專利名稱：一株重組的枯草芽孢桿菌及由其生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因工程領(lǐng)域，具體涉及ー株重組的枯草芽孢桿菌及由其生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。
背景技術(shù)：
微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase, MTG)是一種通過催化多肽鏈中酰基基團(tuán)轉(zhuǎn)移使蛋白質(zhì)之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。它催化蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，提高蛋白質(zhì)的水溶性、持水性、塑性和熱穩(wěn)定性等，從而提高蛋白質(zhì)的應(yīng)用價(jià)值。該酶已在醫(yī)藥エ業(yè)、食品エ業(yè)和紡織エ業(yè)等廣泛利用，有“ 21世紀(jì)超級(jí)粘合剤”的美稱，被認(rèn)為是用于生產(chǎn)新型蛋白食品的最重要酶種，顯示出顯著的應(yīng)用前景及優(yōu)勢(shì)，因而引起了人們的高度重視。國外在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特性及應(yīng)用性的研究已經(jīng)有很多報(bào)道，主要是利用從動(dòng)物器官組織中提取的酶樣品進(jìn)行試驗(yàn)。但是動(dòng)物組織來源少、提取エ藝復(fù)雜、回收率低、產(chǎn)品成本過于昂貴，因此該酶的生產(chǎn)應(yīng)用一直受到很大的限制。日本 Ando 等(Ando H, Adachi M, Umeda K, et al. Purification and characteristics of a novel transglutaminase derived from microorganisms. Agric Biol Chem. 1989,53 :2613-2617.)首先報(bào)道以輪枝鏈霉菌屬發(fā)酵生產(chǎn)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 (MTG)，獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，吸引了國內(nèi)外各方的廣泛關(guān)注和極大的興趣。國內(nèi)亦有大量文獻(xiàn)報(bào)道。目前，主要是通過以下幾種方法來提高M(jìn)TG的產(chǎn)量 第一，通過誘變育種篩選高效產(chǎn)酶的菌株，包括傳統(tǒng)誘變育種和太空誘變育種，如日本味之素公司就是采用經(jīng)誘變的茂原鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)MTG(Ando H，Adachi M，Umeda K，et al.Purification and characteristics of a novel transglutaminase derived from microorganisms [J]. Agric Biol Chem. 1989,53 :2613-2617.),但是這種方法獲得的高產(chǎn)菌很容易退化，生產(chǎn)不穩(wěn)定；國內(nèi)王璋等(王璋，王灼維，袁輝，等.微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)菌的“神舟四號(hào)”飛船搭載育種研究[J].食品與發(fā)酵エ業(yè)，2003，29 (I) 6-12.)將MTG生產(chǎn)菌搭載到“神舟四號(hào)”飛船進(jìn)行育種研究，但是效果也不理想。第二，通過基因工程的方法構(gòu)建高效表達(dá)MTG的工程菌株，但是目前基因工程生產(chǎn)MTG所用的宿主主要為大腸桿菌，需要經(jīng)過細(xì)胞破碎后才能獲得，如在王莉等(王莉，常忠義，李平作.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá).中國生物工程雜志.2004，
1156-60)構(gòu)建了基因工程菌成功地表達(dá)了 MTG，所產(chǎn)生的MTG不僅存在于胞內(nèi)，而且還以包涵體的形式存在，要獲得具有活性的MTG需要經(jīng)過細(xì)胞破碎，包涵體變性、復(fù)性等復(fù)雜過程，其過程很是繁瑣，很難實(shí)現(xiàn)エ業(yè)化生產(chǎn)。Christian K等(Christian K. Marx, Thomas C. 2008. Hertel. Purification and activation of a recombinant histidine-tagged pro-transglutamine after soluble expression in Escherichia coll and partial characterization of the active enzyme. Enzyme andMicrobial Technology. 2008,42 : 568-575)報(bào)道的生產(chǎn)MTG的方法，雖然實(shí)現(xiàn)了 MTG的可溶性表達(dá)，但是MTG是以酶原的形式存在于胞內(nèi)，面臨細(xì)胞破碎、酶原激活等問題；針對(duì)以上問題，現(xiàn)在國內(nèi)外基因工程生產(chǎn)MTG主要集中在胞外生產(chǎn)MTG， 如 Yoshimi Kikuchi 等(Yoshimi KiKuchi, Masayo Date, kei-icni Yokoyama et al.becretion of Active-Form btreptoverticillium mobaraense Transglutaminase by Corynebacterium glutamicum Processing of the Pro-Transglutaminase by a Cosecreted Subtilisin-Like Protease from Streptomyces albogriseolus [J]. Applied and Environmental Microbiology. 2003, Jan. 358-366)報(bào)道將一種蛋白酶與轉(zhuǎn)谷氨酸胺酶原同時(shí)轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中，在30h時(shí)有pro-MTG的表達(dá)，在45h時(shí)開始有MTG的產(chǎn)生， 在70h時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)量，其產(chǎn)量為142mg/L，酶活為58. 2U/L。該報(bào)道雖然克服了利用大腸桿菌作為宿主時(shí)存在的一系列問題，但是同樣存在一些問題，如發(fā)酵時(shí)間過長，要70h才能達(dá)到最大產(chǎn)量、產(chǎn)量不高，不能實(shí)現(xiàn)エ業(yè)化生產(chǎn)。枯草芽抱桿菌是美國FDA公認(rèn)的幾種Generally recognized as safe(GRAS)生物之一，因此被廣泛應(yīng)用在食品エ業(yè)，相比較于大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌是ー 種革蘭氏陽性菌，其胞質(zhì)空間沒有脂多糖(內(nèi)毒素的主要成分)，因此更安全。同時(shí)枯草芽孢桿菌具有天然的高效分泌系統(tǒng)，可以將目的蛋白直接分泌到胞外，另外相對(duì)于胞內(nèi)環(huán)境， 胞外的環(huán)境更有利于重組蛋白的折疊，不容易形成包涵體。枯草芽孢桿菌作為基因工程生產(chǎn)外源重組蛋白具有顯著優(yōu)勢(shì)，據(jù)報(bào)道，目前60% 的商業(yè)化酶都是以枯草芽孢桿菌作為宿主生產(chǎn)的。羅寧等(羅寧，楊慧林，沈徐凱，鄭明英.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢桿菌WB800中的表達(dá).現(xiàn)代食品科技.2011，7 :734-737) 報(bào)道了以枯草芽孢桿菌生產(chǎn)MTG的方法，但是是以酶原的形式表達(dá)，沒有活性，經(jīng)純化后， 需要用胰蛋白酶激活才具有生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一株重組的枯草芽孢桿菌，該菌株是將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因和ー種金屬蛋白酶基因同時(shí)轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌 WB800后得到的，該菌株能夠同時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原和ー種金屬蛋白酶，通過該金屬蛋白酶切割轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原，在發(fā)酵液中直接獲得具有生物活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。本發(fā)明的另一目的在于提供ー種由上述重組的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一株重組的枯草芽孢桿菌，由以下步驟構(gòu)建得到(I)構(gòu)建枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S :PCR擴(kuò)增白淺灰鏈霉菌蛋白酶 subtilisin-like protease基因；PCR擴(kuò)增P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)肽基因；然后通過融合 PCR將P43啟動(dòng)子+信號(hào)肽基因與subtilisin-like protease基因連接，再將融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接入PKS2質(zhì)粒基因，最后將重組的PKS2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB800，得到枯草芽孢桿菌 B. subtilis WB800S ；(2)構(gòu)建枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG :PCR擴(kuò)增茂原鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物連接入表達(dá)載體PBEP43中，得到融合表達(dá)質(zhì)粒 pBEP43-proMTG ;將質(zhì)粒pBEP43-proMTG轉(zhuǎn)化入步驟(I)的枯草芽抱桿菌B. subtilisWB800S中得到枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG,該菌株能夠高水平表達(dá)可溶性的
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG已于2011年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為中國武漢武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011492。上述重組的枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。上述重組的枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/pix)MTG用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，包括以下步驟將枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG在37°C的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 14h，得到活化的枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG ;然后將活化的枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG以體積比1-2 %的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵 24-96h，將發(fā)酵液離心、取上清液，將上清液純化即得到可溶性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。所述的LB培養(yǎng)基中添加有卡那霉素；所述的發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選48h ;所述的離心是8000rpm離心5min ；所述的純化是用親和層析柱純化，以咪唑溶液洗脫；所述的親和層析柱優(yōu)選HisTrap FF crude柱。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明先將ー種來自白淺灰鏈霉菌的金屬蛋白酶subtilisin-like protease基因通過同源重組的方式整合到枯草芽孢桿菌WB800基因組上，構(gòu)建枯草芽孢桿菌WB800S， 然后將茂原鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原的基因克隆至表達(dá)載體PBEP43，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌 WB800S,利用金屬蛋白酶subtilisin-like protease切割轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原，實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，而且可以在發(fā)酵液上清中直接獲得具有生物活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶， 省去了繁瑣的細(xì)胞破碎、純化后激活酶原等過程，簡化了發(fā)酵生產(chǎn)エ藝。


圖I是subtilisin-like protease基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖2是P43啟動(dòng)子和samyQ信號(hào)肽編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖3是融合基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖4是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖5是枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。圖6是枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG發(fā)酵上清液純化后的SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I
一株重組的枯草芽孢桿菌，由以下步驟構(gòu)建得到步驟一構(gòu)建枯草芽抱桿菌B. subtilis WB800S(I) PCR 擴(kuò)增 subtilisin-like protease 基因白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus) subtilisin-like protease 的核苷酸序列是從NCBI獲得，見序列表SEQ ID No. I。以I y L白淺灰鏈霉菌(購買于廣東省微生物菌種保藏中心)基因組DNA為PCR反應(yīng)模板,subtilisin-like protease基因正向引物和反向引物分別為SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5所示，擴(kuò)增出一條與subtilisin-like protease基因大小相符的DNA片段，如圖I所示，圖中泳道I為DNA marker ;泳道2、3均為 PCR 產(chǎn)物(subtilisin-like protease 編碼基因)。⑵PCR擴(kuò)增P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)肽編碼基因P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)肽的核苷酸序列見序列表SEQ ID No. 2。將pBEP43質(zhì)粒 (該質(zhì)粒可參照以下文獻(xiàn)記載的方法構(gòu)建羅寧，楊慧林，沈徐凱，鄭明英.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢桿菌WB800中的表達(dá).現(xiàn)代食品科技.2011，7 =734-737)稀釋100倍后取
IU L作為PCR反應(yīng)模板，P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)肽基因正向引物和反向引物分別為SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7，擴(kuò)增出一條大小與SEQ ID No. 2相符的DNA片段，如圖2所示，圖中泳道I為DNAmarker ;泳道2、3均為PCR產(chǎn)物(P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)肽)。(3)融合PCR擴(kuò)增P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)肽編碼基因及subtilisin-like protease 務(wù)因分別將P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)妝編碼基因、subtilisin-like protease基因PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物膠回收，然后取等摩爾比例的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，所用正向引物和反向引物分別為SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 5，擴(kuò)增出一條與目的產(chǎn)物大小相符的DNA片段，如圖3所示， 圖中泳道I為DNA marker ;泳道2、3均為PCR產(chǎn)物。(4)融合質(zhì)粒 PKS2_subtilisin-like protease 的構(gòu)建將溫敏性質(zhì)粒PKS2 (該質(zhì)粒是在 NYU Langone Medical Center 的 Konstantin Shatalin饋贈(zèng)的PKSl的基礎(chǔ)上，將其中的三個(gè)BamHI酶切位點(diǎn)消除而得)用EcoRV單酶切， 去磷酸化，然后用T4DNA連接酶連接上下同源臂，所使用的同源臂是枯草芽孢桿菌amyE基因，將融合PCR的產(chǎn)物插入上下同源臂之間，即成功構(gòu)建融合質(zhì)粒PKS2-subtilisin-like protease。(5) subtilisin-like protease基因整合到枯草桿菌WB800基因組上將構(gòu)建好的融合質(zhì)粒PKS2-subtilisin_like protease轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌 WB800，通過同源重組的方式整合到枯草芽孢桿菌WB800基因組上，轉(zhuǎn)化方法參見以下文獻(xiàn) IG載Nata丄ia P,Zakataeva,Oksana V et al. A simple method to introduce marker-free genetic modification into chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains[J]. Appl Microbiol Biotechnol. 2010,85 :1201-1209),得到新的菌株 B. subtilis WB800S。步驟ニ構(gòu)建枯草芽抱桿菌B. subtilis WB800S/proMTG(I) PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因茂原鏈霉菌(Streptomyces mobaraensis)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列從又獻(xiàn)(ffasnizu, K ;Ando, K ；Koikeda, S et al. Molecular Cloning of the Gene forMicrobial Transglutamme from Streptomyces mobaraensis ana its Expression in Streptomyces lividans [J] Biosci. Biotech. Biochem. 1994, 58 (I), 82-87.)中獲得，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因的序列見序列SEQ ID No. 3，以I ii L茂原鏈霉菌(購于廣東省微生物菌種保藏中心)基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因正向引物和反向引物分別為SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9所示，擴(kuò)增出一條大小上述文獻(xiàn)報(bào)道相符的DNA片段，如圖 4所示，圖中泳道I為DNAmarker ;泳道2、3均為PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因)。(2)表達(dá)質(zhì)粒 pBEP43_proMTG 的構(gòu)建通過PCR擴(kuò)增獲得表達(dá)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原的基因片段，通過BamHI、XbaI雙酶切， 克隆到載體PBEP43中，構(gòu)建表達(dá)載體pBEP43-proMTG，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B. subtilis WB8OOS 成為工程菌 B. subtilis WB800S/proMTGo枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG已于2011年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為中國武漢武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011492。實(shí)施例2一種由實(shí)施例得到的枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，包括以下步驟(I)挑取枯草芽抱桿菌B. subtilis WB800S/proMTG的單菌落于IOmL LB培養(yǎng)基中(含Kan 10iig/mL)，37°C，200rpm活化12h，將活化的種子接種于50mL LB培養(yǎng)基中(含 Kan 10 u g/mL)接種量為 1-2% (體積比)，37°C，200rpm 分別發(fā)酵 24h、48h、60h、72h 后離心取上清液，上清液的SDS-PAGE電泳圖如圖5所示，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵48h時(shí)MTG (轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)
廣量最尚。(2) HisTrap柱親和層析純化MTG采用GE公司AKTApurifier層析儀和5mL HisTrap FF crude柱純化蛋白，包括以下步驟2. I用蒸餾水洗柱至基線平穩(wěn)。2. 2 用 buffer B(0.5M 咪唑(imidazole)，0. 5M NaCl,20mM Tris HCl，pH8. 0)平衡柱子至基線平穩(wěn)，流速為10mL/min。2. 3 用 buffer A(0. 5M NaCl,20mM Tris HCl，pH8. 0)平衡柱子至基線平穩(wěn)，流速為 10mL/mino2. 4 上樣，流速為 5mL/min。2. 5用buffer A平衡柱子至基線平穩(wěn),流速為5mL/min。2.6用buffer B洗脫，見峰起開始收集蛋白。MTG純化后SDS-PAGE的結(jié)果見圖 6 (最右邊的泳道是未經(jīng)純化的樣品，中間的兩條泳道是經(jīng)過純化的樣品)，純化效果見表I 所示表I
權(quán)利要求
1.一株重組的枯草芽孢桿菌，其特征在于是由以下步驟構(gòu)建得到(1)構(gòu)建枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800S =PCR擴(kuò)增白淺灰鏈霉菌蛋白酶 subtilisin-like protease基因；PCR擴(kuò)增P43啟動(dòng)子+samyQ信號(hào)肽基因；然后通過融合 PCR將P43啟動(dòng)子+信號(hào)肽基因與subtilisin-like protease基因連接，再將融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接入PKS2質(zhì)粒基因，最后將重組的PKS2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB800，得到枯草芽孢桿菌 B. subtilis WB800S ；(2)構(gòu)建枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800S/proMTG PCR擴(kuò)增茂原鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物連接入表達(dá)載體PBEP43中，得到融合表達(dá)質(zhì)粒 pBEP43-proMTG ;將質(zhì)粒pBEP43-proMTG轉(zhuǎn)化入步驟(I)的枯草芽抱桿菌B. subtilis WB800S 中得到枯草芽孢桿菌 B. subtilis WB800S/proMTG ；所述的枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG已于2011年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011492。
2.權(quán)利要求I所述的重組的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟將枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG在37°C的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 14h，得到活化的枯草芽孢桿菌B. subtilisffB800S/proMTG ;然后將活化的枯草芽孢桿菌B. subtilis WB800S/proMTG以體積比1-2%的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵 24-96h，將發(fā)酵液離心、取上清液，將上清液純化即得到可溶性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用，其特征在于所述的LB培養(yǎng)基中添加有卡那霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵時(shí)間為48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用，其特征在于步驟(3)所述的離心是8000rpm離心5min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用，其特征在于步驟(3)所述的純化是用親和層析柱純化，以咪唑溶液洗脫。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的應(yīng)用，其特征在于所述的親和層析柱為HisTrap FF crude柱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株重組的枯草芽孢桿菌及由其生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，該重組菌株由以下步驟構(gòu)建得到(1)通過融合PCR將P43啟動(dòng)子+信號(hào)肽基因與subtilisin-like protease基因連接，再將融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB800，得到枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800S；(2)PCR擴(kuò)增茂原鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原基因，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800S中得到枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800S/proMTG。將枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800S/proMTG發(fā)酵、純化，得到可溶性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。本發(fā)明方法可以在發(fā)酵液上清中直接獲得具有生物活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，省去了繁瑣的細(xì)胞破碎、純化后激活酶原等過程，簡化了發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102586167SQ201210052578
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者楊慧林, 潘力, 王坤, 鐘景儒 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué), 廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司