專利名稱：重要呼吸道致病病毒檢測基因芯片的制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及九種常見呼吸道致病病毒檢測基因芯片的制備和用途，屬基因芯片檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
呼吸道病毒是指一大類能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變或僅以呼吸道為入侵門戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。目前至少有7個病毒科的10多個屬共239 個型別的病毒可引起急性呼吸道感染。急性呼吸道感染是臨床常見病之一，已成為嚴重威脅人類健康的一個公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織2002年統(tǒng)計報告，急性呼吸道感染居全球十大死亡原因中第3位，全球每年近四百萬人死于急性呼吸道感染。在兒童和成人中，90%以上的急性呼吸道感染都是由病毒引起的。最常見的呼吸道病毒有甲乙型流感病毒(influenza virus)，1、2、3型副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒 (hMPV)、麻疫病毒(Measlesvirus)、腿腺炎病毒(Mumps virus)、風(fēng)疫病毒(Rubella virus) 等。這些病毒具有感染力強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病急等特點。感染后因病毒型別種類繁多且其癥狀相似，如鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、輕度咽炎、全身發(fā)熱等癥狀，因此臨床上很難鑒別。及時準確的甄別病毒型別是臨床診治和疾病監(jiān)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的呼吸道病毒實驗室檢測方法包括組織細胞培養(yǎng)法；血清學(xué)和直接檢測法(包括電鏡法)；間接、直接免疫熒光抗體法(IFA/DFA);酶免疫測定(EIA)、酶活性測定(神經(jīng)氨酸酶測定)；核酸擴增法(PCR)。病毒的分離培養(yǎng)與鑒定及血清學(xué)實驗等傳統(tǒng)實驗技術(shù)，在病毒性疾病診斷中曾起著十分重要的作用。組織細胞培養(yǎng)仍然是發(fā)現(xiàn)新病毒的重要技術(shù)手段，是其他任何技術(shù)不可替代的。然而，這些技術(shù)都還存在一些無法彌補的缺陷，操作費時、費力、敏感性差、診斷效率低等。總之，傳統(tǒng)的實驗室診斷方法和目前應(yīng)用的實驗技術(shù)，遠遠不能滿足臨床診斷的需要，醫(yī)生單憑自己的臨床經(jīng)驗進行病毒性疾病診斷的事是經(jīng)常發(fā)生的。據(jù)此，病毒性疾病的實驗室診斷技術(shù)必須改革，要尋找和建立快速、特異、敏感和簡便的實驗技術(shù)，以適應(yīng)臨床工作的需要。基因芯片技術(shù)是20世紀90年代初發(fā)展起來的一種用于基因分析的高新生物技術(shù)，廣泛用于臨床疾病的研究，特別是用于診斷一些微生物病原體的感染。與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)相比，基因芯片技術(shù)其突出的特點是高通量、集成化、微型化、自動化等。特別適合于對大量未知樣品進行平行快速高通量的分析。病毒的基因組較簡單，每種病毒只有一種核酸，但是病毒增殖速度極快，故病毒較其他微生物更具有遺傳不穩(wěn)定性，即變異性。國內(nèi)外文獻專利報道的基因芯片技術(shù)用于檢測呼吸道病毒的方法，多為隨機引物結(jié)合基因芯片方法。雖然隨機PCR擴增法的檢測范圍有了很大的改觀，但該法擴增的靶基因用于芯片雜交，其雜交信號特異性差，國內(nèi)相關(guān)的研究包括楊銀輝等制備的cDNA探針基因芯片，可成功檢測SARS病毒、東方馬腦炎病毒等10種烈性RNA病毒，其敏感性為IO2拷貝數(shù)，但特異性較差，與其他屬的探針之間有非特異性雜交；黃巖山等建立了能檢測十幾種呼吸道病毒的基因芯片，種特異性探針長60mer，樣品擴增采用隨機接頭PCR方法，使用該芯片可以成功檢測細胞培養(yǎng)的甲型和乙型流感病毒，但是特異性和靈敏度均不高，由于所用引物在擴增時沒有特異性，也必然導(dǎo)致擴增效率低，因此檢測靈敏度也相應(yīng)會下降。熒光檢測法是基因芯片的常規(guī)檢測方法，即將熒光色素化合物直接或間接標記在待檢核酸上，產(chǎn)生的熒光信號采用激光共聚焦掃描檢測。該方法的缺點熒光信號易飽和， 易淬滅；存在自發(fā)熒光現(xiàn)象；而且更重要的是檢測儀器價格昂貴，體積笨重，從而嚴重限制了基因芯片在國內(nèi)的推廣應(yīng)用，尤其是在中小醫(yī)療機構(gòu)以及現(xiàn)場檢測的推廣應(yīng)用。開發(fā)成本低廉、檢測方便、適合現(xiàn)場檢測的基因芯片檢測新技術(shù)勢在必行。金標銀染技術(shù)(GLSS)的出現(xiàn)彌補了熒光檢測法的不足，使基因芯片可視化檢測成為可能。該技術(shù)的原理是首先用納米金標記待檢的PCR產(chǎn)物，然后在體系中引入銀離子。 小尺寸效應(yīng)使納米金具有很強的催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而這些銀顆粒又可以進一步催化還原周圍的銀離子。這種級聯(lián)瀑布催化作用使得銀顆粒越聚越多，緊緊包裹納米金顆粒積聚成團狀銀殼，形成肉眼可見的黑色顆粒，肉眼即可觀測。基于金標銀染的原理的可視化芯片檢測技術(shù)能夠大幅降低生物芯片的檢測成本， 但是單步金標銀染的檢測靈敏度還不能滿足分子檢測領(lǐng)域的更高要求，進一步提高可視化的靈敏度，使可視化檢測能夠完全代替熒光檢測，對于生物芯片技術(shù)的推廣應(yīng)用具有重要意義。TSA(tyramine siganal amplification,酪胺信號放大技術(shù))是一種基于辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)催化的生物信號放大技術(shù)，是由Bobrow等人于1989 年首次提出的。信號放大分子酪胺是一個酚基化合物，可以作為HRP的作用底物。TSA的原理是在HRP酶催化下，大量連接半抗原的酪胺分子沉積，這些半抗原主要是生物素、熒光素等小分子物質(zhì)。1992年,Adams將應(yīng)用Biotin-Tyramine的TSA系統(tǒng)首先引入免疫組化,用于抗原或抗體的檢測。現(xiàn)在，TSA技術(shù)在免疫印跡、ELISA分析以及原位雜交等諸多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。本研究采用多重PCR結(jié)合可視化芯片檢測技術(shù)研發(fā)了重要呼吸道致病病毒檢測基因芯片試劑盒，該芯片試劑盒敏感性好，特異性高，適合于多種呼吸道病毒的快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測常見呼吸道致病病毒核酸的可視化基因芯片，該芯片依托可視化芯片檢測技術(shù)實現(xiàn)了檢測信號的可視化，能同時檢測九種呼吸道致病病毒，包括A、B型流感病毒，副流感病毒1、2型，人偏肺病毒，呼吸道合胞病毒，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，腮腺炎病毒，從而實現(xiàn)高通量、特異、敏感、快速檢測常見呼吸道致病病毒的目的。為了達到上述目的，本發(fā)明開發(fā)了常見呼吸道致病病毒核酸檢測可視化基因芯片，其制備方法如下I.步驟一制備特異引物經(jīng)過比對各呼吸道病毒基因組，選擇病毒的特異、保守片段作為檢測靶基因，在保證各病毒靶基因特異性擴增的前提下兼顧其靈敏度，故將九種呼吸道病毒特異性引物進行分管組合，經(jīng)優(yōu)化最終確定了 3管多重RT-PCR體系。優(yōu)選的9對呼吸道病毒特異性引物及其對應(yīng)的擴增靶病毒種類和分管組合情況，如表I所示表I呼吸道病毒特異性引物及其對應(yīng)的擴增靶病毒種類和分管組合情況
分管引物名稱序列F-3’)序列號靶病毒A管F75 R76AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAG Bio-CTTCCTGTGCTGACTTTGCATGGGTASEQ ID NO: I SEQ ID NO:2人偏肺病毒HRSV-FTTAACCAGCAAAGTGTTAGASEQ ID NO:3呼吸道合胞病HRSV-RBio-TTTGTTATAGGCATATCATTGSEQ ID NO:4毒F69 R70TTTGATCTCTCTCTTGGCTTCAC Bio-TGGACAATCTGGTTATCACACGSEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6麻疹病毒B管F84TGCTTTGCCCCATGGGACCTCGAGSEQ ID NO:7風(fēng)疹病毒R86Bio-GGCGAACACGCTCATCACGGTSEQ IDNO:8F61GAGCGATTCACAATAGAACAGGASEQ ID NO:9腮腺炎病毒R62Bio-CATTATTTATGGTTGGAGGGAGGSEQ ID NO: 10Influenza AsAAAGCGAATTTCAGTGTGATSEQ ID NO: 11流感病毒A型InfluenzaA asBio-GAAGGCAATGGTGAGATTTSEQ ID NO:12C管Influenza Bs Influenza B asGTCCATCAAGCTCCAGTTTT Bio-TCTTCTTACAGCTTGCTTGCSEQ IDNO:13 SEQ ID NO:14流感病毒B型PIVlFlACCTACAAGGCAACAACATCSEQ ID NO: 15副流感病毒I型PIVlRlBio-CTTCCTGCTGGTGTGTTAATSEQ ID NO:16PIV2F1CCATTTACCTAAGTGATGGAASEQ ID NO:17副流感病毐2型PIV2R1Bio-CGTGGCATAATCTTCTTTTTSEQ ID NO:18
2.步驟二:制備病毒特異性探針本著型間保守、屬間特異的原則，根據(jù)9種呼吸道病毒靶基因序列間的比對，在上下游引物范圍內(nèi)的序列相對特異區(qū)進行特異性探針的設(shè)計。每種靶病毒對應(yīng)一條特異性寡核苷酸探針。優(yōu)選的病毒特異性探針序列及對應(yīng)的靶病毒如表2所示表2病毒特異性探針序列及對應(yīng)的靶病毒
探針名稱序列(5’-3’)序列號靶病毒
HMPVAATTAATGTTGCTGAGCAATCAAAGGAGSEQ ID NO: 19人偏肺病毒HRSVCCAACAAAAGAACAACAGACTACTAGAGATT ACCAGGSEQ ID N0:20呼吸道合胞病毒MealesTGGACAGGCATATTATAGTACCTASEQ IDNO:21麻疹病毒MumpGAAGCTCAGATAGAACGCTGTGAGSEQ ID NO:22月思腺炎病毒RubellaCTGCATTTGCGAGATCCCCACTGATGSEQ ID NO:23風(fēng)疹病毒INFAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGSEQ ID NO:24流感病毒A型INFBAACGAAGTAGGTGGAGACGGAGGSEQ ID NO:25流感病毒B型PIVlCAAACGATGGCTGAAAAAGGGASEQ ID NO:26副流感病毒I型PIV2CAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCSEQ ID NO:27副流感病毒2型 3.步驟三制備寡核苷酸芯片
—個優(yōu)選的實施方案，步驟二中各個寡核苷酸探針在點樣時，用2X點樣液 (6XSSC,O. 1% SDS)稀釋至終濃度50μΜ。用市售的基因芯片點樣儀將探針點到空白的醛基化修飾玻片上，探針的點樣量均為3nl。寡核苷酸芯片制備完畢后，使用前至少在室溫放置干燥18小時。該芯片特征在于寡核苷酸探針陣列中包括九種呼吸道病毒特異性探針，如表3所示。其中片基質(zhì)控探針為20Τ序列，5’端cy3標記、3’端NH2修飾，用來監(jiān)測醛基片片基質(zhì)量。表3寡核苷酸探針陣列
權(quán)利要求
1.一種檢測常見呼吸道致病病毒核酸的可視化基因芯片，其制備方法包括I)步驟一制備9對呼吸道病毒特異性引物，分別放入3管RT-PCR體系中，序列如表I所示 表I引物序列
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因芯片，其特征還在于用于A、B型流感病毒，副流感病毒1、2型，人偏肺病毒，呼吸道合胞病毒，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，腮腺炎病毒的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重要呼吸道致病病毒檢測基因芯片，其制備方法包括制備特異引物，制備病毒特異性探針，制備寡核苷酸芯片，建立RT-PCR體系，建立雜交體系，制備可視化檢測試劑及建立顯色方法。利用本發(fā)明制備的基因芯片可同時甄別9種常見呼吸道致病病毒，包括包括A、B型流感病毒，副流感病毒1、2型，人偏肺病毒，呼吸道合胞病毒，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，腮腺炎病毒，為常見呼吸道致病病毒高通量、快速檢測提供一種新的解決方案，可為呼吸道致病病毒的監(jiān)測、臨床診斷及治療提供指導(dǎo)。
文檔編號C12Q1/68GK102586475SQ201210015448
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者劉志紅, 劉琪琦, 張敏麗, 彭賢慧, 朱坤, 王升啟, 陳蘇紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 深圳市普瑞康生物技術(shù)有限公司