專利名稱：一種高產肝素酶Ⅰ的原核表達載體的構建方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，特別涉及一種高產肝素酶I的原核表達載體的構建方法。
背景技術：
肝素酶(heparanase, Hpa)是近年來研究較多的ー類D-糖苷內切酶,它不僅存在 于正常的組織中，如胎盤和淋巴器官，其對胚胎的形成，新血管的生成，神經系統的發育，炎癥反應等都發揮著正常的生理功能；同時也存在于多種惡性腫瘤細胞的表面，能夠促進細胞的侵襲和轉移，誘導腫瘤血管生成，從而降低腫瘤患者的生存率。目前，研究的重點在于如何抑制腫瘤細胞表面表達的肝素酶活性，從而有效治療腫瘤。肝素酶的用途極其廣泛，其在低分子量肝素及肝素寡糖的制備，肝素及肝素類分子的結構測定，控制腫瘤細胞的生長和轉移以及清除血液中殘存肝素等方面都具有重要作用。自從Payza等在肝素黃桿菌中發現肝素酶以來，人們在許多微生物中都發現了肝素酶的存在，是近期研究的熱點。肝素黃桿菌來源的肝素酶可以分為肝素酶I、II和III三類，其酶基因的克隆表達、蛋白的純化和性質研究、以及酶蛋白的改造等相關研究已經有所報道，在作用機制和生物學活性等方面也都有了一定的認識。但目前只有肝素黃桿菌和環狀芽孢桿菌的肝素酶基因得到了克隆和表達，而商品化的肝素酶都來源于肝素黃桿菌。近期研究發現肝素作為長期以來用于治療和預防血栓的藥物對于人體具有一定的副作用，如影響血小板的穩定，從而導致手術后大出血等。而分子量在4000-8000的低分子量肝素(LMWH)則能夠在不產生顯著副作用的情況下有效地治療血栓。截至目前為止，低分子量肝素已經逐步取代肝素成為了首選的治療藥物。低分子量肝素的生產可以分為化學降解法和酶解法。酶解法相對于化學降解法而言具有其獨特的優點，例如作用條件溫和，酶的專ー性高，環境相對友好等，是較理想的エ業生產肝素酶的方法。但是利用酶解法生產低分子量肝素的缺點在于(I) 一方面肝素酶的來源有限，其野生菌產量很低并且需要價格昂貴的肝素進行誘導表達，從而導致生產成本過高。另ー方面也是由于肝素酶的重組表達極易形成無活性的包涵體，并且不容易復性。(2)微生物來源的肝素酶是ー種裂解酶，在裂解反應過程所產生的低分子量肝素的非還原末端的不飽和鍵嚴重影響肝素酶的藥效，必須通過臭氧氧化法去除。我國是肝素原料的出ロ大國，但一直未能對低分子量肝素生產技術進行系統的研究。目前低分子量肝素主要來自合資企業生產或者由國外進ロ，因此，利用酶解法生產低分子量肝素的研究應用前景極為廣泛。而肝素酶作為低分子量肝素酶法生產的原材料，其高效生產技術的研究則是備受關注的課題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種高產肝素酶I的原核表達載體的構建方法。一種高產肝素酶I的原核表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟
(a)以Fl和Rl為引物，Fl :5’ -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG _3’
Rl :5’ -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3’
利用PCR反應擴增得到如SEQ ID NO. I所示的編碼肝素酶I的基因序列；
(b)將上述編碼肝素酶I的基因序列連接至pET-28a載體上，得重組表達載體pET28a_HpaI ；
(c)將重組表達載體pET28a-Hpa I質粒轉入大腸桿菌BL21菌株。進一步地，，步驟a 中，PCR 反應體系為IOXBuffer 5μ I, MgCl2 3μ I,dNTP 1μ I, DNA 1μ I, Taq酶O. 5 μ 1，引物混合物2 μ 1，雙蒸水37. 5 μ I ;反應參數為97°C 5min, 97°C 50s,55°C 50s,72°C Imin 共 30 個循環，最后在 72°C延伸 lOmin。
本發明構建了肝素黃桿菌肝素酶I的原核表達載體。通過應用PCR技術合成了肝素酶I基因序列，將該基因序列克隆至載體pET_28a中，得到重組表達載體pET-28a-Hpa I，再通過CaCl2轉化大腸桿菌，根據生長情況快速篩選出肝素酶活性較高的陽性克隆轉化子Hpa I，該肝素酶目前可以通過大腸桿菌發酵生產，具有良好的應用前景。


圖I為本發明的構建流程圖。圖2是重組蛋白在疋co7i BL21中的表達產物電泳圖。其中M 低分子量標準蛋白；條帶I :pET-28a空載誘導；條帶2 :重組表達載體pET_28a_ Hpa I未誘導；條帶3 :重組表達載體pET-28a Hpa I誘導3 h ；條帶4 :重組表達載體pET_28a_ Hpa I誘導4 h ；條帶5 :重組表達載體pET-28a- Hpa I誘導5 h ；條帶6 :重組表達載體pET_28a_ Hpa I誘導6 h ;條帶7 :超聲裂解后的上清；條帶8.:超聲裂解后的沉淀。
具體實施例方式實施例I.肝素黃桿菌肝素酶I基因序列的獲得 根據肝素酶I的基因序列，設計以下引物
Fl 5’ -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG _3’
Rl : 5’ -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3’
利用PCR反應擴增編碼肝素酶I的基因序列，PCR反應體系為(50 μ I) IOXBuffer5μ I, MgCl2 3μ I, dNTP 1μ I, DNA 1μ I, Taq 酶 O. 5 μ 1，引物混合物 2 μ 1，雙蒸水37. 5μ I。反應參數為97°C 5min，(97°C 50s，55°C 50s，72°C lmin)共 30 個循環，最后在72°C延伸lOmin，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，回收產物送上海生工生物工程有限公司測序，所得序列如SEQ ID NO. I所示。實施例2.重組大腸桿菌表達載體的構建
用I和Η η III分別雙酶切PCR擴增產物和pET_28a質粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，用T4DNA連接酶連接回收的目的條帶，得到原核表達載體pET28a-HpaI，用CaCl2法42°C熱激90秒將其轉化到大腸桿菌BL21。利用Kana抗性篩選單菌落。所選轉化克隆經PCR、酶切鑒定和DNA測序測定證明克隆正確后送上海生物工程有限公司測序。具體構建流程見圖I。實施例3.重組大腸桿菌表達載體的轉化和篩選將鑒定正確的重組表達載體pET28a-Hpa I質粒轉入大腸桿菌BL21菌株，加入 O. 5mmol/L的IPTG誘導表達9h，加入磷酸緩沖液重懸細胞，超聲波破碎得到肝素粗酶液。利用Azure A法測定肝素酶活性，篩選出表達肝素酶活最高的菌株Hpa I (47)。實施例4.肝素酶在大腸桿菌中的表達
在5 ml含50 mg/L Kan的LB液體培養基中，按I :50接種BL21-pET_28a- Hpa I菌液，37 °C, 220 rpm振蕩培養過夜；次日接種培養過夜的菌液至含50 mg/L Kan的新LB液體培養基中，37°C，220 rpm振蕩培養至0D600 = O. 5左右；每管分別加入IPTG至終濃度為O. 5mmol/L，28°C誘導表達；分別在誘導3 h、4 h、5 h、6 h后收集菌液，4°C，12000 rpm高速離心收集菌體；加入2 ml O. 025 M Na2HP04-NaH2P04 (pH 6. 8)緩沖液重懸洗滌菌體，4°C，12000 rpm離心20 min,棄上清。重復洗漆菌體一次。加入I ml上述緩沖液重懸菌體。冰浴中超聲懸浮細胞(工作6 S，間隔6 S，功率200，次數100次)后，12000 rpm離心10 min,取上清即為粗酶液。SDS-PAGE電泳檢測，如圖2所示。在44. 3 kDa位置附近出現一條高表達量的特異性條帶，分子量大小約為42. 9 kDa，與理論值相符。本技術領域中的普通技術人員應當認識到，以上的實施例僅是用來說明本發明，而并非作為對本發明的限定，只要在本發明的實質范圍內，對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發明權利要求書的范圍內。
權利要求
1.一種高產肝素酶I的原核表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟 (a)以Fl和Rl為引物，Fl :5’ -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG _3’Rl :5’ -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3’ 利用PCR反應擴增得到如SEQ ID NO. I所示的編碼肝素酶I的基因序列； (b)將上述編碼肝素酶I的基因序列連接至pET-28a載體上，得重組表達載體pET28a_HpaI ； (c)將重組表達載體pET28a-Hpa I質粒轉入大腸桿菌BL21菌株。
2.如權利要求I所述的構建方法，其特征在于，步驟a中，PCR反應體系為IOXBuffer 5μ I, MgCl2 3μ I, dNTP I μ I, DNA I μ I, Taq酶 O. 5 μ 1，引物混合物 2 μ 1，雙蒸水 37. 5 μ I ;反應參數為97°C 5min, 97°C 50s,55°C 50s,72°C Imin 共 30 個循環，最后在72°C延伸lOmin。
全文摘要
本發明公開了一種高產肝素酶Ⅰ的原核表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟以F1和R1為引物，F15’-TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG-3’、R15’-GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA-3’；利用PCR反應擴增得到如SEQIDNO.1所示的編碼肝素酶Ⅰ的基因序列；將上述編碼肝素酶Ⅰ的基因序列連接至pET-28a載體上，得重組表達載體pET28a-HpaI；將重組表達載體pET28a-HpaⅠ質粒轉入大腸桿菌BL21菌株。
文檔編號C12N15/70GK102618568SQ201210052690
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者于平 申請人:浙江工商大學