專利名稱：一種吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶的熱穩定性突變體及其高通量篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種新的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶熱穩定性提高的突變體以及篩選熱穩定性突變體的高通量篩選方法，屬于酶的基因工程技術領域。
背景技術：
血糖濃度測定在糖尿病的臨床診斷和管理中極為重要。目前，我國約有成年糖尿病患者9700萬人，還有1. 48億糖尿病前期患者，已經超越西方發達國家，成為全球糖尿病人最多的國家，糖尿病將是未來我國嚴重的公共衛生問題之一，而血糖監測越來越受到重視。血糖檢測在自我診斷檢測市場中占據了近16%的市場份額，資料顯示，目前全球糖尿病患者已達3. 66億人，全世界血糖檢測市場容量為50億美元，90%歐美等發達國家的糖尿病患者通過血糖儀進行自我監測。可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶(EC 1.1. 5. 2，簡稱s-GDH)，是一種可以將葡萄糖氧化為葡萄糖酸的氧化還原酶，因此該類型酶可用于檢測血糖。吡咯喹啉醌(PQQ)是繼黃素核苷酸(FMN、FAD)和煙酰胺核苷酸(NAD、NADP)后的第三種新型輔酶。后來又相繼發現一些與PQQ結構類似的輔酶topaquinone (TPQ) Uysine tymsylqllinone (LTQ)、tryptophantryptophylquinone (TTQ)，這四種輔酶并稱為醌式輔酶，以PQQ、TPQ、LTQ、TTQ為輔酶的氧化還原酶統稱為醌蛋白酶或醌酶。吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶是一類主要的以PQQ為輔酶的醌蛋白，因其獨特的性質而備受關注。醌蛋白廣泛存在于革蘭陰性菌的胞外周質中，部分溶于胞外周質，部分與細胞膜的外表面相連，組成了一個與細胞膜上呼吸鏈相偶聯的胞外周質氧化還原系統，傳遞電子到細胞膜上的電子受體。這種胞外周質氧化還原系統的特征是縮短了電子傳遞的路徑，減少了底物氧化和產物釋放所需的能量。吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶因其存在的部位不同，又分為膜結合型即m-GDH 和水溶型即s-GDH。m-GDH存在于多種革蘭陰性菌中，如不動桿菌屬、假單胞菌屬和醋酸菌屬的細菌，位于這些細菌的細胞膜外表面，可直接氧化D-葡萄糖生成脂類或葡萄糖酸。該酶是單亞基組成的醌蛋白，只由一條87kD的肽鏈構成，有5個穿膜結構，為高度疏水。其底物專一性較高，除了葡萄糖可以氧化己糖、戊糖等單糖，但不會氧化二糖。s-GDH是來源于醋酸鈣不動桿菌的可溶性醌蛋白，發現于醋酸鈣不動桿菌的周質空間內，目前只在不動桿菌屬中有發現。s-GDH被證明是區別于m-GDH的第二種PQQ依賴的葡萄糖脫氫酶，且二者同源性很低。該酶是同型二聚體，每個亞基的相對分子質量為50，000，N端是一個由對個氨基酸殘基組成的信號肽，在分泌到胞外周質中后被切除。該酶不參與醋酸鈣不動桿菌中的呼吸鏈，生理學功能未知。該酶可以催化各種單糖和二糖氧化成相應的酮，酮再進一步水解成醛糖酸，并且s-GDH可以將電子提供給PMS (吩嗪硫酸甲酯)、DCIP (2，6- 二氯靛酚)、 WB(ffurster氏藍)短鏈泛酸如泛醌Ql和泛醌Q2以及某些人工電子受體如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯和導電聚合物等。
s-GDH與其他的葡萄糖脫氫酶和葡萄糖氧化酶相比，具有極高的反應活性，反應靈敏；而且輔酶與蛋白結合緊密不需反應中額外添加輔酶(如NAD)；此外，反應過程中氧氣不會作為電子的受體而不受氧分壓干擾及廣泛的人工電子受體特異性。這些優點使s-GDH在血糖檢測以及微體積、快速響應的葡萄糖傳感器等方面有著重要作用和應用。盡管使用s-GDH有上述討論的優點，但是其熱穩定性較差，在使用過程中如果遇到較高溫度的環境很容易失活。近來，針對熱穩定性差的缺點，Sode等在用PCR方法進行了一系列的定點突變，選擇多肽鏈側鏈基團表面231位的絲氨酸殘基分別代之以半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和賴氨酸，都使酶的穩定性得到了一定程度的提高，其中以Ser231LyS在保持高活力的前提下穩定性增加最明顯，與野生型相比，55°C半衰期提高了 8倍，但仍然保持其原有酶活力。根據通過增加兩個亞基之間的結合力而提高穩定性的原理，采用的其他方法有①采用戊二醛將兩個亞基的C、N端進行化學交聯，55°C半衰期達到63min ；②利用基因工程的方法，在兩個亞基的中間添加了一段連結肽 Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Leu-Gln,半衰期 16min ；③在兩個亞基的接觸表面進行突變，Asn340Phe/Tyr418Ile和Thr416Val/Thr417Val，增加亞基間的疏水作用力，半衰期16min。選擇sPQQGDH多肽鏈側鏈基團表面415位的絲氨酸殘基代之以半胱氨酸，突變后的sPQQGDH與野生型相比，在保持其原有的催化活力的前提下，55°C熱穩定性增加了 30倍，70°C孵育IOmin后，Ser415Cys仍然保持著90%的活力。定向進化屬于非理性設計，已經成為體外改造酶分子的一種策略，不用事先了解蛋白質的結構、保守位點、催化機制等因素，而是人為地創造特殊的進化條件，在體外模擬達爾文進化過程，通過建立隨機突變文庫或重組基因庫，再經過合適的篩選，獲得具有性質明顯提高的蛋白質。酶定向進化技術在一定程度上彌補了定點突變技術的不足，具有很大的應用價值。可溶性葡萄糖脫氫酶的優良性質使其在血糖檢測和葡萄糖傳感器等方面的應用有著極大的潛能，但是較差的熱穩定性則限制了其進一步的應用，因此通過生物技術手段提高它的熱穩定性成為s-GDH研究中的一個重要方向，得到高熱穩定性的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶具有重要的意義，不僅可拓寬酶的工業應用范圍，而且可研究酶結構與穩定性的關系。

發明內容
本發明的目的在于針對市場上可溶性葡萄糖脫氫酶熱穩定性差的問題，發明的任務是通過定向進化技術與高通量的篩選方法提供與野生型酶相比熱穩定性得到顯著提升的新型s-GDH突變體或變異體。本發明的技術方案一種熱穩定性提高的S-GDH突變體，其特征在于野生型S-GDH 位于111，263，270，331，347，416位中的氨基酸中有一個或多個被取代，其中這些位置對應于由醋酸鈣不動桿菌Acinetobactercalcoaceticus L. M. D. 79. 41的s-GDH野生型序列 (SEQ ID NO 2)已知的氨基酸位置。s-GDH突變體的高通量篩選方法，通過易錯PCR構建 s-GDH的高容量突變文庫，利用浸有有色底物的濾紙在菌落平板上進行原位篩選，并結合菌落直接轉化法獲得s-GDH克隆子，得到s-GDH熱穩定性提高的突變體。與野生型S-GDH相比，所述的S-GDH突變體的熱穩定性獲得了顯著提高。得到高熱穩定性的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶為進一步擴大葡萄糖脫氫酶的應用范圍奠定了基礎。編碼本發明的s-GDH突變蛋白的多核苷酸序列以及含這種多核苷酸序列的表達載體和含所述表達載體的宿主細胞也是本發明的方案。本發明還涉及本發明的突變體在葡萄糖檢測方法中的用途，尤其是在通過測試條裝置或用生物傳感器進行的葡萄糖檢測方法。


圖1 含有野生型或s-GDH突變體的表達載體結構2 易錯PCR的瓊脂糖凝膠電泳3 定向進化篩選示意4 野生型及s-GDH突變體在55 °C的熱穩定性分析
具體實施例方式具有葡萄糖脫氫酶活性(膜結合型和可溶型)的兩種完全不同的醌蛋白酶類型同被分組在EC 1. 1. 5. 2下，但這兩種類型的酶并不相關。對于本發明而言，只有可溶型葡萄糖脫氫酶s-GDH是有關的，下文討論其改良變體。本領域知道，s-GDH的野生型DNA序列可從不動桿菌屬(AcinetcAacter)的菌株中分離出來。最優先的是從醋酸鈣不動桿菌菌株LMD79. 41中分離出來。該野生型s-GDH的 DNA序列及多肽序列分別在SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中給出。本發明的重組載體是表達載體，可以根據表達及純化的需要等目的使用適當的載體，例如pET系列、pQE系列、pMAL系列、pGEX系列等適于大腸桿菌的表達載體或分別適于枯草菌等其他原核細胞、酵母、霉菌等絲狀菌的表達載體。本發明的轉化細胞，例如在制備s-GDH時，可以使用大腸桿菌、枯草菌等其他原核細胞、酵母、霉菌等絲狀菌等。上述轉化細胞可以通過采用電穿孔法、氯化鈣法等公知的方法將重組載體導入細胞進行制備。作為重組載體及轉化細胞的具體例中，可以舉出下述實施例中給出的重組載體pET28-gdh和由此載體得到的轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。隨著創建基因文庫方法的不斷建立和完善，建立一個突變庫已變得很常規，而建立一個合適的高通量篩選方法卻變得非常關鍵，建立一個通用的高通量篩選方法目前仍是一個很大的挑戰。在過去幾年，出現了許多有應用價值的篩選方法。催化活性的選擇往往是通過表型或在固相和微孔中進行篩選。選擇壓力的使用往往導致突變體中出現不影響催化活性的突變。本發明目的篩選熱穩定性提高的突變體，因此選擇熱處理作為選擇壓力。s-GDH為胞內酶，若要通過平板直接篩選則需要以細胞為單位進行酶活反應，預實驗發現，誘導表達的BL21 (DE3) /pET28-gdh也表現出與s_GDH相同的酶反應活性，可以使反應底物溶液的顏色褪去。除此之外，由于pET28a載體會有少量的泄露表達，當用可以使表達的s-GDH形成有活性的全酶的篩選平板培養時，平板上的菌落表達出一定的酶活性。以上兩點決定了可以通過底物顏色變化進行原位篩選。
由于熱處理過程中菌體大部分已死亡，正常接種無法生長，為了獲得陽性突變子， 可以采用平板影印，原位PCR或菌落直接轉化等方法，本發明采用菌落直接轉化法。對于本發明而言，采用菌落直接轉化法獲得陽性突變子的克隆。熱處理使得部分菌體裂解，所含質粒釋放，通過直接將熱處理失活菌落轉化宿主細胞，使陽性突變子的質粒得到轉化，從而得到其克隆子。使野生型或s-GDH突變體在宿主細胞中表達后，為了從培養物中分離純化得到目的蛋白，可以組合公知的分離操作進行分離。例如可以舉出用超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑沉淀法、透析、離心、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、離子交換色譜法、親和色譜法等。本實驗的具體方案是利用野生型或s-GDH突變體C端融合表達的His標簽進行親和純化。由于大腸桿菌沒有合成PQQ的能力，只能得到sPQQGDH的重組酶蛋白，因此測定酶活之前需要添加相應的輔酶輔基以形成有功能活性的全酶。向純酶或粗酶的酶液加入一定濃度的PQQ以及Ca2+，使輔酶與酶蛋白完全的結合即形成有活性的全酶溶液，可用酶活測定反應。如上所述，s-GDH可以利用多種電子受體，如PMS (吩嗪硫酸甲酯)、DCIP 0，6-二氯靛酚)、WB (ffurster氏藍)短鏈泛酸如泛醌Ql和泛醌Q2以及某些人工電子受體如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯和導電聚合物。通過這些電子受體對s-GDH氧化葡萄糖的活性進行間接測定。本發明采用PMS和DCIP對s_GDH活性進行測定。s-GDH氧化葡萄糖的酶活測定原理如下D-Glucose+ox-PMS — D-glucono- δ-lactone+re-PMSre-PMS+ox-DCIP — ox-PMS+re-DCIP氧化態的DCIP溶液為藍色，在600nm下有吸光值，而還原態的DCIP溶液為無色， 因此當反應進行時，藍色為慢慢褪去，相應的0D_值會逐漸減少，通過0D_值的變化對酶活進行測定計算。一個酶活單位(U)為25 °C條件下，在Imin內能夠使Iymol的葡萄糖氧化(或 Iumol DCIP還原)的酶量。單位體積酶溶液中酶活單位的計算公式如下Enzyme activity (U/ml) = (( Δ ODtest- Δ ODblank) X df X Vt) / (tminX kX Vs)tmin:反應時間長度Omin)Vt 總的反應體積Oml)Vs 加入的酶液體積(0. Olml)k =DCIP 在 600nm 下的吸光系數(1/ μ Μ)df 酶液稀釋倍數本領域知道，穩定性可涉及不同方面，分別例如儲存溫度或儲存時間。短期溫度應力模型常用于評價穩定性。本發明的穩定性以此短期溫度應力模型評價，因此稱為熱穩定性。熱穩定性通過檢測樣品的無應力和有應力的s-GDH酶活性來測定。通過將無應力樣品活性設定為100%，應力處理后的剩余活性可以百分率計算。對于具體的野生型或s-GDH突變體，選擇65°C處理30分鐘或是測定55°C下的半衰期。使用這些條件，65°C處理30分鐘下野生型s-GDH剩下其原始活性在15%以下，而s-GDH突變體在實施此短期應力模型后剩下初始酶活的大大高于15%。本發明最后得到的突變s-GDH熱穩定性顯著提升。由于新型s-GDH的提升的熱穩定性，所以有可能使各種應用領域中的葡萄糖測定取得顯著技術進步。本發明的改良型s-GDH突變體可以巨大優勢用于生物樣品中葡萄糖的檢測，尤其是通過測試條裝置或通過生物傳感器進行的檢測。本發明的改良s-GDH變異體的主要應用之一是用于測試條，以監測糖尿病患者的血糖水平。如上所述，s-GDH對氧的不敏感性是超越葡萄糖氧化酶的巨大優勢。現在具有提高的熱穩定性的新型s-GDH變異體，可更好的儲存和應用。本發明還包括使用本發明的s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中葡萄糖的方法。尤其優選的是，用于檢測樣品中葡萄糖的改進方法的特征在于，使用傳感器或測試條裝置進行葡萄糖的所述檢測、測定或測量。用于檢測或測量樣品中葡萄糖的裝置也發球本發明范圍，所述裝置包含符合本發明的s-GDH突變體以及所述測量所需要的其他試劑。熱穩定性提高的本發明s-GDH突變體還可以非常有利地用于生物傳感器中，以在線監測樣品中或反應器中的葡萄糖。對于此目的，所述s-GDH突變體例如可用于包被具有鋨絡合物的氧不敏感玻璃電極，以更加準確地測定葡萄糖濃度。通過以下步驟進一步說明本發明，步驟1易錯PCR本發明采用GeneMorph II易錯PCR試劑盒進行突變，按說明書所述，突變率與所采用的模板加入的量及PCR循環數有關，模板量越多，循環數越少，突變率越低，反之則突變率越高。以含野生型s-GDH基因(SEQ ID NO 2)的重組載體pET28_gdh (如圖1)為模板，以 F(5~-GCCCATGGAAAACATTTATTGGCT-3~)( = SEQ ID NO 5)和 R(5，-GGAAGCTTATACATAGCCTTATAGG-3") ( = SEQ ID NO 6)為引物進行易錯PCR，采用50 μ L反應體系如下，60ng/ μ L pET28_gdh 5 μ L ；250ng/ yL 引物 F 0. 5 μ L ；250ng/ μ L 引物 R 0. 5 μ L ；IOXMutazyme II 緩沖液 5 μ L ；40mM dNTP 1 μ L ；Mutazyme II DNA 聚合酶 1 μ L ；ddH20 37 yL。PCR條件為95°C預變性:3min ；32個循環_95°C變性40s，56°C退火40s，72°C延伸1. 5min ；72°C延伸lOmin。PCR產物通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2。 步驟2構建高容量突變文庫 將易錯PCR產物電泳后利用DNA膠回收試劑盒(Axyft^p DNA Gel ExtractionKit)進行切膠回收并與載體pED8分別進行Ncol/Hindlll的雙酶切反應。酶切后回收的片段通過260nm處吸光度值進行濃度測定。將目的片段與載體片段按照物質的量比為10 1的比例混合，利用T4連接酶在12°C條件下連接10h。將連接產物利用PCR回收試劑盒(Axyft^p PCR cleanup Kit)進行除鹽回收，最后以10 μ L去離子水溶解，以防止連接過程中緩沖液的離子對電轉化產生影響。然后將連接產物電轉化高效感受態細胞Ε. coliBL21 (DE3)，電擊條件200 Ω ,25 μ F, 2. 5kV。將復原細胞均勻的涂布于篩選平板上，37°C培養12 16h，待菌落長出。篩選平板0. 5%酵母粉(Yeast Extract)，1 %胰蛋白胨(Tryptone)，1 %氯化鈉，IOmM氯化鈣，1. 5%瓊脂粉，混勻在121°C滅菌20min，冷卻至55 °C左右，加入終濃度30 μ g/ml卡那霉素以及ImM經過濾滅菌的PQQ，倒平板。步驟3高通量篩選熱穩定性突變體利用平板對S-GDH熱穩定性突變文庫進行高通量的篩選，具體方法如下1)將新開封的濾紙在無菌操凈臺內按平板大小的直徑進行裁剪備用；2)配制酶反應底液，IOmM MOPS (pH 7. 0)，20mM葡萄糖，0. 6mM PMS, 0. 3mM DCIP,混合均勻；3)將突變文庫置于60°C的烘箱內熱處理30分鐘，然后冷卻至室溫；4)將剪裁過的濾紙完全浸潤反應液，然后將其小心鋪于突變文庫的平板上^后拿起。濾紙上與菌體接觸的部分會發生酶反應，就會出現褪色出現白色的斑點；若由于熱處理導致酶已失活，則菌落會被染至深藍色，而其對應的濾紙部分不會發生顏色變化，因此根據這一顏色變化，仍可使濾紙褪色的菌落則有可能是具有高熱穩定性的突變位點；5)由于熱處理過程中菌體大部分已死亡，正常接種無法生長，因此將挑出的可能的突變子直接加入到BL21(DE3)的感受態中，利用熱激法進行轉化，(即采用落直接轉化法獲得s-GDH克隆子)；6)將二次轉化后長出的菌落進行熱穩定性驗證復篩7)將復篩得到的穩定性有提高的突變菌株進行培養，提取質粒，由生工測序，測序結果如下，
權利要求
1.一種熱穩定性提高的S-GDH突變體，其特征在于野生型S-GDH位于111，沈3，270， 331，347，416位中的氨基酸中有一個或多個被取代，其中這些位置對應于由醋酸鈣不動桿菌Acinetobactercalcoaceticus L. M. D. 79. 41的s-GDH野生型序列已知的氨基酸位置。
2.如權利要求1所述的s-GDH突變體，其特征在于野生型s-GDH中位于111位的天冬氨酸被谷氨酸取代，位于263位的甘氨酸被半胱氨酸取代，位于270位的谷氨酰胺被組氨酸取代，位于331位的蘇氨酸被甲硫氨酸取代，位于347位的絲氨酸被脯氨酸取代，位于416 位的蘇氨酸被異亮氨酸取代。
3.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求2的s-GDH突變體。
4.一種重組載體，其特征在于載有權利要求3所述的分離的多核苷酸。
5.一種轉化細胞，其特征在于由權利要求4所述的重組載體轉化而制成。
6.一種應用權利要求3的s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中葡萄糖的方法，所述方法包括使所述樣品與所述突變體接觸。
7.根據權利要求6的方法，其特征還在于使用傳感器或試紙條裝置來進行葡萄糖的所述檢測、測定或測量。
8.一種用于檢測或測量樣品中的葡萄糖的裝置，所述裝置包括權利要求2中的s-GDH 突變體。
9.一種高通量篩選如權利要求1所述的s-GDH突變體的方法，其特征在于利用浸有有色底物的濾紙在菌落平板上進行原位篩選。
10.根據權利要求9所述的高通量篩選s-GDH突變體的方法，篩選得到的陽性突變子通過菌落直接轉化法得到其克隆子。
全文摘要
本發明涉及一種定向改造可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶(s-GDH)的分子結構，并采用高通量技術篩選熱穩定性突變體的方法。其特征在于通過易錯PCR構建s-GDH的高容量突變文庫，利用浸有有色底物的濾紙在菌落平板上進行原位篩選，并結合菌落直接轉化法，獲得s-GDH熱穩定性提高的突變體。與野生型s-GDH相比，所述的s-GDH突變體的熱穩定性獲得了顯著提高。得到高熱穩定性的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶為進一步擴大葡萄糖脫氫酶的應用范圍奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/54GK102559624SQ20121005498
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者于怡, 徐志南, 朱建忠, 楊葉東, 黃磊 申請人:浙江德清匯寧生物科技有限公司