專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用基于MGB探針的熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)西部馬腦炎病毒的核苷酸序列和試劑盒，尤指快速的基于TaqMan針對(duì)衣殼蛋白編碼區(qū)的熒光定量RT-PCR檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒，適用于西部馬腦脊髓炎病毒的快速分子生物學(xué)診斷和檢測(cè)，可用于西部馬腦脊髓炎病毒的檢測(cè)，出入境檢疫等，屬于動(dòng)物檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
西部馬腦脊髓炎病毒(westernequine encephalomyelitis virus, WEEV)屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Genus Alphavirus)的成員，病毒粒子呈球形,直徑60-65nm。有囊膜，囊膜上有糖蛋白纖突，核衣殼中包裹有單鏈的基因組RNA。能感染以馬為代表的多種動(dòng)物宿主，西部馬腦炎馬對(duì)人的致死率為10%左右。我國(guó)于1990年分別從新疆 烏蘇縣的一組赫坎按蚊和博樂(lè)縣的全溝硬蜱中分離出WEEV。自然狀態(tài)下，WEEV在鳥(niǎo)類(lèi)和蚊子之間交替感染，人和馬是該病毒的終末宿主。在馬和人群中呈散發(fā)流行。主要發(fā)生于仲夏到秋末期間；主要臨床癥狀為發(fā)熱、厭食和精神高度沉郁，對(duì)于亞臨床感染病例，病癥相對(duì)溫和。該病毒也可引起平胸類(lèi)禽鳥(niǎo)的死亡。據(jù)報(bào)道，西方馬腦脊髓炎(WEE)在美國(guó)西部、加拿大、墨西哥以及中美洲和南美洲有發(fā)生。西方馬腦脊髓炎常在廣闊地域內(nèi)發(fā)生，如在1000平方英里的范圍內(nèi)都可見(jiàn)到散發(fā)病例。西方馬腦脊髓炎(WEE)主要經(jīng)蚊子傳播，偶爾也可經(jīng)小型野生哺乳動(dòng)物傳播。美國(guó)西海岸溫暖潮濕地區(qū)常有可傳播該病的蚊蟲(chóng)。病毒在蚊蟲(chóng)和野生鳥(niǎo)體內(nèi)的相互循環(huán)傳播導(dǎo)致了該病的持續(xù)存在，并呈散發(fā)流行。但目前尚未發(fā)現(xiàn)由鳥(niǎo)類(lèi)引起的人的感染。本病的傳播媒介為蚊蟲(chóng)，鳥(niǎo)類(lèi)僅為貯存宿主。在人發(fā)生WEE之前，一般該地區(qū)會(huì)有馬或野鳥(niǎo)的發(fā)病。本病可引起人和馬的發(fā)病，人和馬是該病毒的終末宿主。病馬常呈亞臨床感染，病癥相對(duì)溫和。感染馬的致死率低于30%。該病潛伏期5 14天，臨床癥狀包括發(fā)熱、厭食和精神高度沉郁。嚴(yán)重時(shí)，病馬表現(xiàn)為狂躁不安、失明、共濟(jì)失調(diào)、精神極度沉郁、臥地不起、痙攣，最后可導(dǎo)致死亡。在熱帶或亞熱帶炎熱潮濕、蚊蟲(chóng)活動(dòng)猖獗的夏季，未接種西方馬腦脊髓炎的馬如果出現(xiàn)特征性的嗜睡癥狀，可懷疑感染本病，但確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。人感染本病毒后，患者表現(xiàn)為高熱，頭痛，痙攣，嘔吐和嗜睡，有的迅速發(fā)展為昏迷狀態(tài)而死亡。致死率一般為3 4%，明顯低于脊髓部馬腦炎病毒感染，兒童和嬰兒感染死亡率高于成人。感染兒童中30%可能留有神經(jīng)后遺癥，如行動(dòng)遲緩，癲癇和行為紊亂。本病成人感染率為1:1000，1 4歲兒童感染率為1:58，1歲以下嬰兒感染率為1:1。WEEV為單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)分別為11. 5kb。它們具有甲病毒屬特征的4個(gè)保守區(qū)，5’端前46nt形成帶柄的環(huán)狀，NSPl編碼區(qū)內(nèi)形成帶柄環(huán)狀，由24nt組成的42S與26S的結(jié)合部，位于3’端后和PolyA尾前19nt組成的區(qū)域。基因組編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSPll)和5種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C，包膜糖蛋白El、E2、E3，6K，基因排列順序?yàn)?’ -C-E3-E2-6K-E1-3’)。西部馬腦脊髓炎為我國(guó)一類(lèi)動(dòng)物疫病，隨著動(dòng)物國(guó)際貿(mào)易的日益繁榮，特別是各大型國(guó)際體育賽事的日益頻繁，出入境的馬匹越來(lái)越多，同時(shí)由于參賽馬匹來(lái)自不同的國(guó)家和地區(qū)，健康狀況參差不齊，疫情非常復(fù)雜，這些因素都可能危害我國(guó)養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展和馬術(shù)運(yùn)動(dòng)的正常開(kāi)展，因此開(kāi)展西部馬腦脊髓炎的檢測(cè)技術(shù)就顯得尤為重要。目前西部馬腦炎主要靠血清學(xué)檢查(免疫熒光法和ELISA)，普通RT-PCR法和流行病學(xué)資料作出診斷，但存在靈敏度低或易于污染的確定，不利于病毒的快速檢測(cè)。因此，需要建立更高度敏感、特異和快速的檢測(cè)方法，用于隨時(shí)監(jiān)測(cè)該病的流行情況并加以控制，同時(shí)也可應(yīng)用于馬匹等動(dòng)物的出入境檢測(cè)，為西部馬腦炎的檢測(cè)提供技術(shù)支持。本研究中基于MGB短探針采用TaqMan熒光RT-PCR —步法建立了用于WEEV檢測(cè)的熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使該方法高度敏感、特異。并通過(guò)靈敏度、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)以及對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)一步證明了該方法敏感、特異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒 核苷酸序列，包括引物序列和探針序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇西部馬腦脊髓炎病毒特定保守序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。引物長(zhǎng)度為23個(gè)堿基左右，GC含量為50%_60%，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。探針的長(zhǎng)度為18堿基。一組檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列，如下I) 5’-CCGMGATCCRAACCCTCCTAG-3’ (SEQ ID NO I)2) 5’-GACCTCCTAAGATCTTCRATTTGAG-3’ (SEQ ID NO 2)3) 5，-[FAM]-CCGAAACGGCCTCCAGCG[MGB]-3，(SEQ ID NO 3)其中R代表A或G ;M代表A或C，序列I)和2)分別為檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的正義引物和反義引物，序列3)為檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的熒光探針，探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM (6-carboxy-熒光素)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)MGB。我們采用TaqMan熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)建立了西部馬腦脊髓炎病毒檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度的優(yōu)化，引物探針濃度的優(yōu)化，得到以下試劑盒。檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒檢測(cè)試劑盒，由以下組分組成I)裂解液購(gòu)自INVITR0GEN公司；2) RT-PCR反應(yīng)液，表I為反應(yīng)液配方；表I反應(yīng)液配方
組分終濃度
5XRT-緩沖液IX RT-緩沖液
權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 3所示，其中序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2分別為檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO :3為檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于所述 熒光探針序列SEQ ID NO 3的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)MGB。
3.—種檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成 1)裂解液； 2)熒光RT-PCR反應(yīng)液，其中包括RT緩沖液、MgCL2、dNTP、正義引物、反義引物和熒光探針； 3)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV； 4)RNA酶抑制劑； 5)Taq DNA聚合酶； 6)DEPC 7jC ； 7)陰性對(duì)照西部馬腦脊髓炎病毒陰性組織樣品； 8)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列； 其中，正義引物為序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)MGB。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述熒光RT-PCR反應(yīng)液包括1XRT緩沖液、4. Ommol /T, MgCL2>O. OSmmoI /T, dNTP>O. 4 μ mol/L 正義引物、O. 4 μ mol/L 反義引物和O. 2ymol/L熒光探針。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒。該檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3所示，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的熒光探針。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有上述引物的檢測(cè)西部馬腦脊髓炎病毒的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、重復(fù)性好、不易污染及操作安全的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102808044SQ201210336760
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者高志強(qiáng), 谷強(qiáng), 李海花, 張偉, 張鶴曉, 劉環(huán), 蒲靜, 喬彩霞, 張利峰, 吳亞瓊, 于軍超, 王慧珊 申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心