專利名稱：一種蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和現(xiàn)代酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)自蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)的普魯蘭酶基因，該基因表達(dá)的海藻糖合成酶可以用于淀粉制糖中提高淀粉原料的利用率，從而提高生產(chǎn)效率。
背景技術(shù)：
淀粉是一種天然高分子化合物，也是一種重要的工業(yè)原料，廣泛存在于植物的根、 莖或種子中。天然的淀粉主要由直鏈淀粉與支鏈淀粉組成，直鏈淀粉所占比例較少，約為 20%，大部分為支鏈淀粉，約為80%。從結(jié)構(gòu)上來(lái)講，支鏈淀粉是一個(gè)具有樹枝形分支結(jié)構(gòu)的葡聚糖，一般由1000-300,000個(gè)葡萄糖單位連接而成，分子量約為100萬(wàn)，有些可達(dá)600 萬(wàn)。支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)為高支化聚合物，葡萄糖單位通過α-1，4-糖苷鍵連接成一直鏈，在直鏈上又可通過α_1，6-糖苷鍵形成側(cè)鏈，在側(cè)鏈上又會(huì)出現(xiàn)另一個(gè)分支側(cè)鏈。主鏈中每隔6-9個(gè)葡萄糖單位就有一個(gè)分支，每一個(gè)支鏈平均含有約15-18個(gè)葡萄糖殘基，平均每 24-30個(gè)葡萄糖殘基中就有一個(gè)非還原尾基。工業(yè)上應(yīng)用的大部分淀粉質(zhì)原料中支鏈淀粉占總淀粉質(zhì)量約為70以上，最常用的玉米淀粉中占74%，馬鈴薯淀粉中占76 %，木薯淀粉 83%，而糯米淀粉的支鏈淀粉含量最高達(dá)100%。支鏈淀粉中約含有4 5%的α-1，6-糖苷鍵，淀粉加工領(lǐng)域的α-淀粉酶和β-淀粉酶和糖化酶等葡萄糖淀粉酶對(duì)α-1，4糖苷鍵的分解非常容易，但對(duì)于α-1，6糖苷鍵的分解很慢，所以α-1，6-糖苷鍵的存在阻礙淀粉的分解，影響到淀粉的利用率和產(chǎn)品的質(zhì)量，因此在淀粉加工過程都需要添加脫支酶來(lái)加快的淀粉的水解速度和提高淀粉的利用率。普魯蘭酶(Pullulanase，EC 3. 2. 1. 41)是一種脫支酶，它能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1，6_糖苷鍵，形成α _1，4糖苷鍵的直鏈淀粉，在以淀粉為原料的制糖加工業(yè)中，可以顯著提高淀粉原料的利用率，降低生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)品質(zhì)量。在淀粉水解過程中，利用普魯蘭酶與α -淀粉酶、糖化酶配合使用，將淀粉徹底降解為葡萄糖對(duì)生產(chǎn)高質(zhì)量的葡萄糖特別是醫(yī)用葡萄糖時(shí)特別重要。在生產(chǎn)麥芽糖生產(chǎn)中用普魯蘭酶將支鏈淀粉脫支而形成短的直鏈淀粉片段，有利于淀粉酶的作用，減少極限糊精的形成，從而提高麥芽糖的含量，所以普魯蘭酶在生產(chǎn)含量在70%的以上的超高麥芽糖漿中極為重要。1961 年 Bender 禾口 Wallenfels 通過產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter. aerogenes)發(fā)酵獲得普魯蘭酶以后，各國(guó)的科研人員經(jīng)過廣泛深入研究，從不同的地區(qū)、微生物中獲得該酶， 掀起了開發(fā)普魯蘭酶的高潮。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)普魯蘭酶的研究主要集中在耐酸耐熱高產(chǎn)菌株的篩選及基因的克隆與表達(dá)。國(guó)內(nèi)食品工業(yè)上所用的普魯蘭酶均是從丹麥NOVO進(jìn)口普魯蘭酶的來(lái)源有很多種，包括產(chǎn)氣氣桿菌、放線菌、酸假孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、棲熱水生菌等。但是這些來(lái)源的普魯蘭酶其酶學(xué)性質(zhì)與淀粉工業(yè)耐酸(PH4.6)、耐熱(75°C)的要求相差較大，因此，目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)普魯蘭酶研究工作主要集中在通過各種方法獲得優(yōu)良普魯蘭酶產(chǎn)生菌種上，而短小芽孢桿菌正是研究的熱點(diǎn)之一。其中來(lái)源于Brevibacillus brevis禾口 Bacillusderamificans的普魯蘭醇己經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。B. brevis普魯蘭酶由經(jīng)過遺傳改良的B. brevis直接發(fā)酵生產(chǎn)；B. deramificans的普魯蘭酶則使用地衣芽胞桿菌重組菌進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)水平在100單位/mL發(fā)酵液 400單位/mL 發(fā)酵液不等。目前國(guó)際上普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)被丹麥壟斷，我國(guó)僅局限于實(shí)驗(yàn)室研究，且酶活較低，所以開發(fā)普魯蘭酶對(duì)食品加工領(lǐng)域具有重要的工業(yè)價(jià)值。通過檢索，還查到有關(guān)普魯蘭酶的一些科技文獻(xiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)201010256287. 6 公開了一種來(lái)源于芽孢桿菌的胞外普魯蘭酶編碼基因及其應(yīng)用，篩選到一株具有普魯蘭分解能力的芽孢桿菌Bacillus sp.042，利用反向PCR技術(shù)克隆了普魯蘭酶編碼基因pulA042 編碼區(qū)完整序列，序列分析顯示該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)2571堿基，編碼一 856個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，多肽鏈N端32個(gè)氨基酸殘基組成一典型的信號(hào)肽，因此基因pulA042編碼一種胞外普魯蘭酶。Bacillus sp. 042普魯蘭酶基因pulA042的表達(dá)產(chǎn)物具有分解普魯蘭和紅色普魯蘭的活性，能降解淀粉中α-1，6糖苷鍵，不降解α_1，4糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶。 利用基因PU1A042生產(chǎn)的重組酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中α_1，6糖苷鍵。中國(guó)專利申請(qǐng)200510048613. 3公開了一種普魯蘭酶產(chǎn)生菌及制備方法。菌種分類命名為脂環(huán)酸芽孢桿菌Alieycloeacillus，其保藏登記號(hào)為CGMCCNo. 1504。分離得到的菌株D-1，經(jīng)鑒定為脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，其所產(chǎn)普魯蘭酶在pH3. 5-4. 5之間， 極為穩(wěn)定，當(dāng)PH高于5. 0和低于3. 0，酶活開始迅速失活。當(dāng)pH4. 0時(shí)，酶液在60°C放置 Mhr后，殘余酶活力為88%，最適溫度為60°C，在溫度55°C _65°C的范圍內(nèi)，酶活性變化不大，酶反應(yīng)不需要金屬離子的參與，說(shuō)明此酶適合應(yīng)用于淀粉加工的糖化階段。相比較而言，比已報(bào)道的酸性普魯蘭酶有更好的耐熱特性和PH穩(wěn)定性。中國(guó)專利申請(qǐng)201010101281. 1公開了一種普魯蘭酶及其生產(chǎn)方法。屬于作用在 α-1，6-糖苷鍵上的淀粉水解酶。a.酶學(xué)特性最適pH 3. 8 4.4，穩(wěn)定pH 3. 5 4. 5 ；最適作用溫度為50°C-65°C ;b.選用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為產(chǎn)酶菌種， 來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC編號(hào)1018 ，采用底料與補(bǔ)料復(fù)合加料方式，液態(tài)發(fā)酵工藝制備，達(dá)到如下工藝技術(shù)指標(biāo)①產(chǎn)品酶活力llOOu/ml，②發(fā)酵周期 72-80小時(shí)，③液體酶回收率>86.5%。提供了一種耐熱、耐酸性能好，酶活力高、性能穩(wěn)定而且價(jià)格較低的普魯蘭酶產(chǎn)品，及其發(fā)酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的液態(tài)生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。適用于以淀粉為原料的發(fā)酵工業(yè)以及改性淀粉產(chǎn)品、直鏈淀粉、高直鏈淀粉制造。這些專利公主要是產(chǎn)普魯蘭酶微生物的篩選和鑒定，雖然也給出了一些通過微生物分離及克隆普魯蘭酶基因的方法，但這普魯蘭酶基因的菌種來(lái)源不同，DNA序列和氨基酸序列相差甚遠(yuǎn)，酶的分子量不同，酶學(xué)特性和活力都有很大的差異，且都沒有得到絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的基因和相關(guān)專利，也沒有應(yīng)用于工業(yè)的報(bào)道，酶學(xué)特性不同最適合的應(yīng)用的領(lǐng)域也不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶基因及其應(yīng)用，它能夠提高淀粉糖化中的麥芽糖含量，提高淀粉的水解率，從而提高淀粉的利用率。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明從蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌屬克隆到一個(gè)新的普魯蘭酶基因， 不僅來(lái)源不同，基因DNA序列不同，表達(dá)的普魯蘭酶氨基酸序列不同，酶學(xué)特性也不同。
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本發(fā)明人利用生物信息手段對(duì)GenBank中龐大的DNA序列和氨基酸序列資源進(jìn)行同源性檢索分析，對(duì)已經(jīng)完成序列分析的上千種微生物的DNA序列進(jìn)行大量核酸序列進(jìn)行分析和對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank中注釋為“未知蛋白”或“推測(cè)是某功能蛋白質(zhì)”的極為有用基因，推測(cè)該序列的功能，然后找到候選基因序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的功能鑒定，最終確定基因的功能和性質(zhì)，其中包括至今為止人們并未發(fā)現(xiàn)的魯蘭酶，并用這種魯蘭酶基因經(jīng)過克隆和進(jìn)行重組表達(dá)，重組表達(dá)的魯蘭酶可用于淀粉生產(chǎn)。本發(fā)明人在分析不同來(lái)源普魯蘭酶基因的同源性過程中，對(duì)蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)菌屬基因組序列進(jìn)行同源檢索分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)ID號(hào)為GI :225785631這一段DNA序列尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其功能的，這段DNA序列在Genbank中被注釋為“假定的普魯蘭酶基因”(putative pullulanase)。經(jīng)過分析這段DNA序列與已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道的糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有較高的同源性，同源性達(dá)到70%以上，所以很難通過序列同源性分析來(lái)確定這段序列是哪一種酶，必須要經(jīng)過具體實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定這段基因的功能，確認(rèn)其是什么酶，目前也還沒有該基因功能的實(shí)驗(yàn)鑒定相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明所述的普魯蘭酶基因克隆自蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌，菌種可以從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買，菌種編號(hào)為10184，也可以通過野外采集和其他途徑獲得。普魯蘭酶的分子量和酶學(xué)特點(diǎn)具有多樣性，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的優(yōu)勢(shì)1、與目前已經(jīng)商品化的普魯蘭酶是屬于酸性普魯蘭酶(最適反應(yīng)pH在4. 0 5. 0)相比，本發(fā)明的普魯蘭酶是一種中性的普魯蘭酶，其最適反應(yīng)pH在6. 0 7. 5，這與目前主要商品化的α-淀粉酶和β-淀粉酶的最適反應(yīng)pH的6.0 7和很相近，所以特別適合用于配合α-淀粉酶和β-淀粉酶生產(chǎn)麥芽糖，提高麥芽糖和含量淀粉的水解率，在生產(chǎn)工藝中可以是三種酶同時(shí)保持最適的反應(yīng)PH條件，可以減少PH的調(diào)節(jié)，減少酸堿的使用， 從而有利于簡(jiǎn)化工藝和降低生產(chǎn)成本。2、與中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01010256287. 6的856個(gè)氨基酸相比，本發(fā)明只有822個(gè)氨
基酸，分子量更小更有利重組表達(dá)生產(chǎn)重組的普魯蘭酶。


圖1是不同溫度對(duì)本發(fā)明所述蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶活力的影響曲線圖。圖2是不同pH對(duì)本發(fā)明所述蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶活力的影響曲線圖。圖3是Ca2+對(duì)本發(fā)明所述蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶熱穩(wěn)定性的影響曲線圖。圖4是本發(fā)明所述蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶對(duì)不同底物的活力分析曲線圖。圖5是的金屬離子對(duì)本發(fā)明所述蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶活性的影響曲線圖。圖6是本發(fā)明所述蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶對(duì)淀粉的水解糖化影響曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)和實(shí)例，下述實(shí)驗(yàn)和實(shí)例所述內(nèi)容屬于本發(fā)明的主要內(nèi)容， 但并不僅僅限于這些內(nèi)容。有些可以顯而易見地?cái)U(kuò)展的內(nèi)容雖然并未在本發(fā)明說(shuō)明書中出現(xiàn)，但也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利請(qǐng)求范圍。
實(shí)施例11.蠟樣芽孢桿菌的培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)接種于以下培養(yǎng)基(克/升)胰化蛋白胨10 克，酵母提取物5克，NaCllO克，然后在30°C恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)過夜小時(shí)，用于總DNA的提取。2.蠟樣芽孢桿菌基因的克隆和序列分析根據(jù)Genbank中ID號(hào)為GI :225785631為假定普魯蘭酶基因的DNA序列，命名 Pulbc，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，擴(kuò)增其成熟肽序列并連接到表達(dá)載體上導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)， 設(shè)計(jì)引物如下上游引物5-CTACCATGGATGTTTCAAATTCGAAAACAAC-3下游引物5-CTACAATTGTTATTTAATCGGTTTCTCTG-3上下游引物分別設(shè)計(jì)了 Nco 1和Mim 1位點(diǎn)用于連接到表達(dá)載體上，擴(kuò)增產(chǎn)物利用Nco 1和Mun 1進(jìn)行雙酶切，然后與同樣利用Nco 1和Mun 1進(jìn)行雙酶切的表達(dá)載體PSE380進(jìn)行連接，然后經(jīng)過篩選驗(yàn)證得到重組質(zhì)粒pSE380-Pulbc。把重組載體重組質(zhì)粒pSE380-Pulbc轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)中，選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到LB培養(yǎng)基， 37°C,180r/min搖床培養(yǎng)過夜，再以2%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，搖床培養(yǎng)至0D600為0. 4-0. 6，加入適量的IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，20°C培養(yǎng)18 小時(shí)后，離心收集菌體，經(jīng)緩沖液洗滌，再利用破胞緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波進(jìn)行破胞，破胞至菌液澄清，12000r/min離心15分鐘離心收集上清，所收集的上清即為粗酶液，可用于酶學(xué)性質(zhì)分析的實(shí)驗(yàn)。3.蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶活力的測(cè)定取(w/v)普魯蘭糖500 μ L加入1.5mL離心管管中，加入50 μ L稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液；而空白對(duì)照管中加入50 μ L已失活的酶，最適溫度反應(yīng)30min，加入450 μ L DNS以終止酶反應(yīng)，然后沸水浴5min，置冰上冷卻后，在540nm處測(cè)OD值。酶活力單位定義在最適溫度、最適PH條件下，每分鐘分解普魯蘭糖所釋放的還原糖，其還原力相當(dāng)于1 μ mol葡萄糖所需的酶量，以IU表示。4.蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶的最適反應(yīng)溫度以普魯蘭為底物，pH7. 0的條件下，在30°C到70°C之間每隔5°C測(cè)定酶活，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明重組的普魯蘭酶對(duì)普魯蘭糖的最適溫度為50°C，在45-55°C能保持80% 的活力。5.蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶的最適反應(yīng)pH以不同pH緩沖液配制的普魯蘭為底物，在50°C條件下測(cè)定普酶活力。不同pH對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖2所示，表明酶的最適反應(yīng)pH在6. 0 7. 5。6.蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶熱穩(wěn)定性及Ca2+對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響把酶液和添加2mM Ca2+的酶液分別在45 V，50°C，55°C和60 V水浴處理20分鐘后再分別測(cè)酶活力。Ca2+對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明添加Ca2+的酶熱穩(wěn)定性明顯比不添加Ca2+的高，在50°C保溫20分鐘的條件下，不添加Ca2+的酶活力只剩余12%，而添加Ca2+的酶剩余活力達(dá)到83%。7.蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶最適底物的分析通過以不同底物在相同的條件下反應(yīng)，然后測(cè)定還原糖的量，從而測(cè)定該酶水解不同底物的相對(duì)速度。測(cè)定結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)該酶不能水解糊化可溶性淀粉，而且也不能水解環(huán)糊精和β-環(huán)糊精，表明該酶屬于I型普魯蘭酶。水解普魯蘭糖，糊精，糊化玉米淀粉，馬鈴薯淀粉和糯米淀粉的相對(duì)速度為100 2.7 11.4 9.6 14，表明該酶和上述底物的親和力大小依次是普魯蘭糖>糯米淀粉>玉米淀粉>馬鈴薯淀粉和糊精。8.金屬離子對(duì)蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶活性的影響在反應(yīng)緩沖液中添加金屬終濃度為2. 0mM/L，4°C保溫0. 5h后，測(cè)殘余酶相對(duì)活力，以添加金屬離子的酶活力為對(duì)照，對(duì)照活力為100，結(jié)果如圖5所示，表明金屬離子Cu2+、 Zn2\ 1 3+對(duì)酶活有顯著抑制作用，其中狗3+的抑制作用最大，4°C保溫0. 5h后剩余酶活力幾乎為零。Ba2+、SDS、EDTA對(duì)酶活有微弱的抑制作用，而其他K+、Ni+對(duì)酶活有微弱的激活作用，而其他一些離子如Mg2+、Ca2+、Mn2+則對(duì)酶活有顯著的激活作用，可以提高酶的活力約 40%。8.蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶對(duì)淀粉糖化的作用液化將淀粉加水調(diào)成30%的淀粉乳，調(diào)節(jié)pH值到7. 0，加入α -淀粉酶保持溫度 90°C，液化至達(dá)到碘色后，再保溫0. 5小時(shí)至DE值為15 20%，然后立即冷卻并加入鹽酸降低pH到6. 0。糖化分別取上面液化好的淀粉IL加到兩個(gè)反應(yīng)瓶中，分別加入適量的糖化酶， 其中一個(gè)反應(yīng)瓶加入適量的制備好的普魯蘭酶，另外一個(gè)反應(yīng)不加普魯蘭酶用于作對(duì)照比較加普魯蘭酶對(duì)淀粉的水解糖化的影響。在50°C保溫72個(gè)小時(shí)，糖化過程每隔10個(gè)小時(shí)取樣，用HPLC分析酶水解淀粉產(chǎn)物葡萄糖的含量。HPLC分析條件，色譜柱Alltima Amino 100A 5u柱(4. 6mmX250mm)；檢測(cè)器=Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；流動(dòng)相75% 乙腈 25% H20 ；流速:lmL/min，柱溫:35°C。魯蘭酶對(duì)淀粉的水解糖化的影響結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明添加了普魯蘭酶的淀粉的水解的葡萄糖得率為97. 2%，明顯高于不加普魯蘭酶的95. 3%，而且水解速度也較快，添加普魯蘭酶淀粉水解50個(gè)小時(shí)，葡萄糖的含量就達(dá)到了最大值，而不加普魯蘭酶需要在70個(gè)小時(shí)后，葡萄糖的含量才達(dá)到了最大值。可見蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶可以提高淀粉糖化的葡萄糖得率，同時(shí)也可以提高糖化的速度。8.蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶對(duì)提高淀粉糖化中麥芽糖含量的作用液化將淀粉加水調(diào)成30%的淀粉乳，調(diào)節(jié)pH值到7. 0，加入α -淀粉酶保持溫度 90°C，液化至達(dá)到碘色后，再保溫0. 5 1小時(shí)至DE值為10 12%，然后立即冷卻并加入鹽酸降低PH到6.0。糖化分別取上面液化好的淀粉IL加到兩個(gè)反應(yīng)瓶中，再分別加入適量的β-淀粉酶，其中一個(gè)反應(yīng)瓶再加入適量的制備好的普魯蘭酶，另外一個(gè)反應(yīng)不加普魯蘭酶用于作對(duì)照比較加普魯蘭酶對(duì)淀粉的水解糖化的影響。在50°C保溫36個(gè)小時(shí)后測(cè)定糖化產(chǎn)物的麥芽糖含量，結(jié)果見表1，結(jié)果表明添加普魯蘭酶可以提高淀粉糖化中的麥芽糖含量，適合配合β -淀粉酶用于生產(chǎn)麥芽糖，而且添加普魯蘭酶也可以提高淀粉的水解率，從而提高淀粉的利用率。
表1.魯蘭酶對(duì)提高淀粉糖化中麥芽糖含量的作用
權(quán)利要求
1.一種蠟樣芽孢桿菌的普魯蘭酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ ID NO 1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因所編碼的普魯蘭酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.權(quán)利要求2所述的普魯蘭酶在水解淀粉中生產(chǎn)葡萄糖的應(yīng)用。
全文摘要
一種來(lái)源于蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌普魯蘭酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，該基因編碼一種普魯蘭酶，該酶的氨基酸序列為SEQ ID NO2，該普魯蘭酶能水解淀粉中的α-1，6-糖苷鍵，不水解α-1，4-糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶，利用該基因生產(chǎn)的重組普魯蘭酶可以應(yīng)用于淀粉加工中水解淀粉或者糊精中的α-1，6-糖苷鍵以提高淀粉的利用率，該普魯蘭酶是一種中性的普魯蘭酶適合用于配合α-淀粉酶和β-淀粉酶生產(chǎn)麥芽糖，提高麥芽糖和含量淀粉的水解率。
文檔編號(hào)C12R1/085GK102533818SQ20121000869
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者吳磊, 李美容, 杜麗琴, 韋宇拓, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)