專利名稱：適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體
培養基。
背景技術：
近年來，隨著惡性腫瘤、艾滋病、自身免疫病等發病率的增多，導管插管和器官移植等技術的開展，廣譜抗生素、皮質激素和免疫抑制劑的廣泛使用，真菌感染的發病率急劇上升(Georgopapadakou 肌 Antifungals :mechanism of action and resistance， established and novel drugs [J]. Current Opinion in Microbiology,1998,1 (5) M7-557.)，特別是呼吸機與大量生物材料的應用，使得生物膜(biofilm，BF)相關性真菌的感染發生率不斷增加。生物膜是微生物生活的普遍形態。生物膜(bioflim，BF)是一種附著于組織或生物材料表面，由其自身產生的胞外基質(extracellular maxtrix)包裹的有結構的一種或多種菌細胞群體。Bill Costerton經過30年的研究發現，生物膜是微生物(細菌和真菌)生存的普遍形式 CTom Coenye, Hans J. Nelis In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of Microbiological Methods 2010,83:89-105)。BF可以由一種菌形成，也可由多種微生物混合生長形成。人體內存在多種BF混合感染的情況，白色念珠菌和葡萄球菌是常見的混合感染分離菌。念珠菌是人體內常見的共生菌，根據美國院內感染控制組織的資料，白色念珠菌是第4位引起院內血流感染的病原微生物，但卻是死亡率最高的致病菌，死亡率可高達40%。 白念具有較強的形成生物膜的能力，幾乎于所有的醫療設備上均能形成生物膜。葡萄球菌是院內感染的主要條件致病菌，大多數植入相關的感染都是由葡萄球菌引起的，特別是金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Brian Μ. Peters,Mary Ann Jabra-Rizk, Mark A. Scheper, Jeff G.Leid, John William Costerton and Mark E. Shirtliff. Microbial interactions and dijerential protein expression in Staphylococcus aureus Candida albicans dual-species biofilms. FEMS Immunol Med Microbiol 2010, 59 :493-503)。研究表明白色念珠菌形成生物膜的骨架結構，細菌生長依附于白念的菌絲周圍，形成混合BF。其中金黃色葡萄球菌對白念的吸附能力最強。另有研究指出，在混合生物膜內表皮葡萄球菌和白色念珠菌表現出廣泛的交互作用，并且某些表皮葡萄球菌株產生的胞外聚合物能阻止氟康唑滲入混合真菌-細菌生物膜(Adam B, Baillie GS, Douglas LJ,et al. Mixed species biofilms of Candida albicans and Staphylococcus epidermidis[J], Journal Of Medical Microbiology, 2002, 51 (4) :344-349) 據報道， 27%院內白色念珠菌血液感染伴有細菌感染，金黃色葡萄球菌是第三個常見的復合感染菌。真菌角膜炎是臨床常見感染，研究表明，在亞洲30-60%的真菌角膜炎伴細菌混合感染(Douglas L. J. Candida biof ilms and their role in infection [J]. Trends Microbiol. 2003，11(1) :30-36)。在50例口炎中，39例為白色念珠菌與葡萄球菌混合定植， 這些混合共生菌群通常以混合生物膜的方式存在，治療非常困難。
目前，有關抗真菌與細菌混合感染的研究不斷增多，適合真菌與細菌分別培養與藥效研究的培養基已有現成的產品。細菌培養常用的培養基是營養瓊脂。YPDWeast Extract Peptone Dextrose Medium)培養基，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培養基，主要配方是1 % Yeast Extract (酵母膏),2% Peptone (蛋白胨)，2% Dextrose (glucose)(葡萄糖)，若制固體培養基，加入2%瓊脂粉，主要用于酵母菌的培養，是目前常用的培養白色念珠菌的固體培養基之一，但適合念珠菌與葡萄球菌共同培養的培養基目前還沒有成熟的產品可供使用。本實驗室前期研究發現，不同培養基對白色念珠菌及葡萄球菌生長的影響較為明顯。二者在不同培養基培養時，由于培養基的營養限制，對其生長狀態及敏感性都產生影響。因此，發現一種適用于白色念珠及金黃色葡萄球菌的培養基對研究混合生物膜及單一白色念珠菌生物膜具有實用意義。現有研究中(Pate JC, Jones DB and Wilhelmus KR. Prevalence and spectrum of bacterial co-infection during fungal keratitis. Br. J. Ophthalmol. 2006,90 289-292)，已有在液體培養基中對混合生物膜形態及BF中真菌及細菌的信號分子變化的研究，但沒有對混合菌在固體培養基上形態及藥效作用的觀察實驗。固體培養基作為微生物生長的基質，可以提供直觀且真實的藥效作用實驗結果，因此，選用一種適合真菌和細菌同時生長的培養基、特別是適用于白色念珠菌與葡萄球菌共同培養與研究的固體培養基具有重要的科研意義。

發明內容
本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體培養基。為實現上述目的，本發明采用下述技術方案一種適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體培養基，其配方包含如下組分且各組分按質量百分比為酵母膏0. 15% -0. 25%，蛋白胨1. 15% -1.25%，葡萄糖
0.3%-0. 5%,NaCl 0. 375%-0. 425%，牛肉粉0. 25%-0. 255%，瓊脂粉 1. 575%-1. 625%, 余量為水。優選地，其配方包含如下組分且各組分按質量百分比為酵母膏0.25%，蛋白胨
1.25%,葡萄糖0.5%，NaCl 0. 375%，牛肉粉0. 25%，瓊脂粉1.625%,余量為水。其配方還包括質量百分比為4% -6%的羊血。其配方還包括質量百分比為0. 0005% -0. 0015%的CaCl2。本發明采用白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌進行研究，通過觀察二者菌落大小、形態及顏色，評價不同營養成分的培養基對其生長的影響。具體內容如下A 白色念珠菌是臨床真菌感染的常見致病菌，并且是BF相關感染及混合BF感染的致病菌之一。葡萄球菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)也是混合BF感染的常見致病細菌。研究適用于二者混合生長的培養基具有明顯的可行性和實際的臨床意義。B 不同配方混合固體培養基對白色念珠菌和葡萄球菌生長形態的影響以不同比例的酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，瓊脂粉配制培養基，觀察不同配比組方對白色念珠菌和葡萄球菌生長狀況、菌落大小及形態的影響，確定最佳配比。
C 羊血對白色念珠菌和葡萄球菌生長形態的影響血平板是臨床微生物學檢查常用的培養基，理論上可以為真菌和細菌都提供良好的營養環境。本發明在上述不同配比的基礎上加入質量百分比為4% -6%的羊血，觀察對白色念珠菌和葡萄球菌菌落大小及形態的影響，確定最佳配比。D 不同濃度鈣離子(Ca2+)對白色念珠菌與葡萄球菌生長形態的影響本發明在上述不同配比的基礎上加入質量百分比為0.0005%-0. 0015%的CaCl2,觀察對白色念珠菌和葡萄球菌菌落大小及形態的影響，確定最佳配比。本發現與現有技術相比，具有以下有益效果1.本發明考查了各種營養成分及羊血、鈣離子對白色念珠菌和葡萄球菌共同培養的影響，可提供白色念珠菌和葡萄球菌良好的營養環境，使二者可在此培養基上具有良好的生長狀態。2.本發明所用培養基，配制方法簡單，營養豐富，真菌細菌生長狀態良好，是一種方便可行的用于白色念珠菌和葡萄球菌混合生長的培養基。本發明還為抗白色念珠菌與葡萄球菌混合感染的實驗室研究提供培養基選擇的數據，為混合生物膜的研究提供載體，為克服混合生物膜耐藥提供研究技術支持。本發明采用不同敏感程度的白色念珠菌及金黃色葡萄球菌進行研究，通過平板劃線法直接評價培養基對白色念珠菌及金黃色葡萄球菌菌落大小及形態的影響。


圖1是葡萄球菌與白色念珠菌于不同配比培養基上的生長(A-E所使用的培養基分別為表1中相應的培養基)；圖2是表皮葡萄球菌與白色念珠菌于增加配比培養基上的生長(F-I所使用的培養基分別為表2中相應的培養基)；圖3是羊血對菌株生長影響；圖4是Ca2+對菌株生長的影響。
具體實施例方式下面通過具體實例對本發明進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。實例1.用于真菌和細菌混合培養的固體培養基成分的篩選1.實驗材料1. 1 菌株經鑒定的白色念珠菌CA1，由山東省千佛山醫院臨床分離獲得，山東省衛生防疫站鑒定。金黃色葡萄球菌SA10，表皮葡萄球菌SE9，山東省醫學科學院微生物室惠贈。1. 2 試劑酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，瓊脂粉，購于鼎國生物科技有限公司；無水氯化鈣，天津市博迪化工有限公司，以無菌蒸餾水配成4. 5mmol/L的儲備液，磷酸鹽緩沖液(PBS)稱取 KH2PO4 0. 24g，Na2HPO4 · 12H20 1. 44g，NaCl 0. 2g，KCl8g，調pH 7. 4，定容1L，蒸汽滅菌，室溫保存。羊血山東省千佛山醫院感染科惠贈。1. 3 儀器AB204-N電子天平(梅特勒-托利公司)，SVE-4A1超凈工作臺(新加坡ESCO公司)，INCUCELL 55恒溫培養箱(德國MMM公司)，VENTICELL55干熱滅菌箱(德國MMM公司)，可調式移液器(Thermo Electron公司)，常溫冰箱(中國海爾公司)，G-560E 渦旋混合器(美國Si公司)。2.實驗方法2.1菌液的制備挑取傳代后生長良好的白色念珠菌的單個菌落，用PBS配制成菌懸液，于渦旋器振蕩混勻后以中國細菌濁度標準管比濁，使得樣品管與標準管濁度基本一致，此時白色念珠菌的菌濃度約為4. 5X 106CFU/ml。將該濃度白色念珠菌株的菌懸液用PBS稀釋30倍，成為約1. 5X105CFU/ml濃度的工作菌液。挑取傳代后生長良好的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的單個菌落，用PBS配制成菌懸液，于渦旋器振蕩混勻后以中國細菌濁度標準管比濁，使得樣品管與標準管濁度基本一致，此時金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的菌濃度約為1.5X108CFU/ml。將該濃度的菌懸液用PBS稀釋1000倍，成為約1. 5X105CFU/ml濃度的工作菌液。2. 2不同配比培養基的制備將酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，瓊脂粉按不同比例加入錐形瓶中(具體配比見表1，以無菌蒸餾水定容，于高壓鍋121°C滅菌15分鐘。向上述培養基中加羊血、 5%,6% )和CaCl2溶液(0. 0005%,0. 001%和0. 0015% )，形成不同組分配比的固體培養基。表1不同配比的培養基
權利要求
1.一種適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體培養基，其特征在于，其配方包含如下組分且各組分按質量百分比為酵母膏0. 15% -0. 25%，蛋白胨1. 15% -1.25%, 葡萄糖 0. 3 % -0. 5 %，NaCl 0. 375 % -0. 425 %，牛肉粉 0. 25 % -0. 255 %,瓊脂粉 1. 575% -1. 625%，余量為水。
2.根據權利要求1所述的適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體培養基，其特征在于，其配方包含如下組分且各組分按質量百分比為酵母膏0. 25%，蛋白胨1. 25%，葡萄 H 0.5%, NaCl 0. 375 %，牛肉粉 0. 25 %，瓊脂粉 1.625%,余量為水。
3.根據權利要求1或2所述的適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體培養基，其特征在于，其配方還包括質量百分比為4% -6%的羊血。
4.根據權利要求1或2所述的適合白色念珠菌與葡萄球菌共同生長的固體培養基，其特征在于，其配方還包括質量百分比為0. 0005% -0. 0015%的CaCl2。
全文摘要
本發明公開了一種用于白色念珠菌和葡萄球菌共同培養的培養基，具體涉及不同營養組分、鈣離子及血液對白色念珠菌及葡萄球菌生長的影響，探討最適合二者生長的培養基配比。其配方包含如下組分且各組分按質量百分比為酵母膏0.15％-0.25％，蛋白胨1.15％-1.25％，葡萄糖0.3％-0.5％，NaCl 0.375％-0.425％，牛肉粉0.25％-0.255％，瓊脂粉1.575％-1.625％。本發明采用白色念珠菌及金黃色葡萄球菌/表皮葡萄球菌進行研究，通過平板劃線法直接評價培養基對白色念珠菌及金黃色葡萄球菌/表皮葡萄球菌菌落大小及形態的影響。結果證實，采用本培養基白色念珠菌及金黃色葡萄球菌/表皮葡萄珠菌均可生長良好。
文檔編號C12R1/725GK102517240SQ201210008890
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者劉萍, 孫淑娟, 高媛 申請人:山東省千佛山醫院