專利名稱：禽腦脊髓炎病毒vp1蛋白亞單位疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
禽腦脊髓炎又稱流行性震顫，是由禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)引起的一種主要侵害雛雞的傳染病，其特征性病理變化為非化膿性腦脊髓炎， 典型癥狀為運動失調，頭頸震顫和漸進性麻痹(趙振華、禹旺盛、郝憲譜等.禽腦脊髓炎的發生與診斷.內蒙古畜牧科學.1994，3 :34-37)。世界幾乎所有飼養商品雞的地區都發生過該病，我國自上世紀80年代以來各地陸續暴發此病，給養禽業帶來較大的經濟損失。由于本病具有突然出現，難以預測持續期，可通過水平接觸和垂直傳播等特點，所以對養禽業的危害非常嚴重，唯一有效辦法是通過對產蛋種雞接種疫苗來預防后代雛雞的發病。目前國內對禽腦脊髓炎疫苗的研究大多集中在滅活疫苗的研制，國外為弱毒活疫苗的研究報道。AEV是小RNA科腸病毒屬成員，基因組為單鏈正股RNA(Calnek，B. W.，Luginbuhl， R. E. , Helmboldt, C. F. ,1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry. Iowa State University Press，Ames，IA，pp. 571-581)。AEV 僅有一個翻譯起點，編碼產生一個多聚蛋白，多聚蛋白在病毒編碼的活性蛋白的作用下，級聯水解成功能性蛋白，VPl是病毒的四種結構蛋白中的一種，與病毒的侵入及參與構成病毒的抗原成分有關。新加坡的Li Wei (2008)最近報道用細胞表達的VPl亞單位疫苗能有效地保護雞免受AEV的感染。他們將AEV的主要抗原蛋白VPl、VP0、VP3分別在細胞SF9中進行表達，然后純化蛋白，制成亞單位疫苗，并對VP1、VP0和VP3生物活性進行了檢測，結果發現VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保護雞免受 AEV 的感染(Wei L，Chee LL, Wei T et al. The VPl protein of avian encephalomyelitis virus is a major host-protective immunogen that serves as diagnostic potential. J Virol Methods. 2008Apr ； 149(1) :56-62.)。完整的病原體含有許多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主產生保護性應答。其中某些抗原還能引起過敏，免疫抑制和其他副作用，這是使用完整的病原體做疫苗的缺陷。 并且目前國內應用的滅活苗生產制備抗原過程繁瑣，而弱毒疫苗現也有接種疫苗發病情況存在。而用亞單位疫苗則可以解決這個問題，尤其是這種疫苗除了具有抗原穩定性高，純度高，特異性強，敏感性高，不產生其他不相關抗體，免疫效果檢測方法方便準確外，還十分易于生產。不用動物體或是胚體生產，不會帶有組織殘留物。而且不需滅活，但安全性高。通過對禽腦脊髓炎病毒VPl cDNA全序列進行篩選和分析，選取了其中一段抗原表位較豐富、能夠在原核細胞中高效表達的cDNA序列，構建了原核表達載體，進行原核表達， 并成功地表達出可溶性的重組蛋白。利用本發明可以生產出禽腦脊髓炎亞單位疫苗，具有商業使用價值。 發明內容
本發明的目的是提供一種禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白的基因合成、表達載體構建及產物的制法，以求在大規模工業化生產中能生產出高效、安全、價廉的禽腦脊髓炎病毒VPl 蛋白亞單位疫苗。實現本發明的技術方案為1.構建一種可表達禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌將含有所禽腦脊髓炎VPl蛋白基因(序列1)連入克隆載體PM-18T，并轉入大腸埃希氏菌DH5CI ；將鑒定正確的陽性質粒PMD18-T-VP1，用ECORI和Mil雙酶切后，經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因連入pET-32a，構建成禽腦脊髓炎VPl蛋白基因的表達載體 pET-3^i-VPl，轉化表達型大腸桿菌(Escherichia coli) Rossetta，獲得可表達禽腦脊髓炎 VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌pET-32a-VPl/Rossetta株。2.制備的禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗利用構建獲得可表達禽腦脊髓炎 VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pET_3^i-VPl/Rossetta株作為生產菌株，制備腦脊髓炎VPl蛋白和常規礦物油佐劑而成禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫
田ο3.本發明涉及的禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗是將本發明中獲得的重組大腸埃希氏菌pET-32a-VPl/ROSSetta接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C 培養過夜后挑取菌落，在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養液和大腸埃希氏菌培養基(配方為胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%)中培養至菌液OD6c 為0.6 0.8時， 加入終濃度為0. 02M的乳糖，進行誘導培養5 幾，離心收集菌體；將收集的菌體用生理鹽水進行懸浮，置超聲波破碎菌體；經硫酸銨提取、透析后禽腦脊髓炎VPl蛋白；再按常規礦物油佐劑滅活疫苗制備方法制備成疫苗。本發明
具體實施例方式一、制苗用菌種1.禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白的基因合成、表達載體構建本發明設計合成了能生產禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因，這種基因含有如下核苷酸序列(序列1)5' -ATGGGGAAAG AGGATGAAGG AGGATTTTCC AGTGTGCCTG AAGTGGAGCA ACATGTTGTT GAGGACAAGG AACCACAGGG ACCTTTGCAC GTGACACCTT TTGGCGCTGT TAAAGCCATG GAGGACCCTC AGTTGGCGAG GAAAACACCT GGTACATTTC CTGAATTAGC TCCTGGTAAA CCTCGACACA CAGTAGACCA TATGGATCTG TATAAGTTTA TGGGGCGTGC CCATTACTTG TGGGGACATA AATTTACCAA AACTGATATG CAGTACACAT TCCAGATACC ATTGAGTCCC ATCAAGGAGG GTTTTGTGAC GGGAACGCTT AGGTGGTTTT TAAGTCTTTT CCAATTGTAT CGTGGTTCTC TCGACATTAC CATGACATTC GCAGGAAAGA CTAATGTAGA CGGCATTGTA TACTTTGTGC CTGAGGGTGT TGCGATAGAG ACTGAGAGGA AGGAACAGAC CCCTCTGCTC ACGTTGAACT ACAAAACATC GGTAGGTGCC ATTAGGTTTA ATACTGGACA AACTACAAAT GTCCAGTTTA GGATCCCTTT CTACACGCCA CTGGAGCACA TCGCAACCCA TTCTAAAAAC GCGATGGACT CAGTCTTGGG GGCAATTACA ACTCAGATCA CCAATTATAG TGCTCAGGAT GAGTACCTGC AGGTCACCTA CTATATCAGC TTTAATGAAG ATTCACAGTT TTCTGTTCCC AGAGCGGTAC CAGTGGTTAG CTCATTCACT GACACATCTA GCAAGACAGT GATGAATACA TATTGGCTCG ATGATGACGA GTTGGTGGAA GGGTCCTCCC ATTTTAGTTT CGATGAAATT GAGGAGGCCC AATGTTAA-3‘
其氨基酸序列為序列2:Met Gly Lys Glu Asp Glu Gly Gly Phe Ser Ser Val Pro Glu Val GluGln His Val Val Glu Asp Lys Glu Pro Gln Gly Pro Leu His Val ThrPro Phe Gly Ala Val Lys Ala Met Glu Asp Pro Gln Leu Ala Arg LysThr Pro Gly Thr Phe Pro Glu Leu Asp Pro Gly Lys Pro Arg His ThrVal Asp His MetAsp Leu Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ala His Tys LeuTrp Gly His Lys Phe Thr Lys Thr Asp Met Gln Tyr The Phe Gln liePro Leu Ser Pro lie Lys Glu Gly Phe Val Thr Gly Thr Leu Arg TrpPhe Leu Ser Leu Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Ser Leu Asp lie Thr MetThr Phe Ala Gly Lys Thr Asn Val Asp Gly lie Val Tyr Phe Val ProGlu Gly Val Ala lie Glu Thr Glu Arg Lys Glu Gln Thr Pro Leu LeuThr Leu Asn Tyr Lys Thr Ser Val Gly Ala lie Arg Phe Asn Thr GlyGln Thr Thr Asn Val Gln Phe Arg lie Pro Phe Tyr Thr Pro Leu GluHis lie Ala Thr His Ser Lys Asn Ala Met Asp Ser Val Leu Gly Alalie Thr Thr Gln lie Thr Asn Tyr Ser Ala Gln Asp Glu Tyr Leu GlnVal Thr Tyr Tyr lie Ser Phe Asn Glu Asp Ser Gln Phe Ser Val ProArg Ala Val Pro Val Val Ser Ser Phe Thr Asp Thr Ser Ser Lyr ThrVal Met Asn Thr Tyr Trp Leu Asp Asp Asp Glu Leu Val Glu Gly SerSer His Phe Ser Phe Asp Glu lie Glu Glu Ala Gln Cys為擴增如上所述的基因，本發明設計并合成了如下相應引物primer 1:5' -GGGGAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGAGGA-3‘(序列 3)primer 2:5' -GGGGTCGACTTAACATTGGGCCTCCTCAATTTC-3‘(序列 4)將含有如上所述核苷酸序列的基因(禽腦脊髓炎VPl蛋白基因)連入克隆載體 PM-18T，并轉入大腸桿菌DH5 α。將鑒定正確的陽性質粒pMD18_T_VPl用ECORI和Mil雙酶切后，經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，回收到VPl基因?；厥盏腣Pl基因連入pET-32a，構建成禽腦脊髓炎VPl蛋白基因的表達載體pET-32a-VPl，轉化表達型大腸桿菌Rossetta，獲得可表達禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸桿菌。表達載體pET_3h (+)帶有高效表達的T7啟動子，受噬菌體T7強轉錄及翻譯信號控制，能在乳糖的作用下，由宿主菌提供的T7RNA聚合酶進行誘導。構建的禽腦脊髓炎VPl 蛋白表達質粒pET-32a_VPl，轉化大腸桿菌轉化表達型大腸埃希氏菌Rossetta后構建成重組大腸埃希氏菌RoSSetta/pET-3^i-VPl (該菌株與2011年12月13日送北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為；CGMCC No. 5581)加入0. 2mmol/L乳糖溶液的誘導劑，使禽腦脊髓炎VPl蛋白獲得高效表達。2.表達產物的鑒定將PBS重懸浮的菌體用超聲波裂解后，12000r/min離心15min，取上清加入蛋白電泳上樣緩沖液(購自北京博邁德科技發展有限公司)，沸水煮8min后，用12%的分離膠進行SDS-PAGE鑒定(圖5中，從左到右分別是蛋白marker，對照，全菌-1，全菌_2)。采用硫酸銨沉淀(每100ml上清加5. 6g硫酸銨，4°C過夜，然后lOOOOr/min離心lOmin，收集沉淀，用IOmlPBS (pH7. 2)進行懸浮)、Ni_NTA對上清液進行純化(見附注1)。將用Ni-NTA純化的產物進行SDS-PAGE分析(圖6，從左到右分別是洗脫液洗脫下的第一管、第二管和第三管)。二、疫苗制造1.抗原制備(1)發酵及誘導表達將本發明中重組大腸桿菌R0SSetta/pET-3h-VPl接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C培養過夜。挑取菌落，在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養液和大腸埃希氏菌培養基(配方為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉)中培養至菌液 OD600為0. 6 0. 8時，加入終濃度為0. 02M的乳糖，進行誘導培養5 7h，離心收集菌體。(2)表達蛋白的純化過程將收集的菌體用生理鹽水進行懸浮，置超聲波破碎菌體。加固體硫酸銨至濃度達到10%，充分溶解后4°C存放過夜。離心收集沉淀。用生理鹽水重溶沉淀，并用透析袋(北京瑞達恒輝科技發展有限公司生產，截留量14KD)進行透析。用 AGP法(張淑霞，楊增岐.禽腦脊髓炎瓊擴抗原的研制和應用.動物醫學進展，2001，22 O) 59-60)測定回收物抗原滴度。2.疫苗的制備水相制備將滅活好的抗原(瓊擴效價為1 16) 96份、吐溫-80 4份混勻制成水相。油相制備將白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份混勻制成油相。乳化取油相2份放于剪切機內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相1份， 加完后以10000r/min乳化5min。三、疫苗檢驗1、效力試驗將制備的疫苗頸部皮下注射(0. 5ml/只)免疫羅曼蛋種雞。用愛德士禽腦脊髓炎抗體檢測試劑盒對其抗體進行檢測，ELISA檢測結果S/P ^ 0. 2，均為為陽性。收集免疫后蛋雞的受精種蛋，卵黃囊內接種禽腦脊髓炎強毒VR株(購自中國獸醫藥品監察所)，其劑量為IOOEID5q，孵化，雛雞正常出殼。四、本發明所涉及的疫苗與其他疫苗的比較見表1。表1本發明所涉及的疫苗與現在使用的疫苗比較
權利要求
1.一種可表達禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，其特征在于該工程菌是將含有所禽腦脊髓炎VPl蛋白基因(序列I)連入克隆載體PM-18T， 并轉入大腸埃希氏菌DH5 a ;將鑒定正確的陽性質粒pMD18-T-VPl，用ECORI和SalI雙酶切后，經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因連入pET-32a，構建成禽腦脊髓炎VPl蛋白基因的表達載體pET-32a_VPl，轉化表達型大腸桿菌Rossetta，獲得可表達禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pET_32a_VPl/ Rossetta株，該菌株已于2011年12月13日送交北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為 CGMCC No. 5581。
2.一種由權利要求I所制備的禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗，其特征在于該亞單位疫苗含有大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No. 5581表達的腦脊髓炎VPl蛋白和常規礦物油佐劑。
3.—種權利要求2的禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征在于 將大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No. 5581接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的LB 平板上，37°C培養過夜后挑取菌落，在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養液和大腸埃希氏菌培養基中培養至菌液OD6tltl為0. 6 0. 8時，加入終濃度為0. 02M的乳糖，進行誘導培養 5 7h，離心收集菌體；將收集的菌體用生理鹽水進行懸浮，置超聲波破碎菌體；經硫酸銨提取、透析后禽腦脊髓炎VPl蛋白；再按常規礦物油佐劑滅活疫苗制備方法制備成疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種禽腦脊髓炎病毒VP1蛋白亞單位疫苗的制備方法。本發明是通過合成了禽腦脊髓炎VP1基因的引物，構建并獲得了一株帶有該基因的高效表達載體的重組菌，實現了禽腦脊髓炎VP1蛋白在大腸桿菌中的高效表達，可溶性蛋白表達量約占菌體總蛋白的60％，該表達產物為胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性。利用該重組菌作為生產菌株制備成的禽腦脊髓炎VP1亞單位疫苗能有效地保護禽類免遭禽腦脊髓炎病毒的攻擊。
文檔編號C12N1/21GK102533629SQ20121004700
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者宮曉, 徐寶娟, 李昌友, 王紅, 郭偉偉 申請人:青島易邦生物工程有限公司