alvarez et al.1979)報(bào)道的無機(jī)磷的測定方法。具體步驟如下:
無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:配制IOmM的無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(稱取0.2282gK2HPO4 *3H20,用Ifepes緩沖液溶解定容至IOOmL)，取30mL標(biāo)準(zhǔn)溶液用Ifepes緩沖液稀釋10倍，分別取0、5、10、20、30、40 (ii L)于I 5mL離心管中，每管無機(jī)磷濃度分別為0、0.1、0.2、0.4,0.8mM ;分別加入適量Ifepes緩沖液補(bǔ)足至50 y L，于28V反應(yīng)3min后加入0.8mL MAT溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用:0.045%孔雀石綠75mL，4.2%鑰酸銨用IOmL濃鹽酸溶解后定容至25mL，混合后過濾，加入200 ii L Tritonx-100,備用)，室溫放置lmin后加入0.1mL 34%朽1檬酸鈉溶液，放置30min后取200 ii L于96孔板中測定OD66tl值。設(shè)計(jì)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(Jin，Lu etal.2007) 0以無機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D66tl為縱坐標(biāo)作圖得到無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(見圖8)。
最適溫度測定:反應(yīng)體系同上述pH測定體系。體系加好后于不同溫度(0、10、20、30、40、50、60°C)下反應(yīng)3min，加入0.8mL MAT溶液，lmin后加入0.lmL34%檸檬酸鈉溶液，室溫放置30min后，取200 ii L于96孔板中，用預(yù)熱的酶標(biāo)儀測定OD66tl值(對照組不加莽草酸三磷酸(S3P)，設(shè)計(jì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組)。以溫度為橫坐標(biāo)，以相對活性為縱坐標(biāo)作圖，得到如圖9所示的最適溫度測定曲 線。
最適pH測定:50 V- L反應(yīng)體系:lmM莽草酸三磷酸，ImM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),加入IuL純化的EPSPS蛋白，加不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、ll) W Hepes緩沖液補(bǔ)足到50 u L0 28°C反應(yīng)4min，加入800iiLMAT溶液，Imin后加入100iiL34%檸檬酸鈉(SC)溶液，室溫放置30min后，取200 ii L于96孔板中，用預(yù)熱的酶標(biāo)儀測定OD66tl值。對照組不加莽草酸三磷酸，設(shè)計(jì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。以pH值為橫坐標(biāo)，以相對活性為縱坐標(biāo)作圖，得到如圖10所示的最適PH測定曲線。
Km(PEP)測定:將體系中莽草酸三磷酸(S3P)的濃度固定為ImM，在不同PEP濃度(0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mM)下按上述50 y L反應(yīng)體系測定酶反應(yīng)速度(Sun,Chen et al.2005)，以PEP濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速度V(U/mg)為縱坐標(biāo)作圖，得到如圖11所示的Km(PEP)的測定結(jié)果。
Km(S3P)測定:將體系中磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的濃度固定為ImM，在不同莽草酸三磷酸(S3P)濃度(0,0.02,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8、1.0mM)下按上述50 y L反應(yīng)體系測定酶反應(yīng)速度，以S3P濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速度V (U/mg)為縱坐標(biāo)作圖，得到如圖12所示的Km(S3P)的測定結(jié)果。
半抑制劑量(IC5tl)測定:在上述反應(yīng)體系中添加不同濃度(10_5、10_4、10_3、10_2、10' 10°、101、100、IOOOmM)的草甘膦，所得數(shù)據(jù)以草甘膦濃度為橫坐標(biāo)，采用對數(shù)坐標(biāo)，以反應(yīng)速度V(U/mg)為縱坐標(biāo)作圖，得到如圖13所示的半抑制劑量IC5tl值的測定結(jié)果。
實(shí)施例3:遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(功能互補(bǔ)驗(yàn)證)
將重組質(zhì)粒pGEX-6p-l-Ar0AT.lim。轉(zhuǎn)化到AroA基因缺陷型大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化過程參見上述實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化過程。該菌株不含AroA基因，能夠排除一般大腸桿菌中帶有的AroA基因的干擾)(Vaithanomsat and Brown 2007),分別轉(zhuǎn)接到含0mM、50mM、IOOmM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中，測定生長曲線。
(I)設(shè)定對照
引物的設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GENEBANK公布的大腸桿菌E.coli K_12 AroA基因(命名為AroAE.Mli)核苷酸序列(登錄號(hào):NP_415428.1)，設(shè)計(jì)合成如下引物對:
正向引物(5，-AroAE.col1-BamHI):
5，-CGCGGATCCATGGAATCCCTGACGTTACAACCCATCGCTCGTG-3 ’，下劃線部分為 BamHI酶切位點(diǎn)；
反向引物(3’-AroAE.col1-XhoI):
5’ -CCGCTCGAGTCAGGCTGCCTGGCTAATCCGCGCCAGCT-3’，下劃線部分為 XhoI 酶切位點(diǎn)。該引物對由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
構(gòu)建pGEX-6p-l-AroAE.coli重組質(zhì)粒，具體步驟和構(gòu)建方法同上述實(shí)施例2中pGEX-6p-l-AroAj limo重組質(zhì)粒的構(gòu)建，pGEX-6p-1-AroAe coli重組質(zhì)粒圖譜如圖6所示。
(2)生長曲線的測定
將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-AroA1.limo和pGEX-6p-l-AroAE.coli分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌AroA缺陷型菌株AB2829，將轉(zhuǎn)化子分別接種到含有含0mM、50mM、IOOmM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中(含100 ii g/mL Ampicillin)，于37°C震蕩培養(yǎng)40h。每組設(shè)計(jì)三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每IOh取200 ii L培養(yǎng)液測定細(xì)胞濃度，即OD6tltl值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D6tltl值為縱坐標(biāo)作圖，得到的生長曲線如圖14所示。
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權(quán)利要求
1.一種5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。
2.—種5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因，其編碼的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ IDNO:2所述。
3.一株包含表達(dá)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌LZD001，保藏在中國典型 培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2011493。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗草甘膦基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分離鑒定，所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所述。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因是從深海細(xì)菌Janibacter limosus菌株的基因組文庫中克隆得到，包含該基因質(zhì)粒的重組大腸桿菌LZD001保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NOM2011493。經(jīng)過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明該基因?qū)Σ莞熟⒕哂幸欢ǖ哪褪苄浴?br> 文檔編號(hào)C12N9/12GK103194465SQ20121000689
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者劉子鐸, 趙艷, 林擁軍, 邵宗澤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)