專利名稱：一種重組海參溶菌酶n端多肽、其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及重組海參溶菌酶N端多肽高效表達的工程菌制備方法，優化發酵工藝而獲得高產率的可溶性多肽產物，以及對制備的產品進行廣譜抗菌活性的研究。
背景技術：
溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細菌細胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β _1，4糖苷鍵的水解，導致細胞裂解，內容物逸出而使細菌死亡。它廣泛存在于自然界動植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機體的免疫防御系統中發揮重要作用。溶菌酶作為天然的抗菌劑、免疫增強劑和防腐劑目前廣泛應用于醫藥、食品及飼料等行業。近年來隨著海洋生物魚類、蝦類、貝類以及海珍品，如海參、鮑魚等養殖產量的快速增長，隨之而來的是海水養殖生產中的品質退化、養殖水平低、疾病泛濫及環境污染等問題。目前在水產品養殖以及畜禽生產中使用抗生素帶來的問題也越來越受到人們的關注，一是耐藥性問題，二是藥物殘留問題，其副作用是不可忽視的，人們不希望以犧牲人類健康為代價換取海產品、畜禽產品生產性能的提高。在這種嚴峻形勢下，溶菌酶在動物養殖方面的優勢以及在疾病預防治療方面的促進作用顯示了它的突出地位，它的綠色、安全、無公害的特點代表了未來的飼料添加劑和動物保健品的方向。根據溶菌酶空間結構、免疫學特性和催化活性的差異通?？煞譃?類C-型 (chicken-type)溶菌酶、g_ 型(goose-type)溶菌酶、i_ 型(invertebrate-type)溶菌酶； 植物源(plant lysozyme)溶菌酶；微生物源(bacterial lysozyme)溶菌酶；噬菌體(phage lysozyme)溶菌酶。近年來隨著人們把開發新藥和功能性食品的目光投向海洋，對i_型溶菌酶的研究興趣也日益高漲，相繼在海洋貝類、蝦、海星、海膽、海參中發現了 i_型溶菌酶。目前已商品化使用的溶菌酶主要從蛋清中提取，屬于C-型溶菌酶。由于來源有限，生產工藝復雜，溶菌酶產量受限，價格居高不下，難以滿足越來越大的市場需求。因此， 利用基因工程重組技術高效表達溶菌酶成為很重要的手段，尤其生產海參i_型溶菌酶具有非常重要的應用價值。研究發現，海參i_型溶菌酶與蛋清C-型溶菌酶不同，后者只對革蘭氏陽性菌起抗菌作用，而海參i_型溶菌酶不僅對革蘭氏陽性菌，并且對革蘭氏陰性菌均具有顯著的抗菌作用，尤其對通常引起水產動物嚴重病害的病原菌(弧菌和假單胞菌)具有明顯的抗菌效果。同時，海參i_型溶菌酶具有較強的抗真菌、抗病毒、增加免疫力等能力，并具有生物相容性好、對組織無刺激、無毒性等特點。海參i-型溶菌酶(以下簡稱海參溶菌酶)基因于2007年在我們實驗室首次被分離和鑒定(參見楊西建，等.海參i_型溶菌酶基因及其編碼產物的結構特點.中國生物化學與分子生物學報；2007，23 (7) :542-547)。近年來，我們又將海參溶菌酶基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母細胞中進行重組表達，并對重組蛋白的抗菌活性進行了研究(參見王秀霞，等.海刺參i_型溶菌酶基因的重組表達及抑菌譜分析.生物工程學報，2009，25 O) 189-194;谷躍峰，等.海參溶菌酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達與純化.大連工業大學學報，2010，四(5) :317-320)。但目前存在的問題，一是重組海參溶菌酶基因在大腸桿菌細胞中表達，其溶菌酶蛋白以包涵體形式存在(即酶蛋白不溶解)，后續對該蛋白的變性和復性操作繁瑣，而且獲得的酶產量低、活性不穩定；二是重組海參溶菌酶基因在畢赤酵母細胞中蛋白表達量很低。這兩個瓶頸問題嚴重阻礙了海參溶菌酶研究向產業化試驗的進程，并且國內外幾個實驗室在研究各類溶菌酶基因表達時都遇到類似問題。經過對海參溶菌酶基因結構的分析，發現海參溶菌酶的N端區域可能編碼了糖苷酶活性，而C端區域可能編碼了異構肽酶活性。因此，我們設計將海參溶菌酶基因分成兩段，分別進行重組表達制備成海參溶菌酶N端和C端多肽，再驗證其特性和功能，并與海參溶菌酶做比較和分析。本發明是關于重組海參溶菌酶N端多肽的制備方法及應用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種具有廣譜抗菌活性、高效表達海參溶菌酶多肽的基因工程制備方法。本發明采用的技術方案為對來源于自主分離鑒定的海刺參(Stichopus japonicus)的溶菌酶(SjLys)基因(GenBank注冊號EF03646^進行N端多肽的重組表達。利用設計合成的引物，擴增海參溶菌酶多肽的基因；將構建的原核表達載體 pET-3^i-SjLys-N，轉化Rosetta (DE!3) pLysS細胞，獲得一株高效表達重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌。用所述的基因工程菌生產的溶菌酶多肽，經發酵培養基及發酵條件的優化，其表達產物具有50%以上的可溶性，產品收率高。生產的重組海參溶菌酶N端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是經100°C加熱40min，該多肽產品的抗菌活性基本保持不變。研究證明，海參溶菌酶N端多肽的抗菌活性、穩定性和生產效率均優于海參溶菌酶，可無危害地應用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。本發明的一方面在于保護一種重組海參溶菌酶N端多肽的引物序列，其引物序列分別為，正向引物SEQ ID NO :1 ；反向引物SEQ ID NO :2。本發明的另一方面在于保護一種重組海參溶菌酶N端多肽的質粒，其制備方法如下以海參溶菌酶SjLys基因為模板，將上述的正向引物SEQ ID NO :1和反向引物SEQ ID N0:2所擴增的基因片段連接至大腸桿菌表達載體pET3h(+)中，構建重組表達質粒。本發明的另一方面在于保護一種表達重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌，其制備方法包括將上述的質粒轉化Rosetta (DE;3)pLysS宿主細胞獲得重組基因工程菌。本發明的另一方面在于保護一種重組海參溶菌酶N端多肽的制備方法，其包括①誘導表達培養上述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導表達；②分離和純化收集步驟①所得產品，經鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產品。具體的，在上述的方法中，其誘導表達和分離純化的條件包括③誘導表達將上文所述的重組基因工程菌在優化的液體培養基中，37°C、160rpm振蕩培養至 OD6tltl達0. 6-0. 8，再向培養體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，、150rpm誘導培養 8h，收集發酵液；其中，優化的液體培養基是指在LB培養基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；
4
④分離和純化將步驟③收集的發酵液離心，收集并洗滌菌體，反復凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，并加入Triton X_100至終濃度為1 %后，經冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為5kDa的Millipore超濾膜將蛋白濃縮至8 10mg/mL ；再將濃縮樣品經kphadex G-25凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶N端多肽的產品。本發明的另一方面在于保護一種利用上述的方法獲得的重組海參溶菌酶N端多肽。本發明的另一方面在于保護一種利用上述的重組海參溶菌酶N端多肽制備的飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、以及在海水養殖生產領域中的應用。上述本發明涉及的下列各實驗操作，包括基因片段連接至大腸桿菌表達載體 pET32a(+)中、質粒轉化Rosetta(DE;3)pLysS宿主細胞、鎳離子親和層析柱純化、超濾膜濃縮、樣品脫鹽等實驗操作方法均為本領域技術人員常用的實驗技術，故再次不做贅述，具體可見本發明中具體實施例所述部分。本發明的創新特征是1.高效表達和制備可溶性重組海參溶菌酶N端多肽，解決了當前海參溶菌酶產業化遇到的蛋白溶解度低、酶活性低等關鍵問題。2.本發明提供的基因工程菌生產重組海參溶菌酶N端多肽，具有產量高，生產條件和步驟簡單，反應條件易于控制，生產成本低的優點，因此適用于大規模的生產。3.重組海參溶菌酶N端多肽具有廣譜抗菌活性，并具有很好的熱穩定性和酶活穩定性，而且安全無害，可應用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。


圖 1 是 PCR 擴增 SjLys-N 的基因片段；其中泳道，M :50bp DNA ladder marker ；1 PCR擴增產物；圖2是重組海參溶菌酶N端多肽的Western blotting分析結果圖；其中泳道，M 精準蛋白質分子量標準；1 =IPTG誘導前菌株發酵液的菌體；2 :IPTG誘導后菌株發酵液的菌體；3 =Western blotting檢測泳道1中的樣品；4 =Western blotting檢測泳道2中的樣
P
BFI ；圖3是重組海參溶菌酶N端多肽的誘導表達及純化的SDS-PAGE結果圖；其中泳道，M 蛋白質分子量標準；1 IPTG誘導前菌株發酵液的菌體；2 :IPTG誘導后菌株發酵液的菌體；3 誘導的菌株發酵液菌體細胞被破碎后的沉淀物；4 誘導的菌株發酵液菌體細胞被破碎后的上清液；5 泳道4中的樣品經Ni2+-NTA親和層析柱純化的重組蛋白。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下述實施例中所用的海刺參(Stichopus japonicus)，源于大連長海縣地區，其海參溶菌酶(SjLys)基因的GenBank注冊號為EF036468 ；
引物序列合成、DNA測序是由北京華大基因研究中心完成；Western blotting 7MirMi^ TaKaRa Biotechnology ( ) ^ ] ；大腸桿菌Rosetta (DE;3)pLysS感受態細胞和表達載體pET_32a(+)購自 Novagen(美國)公司；大腸桿菌DH5a，克隆載體 pMD 18-T，RNAiso Plus 試劑，TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒，限制性核酸內切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，DNA ladder marker禾口蛋白低分子量marker均購自TaKaRa Biotechnology (大連)公司；質粒提取和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；HisTrap HP column 購自 GE Healthcare (美國)公司；其他試劑均為國產的分析純。實施例1高效表達重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌的制備1.海參溶菌酶N端多肽基因序列的擴增(1)根據海參溶菌酶的基因序列，設計兩對特異性引物，分別在正向和反向序列里引入Nco I和EcoR I酶切位點。其序列為正向引物SEQID NO :1TGACCATGGCTATGCAAGTTCCTTCTGAT反向引物SEQID NO :2CCAGGAATTCTCACTTCAGCCTAGCATCCPCR擴增片段范圍是從海參溶菌酶氨基酸Gln 21至Lys 69，全長為147bp (含有 49aa)，即為SjLys-Ν的基因片段。(2)取新鮮的海刺參腸樣品，根據RNAiso Plus試劑說明抽提總RNA。(3)以該海參腸總 RNA 為模板，使用 TaKafci One Step RNA PCR Kit(AMV)進行 RT-PCR基因擴增，其反應體系為 RT-PCR 循環參數為50°C 30min，94°C 2min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 45s, 35 個循環；72°C延伸IOmin。
RNase Free dH20
IOxOne Step RNAPCR Buffer
MgCl2 (25 mmol/L)
dNTP Mixture (各 10 mmol/L)
RNase Inhibitor (40 U/^)
AMVRTaseXL (5υ/μ )
Total RNA
24 μL 5 μ 10 μ 5 μ 1 μL 1 μL 1 μL 1 μL 1 μL 1 μL
HS-N-I (20μιηο1/0 HS-N-2 (20μιηο1/0 AMV-Optimized Taq (5 U/μ )
待反應結束后，取5yL PCR產物，用1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因，并將目的條帶通過瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒進行回收純化。電泳分析結果顯示(圖1)，擴增基因片段SjLys-N在150bp附近呈現特異性亮帶，與預期片段(147bp)大小基本一致。2.構建高效表達重組海參溶菌酶N端多肽基因工程菌(1)將擴增得到的SjLys-N基因片段，通過Nco I和EcoR I限制性內切酶雙酶切后，純化回收其目的基因片段；再與經Nco I和EcoR I雙酶切后線性化的PMD18-T載體由 T4 DNA連接酶連接，16°C過夜反應，構建重組質粒pMD18-SjLys-N。取連接產物5 μ L加至解凍的50 μ L大腸桿菌DH5 α的感受態細胞中，冰浴30min ；再放入42°C加熱45s，立即置冰中aiiin ；然后加入SOC液體培養基945 μ L，37°C下振蕩培養60min，即得到轉化海參溶菌酶N端多肽基因的大腸桿菌DH5 α細胞轉化液。(2)將適量該轉化液涂布于含100mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養基中37°C 過夜培養，分別挑取單菌落，經含100mg/L Amp的LB液體培養基培養后提取重組質粒。用 Nco I和EcoR I限制性酶進行酶切后電泳，得到SjLys-N的基因片段。LB液體培養基配制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl IOg ；將各組分溶解在 900mL去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7. 0，再補水至lOOOmL，高壓蒸汽滅菌。另外， LB固體培養基需添加瓊脂粉15g/L。培養基滅菌冷卻至60°C左右，按濃度要求加入相應的抗生素。(3)將SjLys-N基因片段與大腸桿菌表達載體pET3h(+)連接，構建重組表達質粒 pET32a-SjLys-N,轉化到大腸桿菌DH5 α，制得含海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌。將該基因工程菌委托專業的生物技術公司測序，證實它們含完整的SjLys-N基因片段。(4)從步驟2 (3)已構建好的基因工程菌抽提重組質粒pET3h-SjLys-N，轉化到大腸桿菌Rosetta (DE3) pLysS感受態細胞中，并取50 μ L涂布于含有100mg/L氨芐青霉素 (Amp)和；Mmg/L氯霉素(Cam)的LB固體培養基上，37°C過夜培養。分別挑取單菌落接種于含100mg/LAmp，3^ig/L Cam的LB液體培養基中，37°C振蕩培養14 16h，提取重組質粒做PCR及酶切檢測鑒定插入的基因片段大小是否正確。再挑取轉化子進行序列測定，驗證重組表達質粒讀碼框的正確性，即得到高效表達的海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌，命名為 pET32a_SjLys-N/Rosetta(DE3)pLysS。實施例2 重組海參溶菌酶N端多肽在大腸桿菌中的誘導表達及Western blotting 檢測將構建正確的海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌接種于含100mg/L Amp, 34mg/L Cam和lOg/L葡萄糖的LB液體培養基中，37°C下160rpm振蕩培養14 16h。然后按照體積比的接種量接種于含100mg/L Amp,34mg/L Cam,以及5g/L葡萄糖的LB液體培養基中，37°C下160rpm振蕩培養至OD6tltl達0. 6 0. 7，取出ImL菌液作為誘導前對照樣品。再加入誘導劑IPTG至發酵液終濃度為0. 5mmol/L, 下120rpm誘導培養10h，取出ImL菌液作為誘導后樣品。最后離心發酵液收集沉淀的菌體，用15% SDS-PAGE初步檢測該重組蛋白的表達狀況。電泳結果顯示(圖2中泳道1和2)，重組SjLys-N在約23kDa左右明顯多出1條特異性亮帶。為了驗證重組質粒pET3h_S jLys-N在大腸桿菌中是否真正得到表達，利用 Western blotting分析中的Penta-His抗體能與重組海參多肽發生特異性結合的特點進行檢測。將上述重組SjLys-N基因工程菌誘導前的樣品和誘導后發酵液的菌體樣品進行 15% SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，放置在含1. 5% BSA封閉緩沖液中，4°C平放過夜。加入1 1000稀釋的Penta-His抗體，進行一次抗體反應lh。用含 0. 1 % (v/v)Tween 20 的 1Tris-HCl 緩沖液(pH7. 4)洗滌 2 次，再用洗滌 1Tris-HCl 緩沖液 (pH 7. 4)沖洗3次后，加入1 1000的稀釋的HRP標記的兔抗鼠IgG單抗，進行二次抗體反應lh。再重復洗膜一次后，最后加入TrueBlue過氧化物酶底物，顯色Imin后分析。分析結果說明(圖2中泳道3和4)，重組SjLys-N蛋白在23kDa左右可以與Penta-His抗體發生特異性的結合，從而證明該重組蛋白在大腸桿菌中確實得到了正確表達。實施例3重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌的發酵優化和分離純化1.發酵培養基的優化發酵培養重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌的基礎培養基為含有抗生素100mg/LAmp和3%ig/L Cam的LB液體培養基。在此基礎上，進行了培養基優化實驗，包括添加葡萄糖(2g/L, 5g/L，10g/L ；)，MgSO4 · 7H20 (0. lg/L，0. 3g/L，0. 5g/L ；)，和 K2HPO4 ·3Η20(0. 5g/L，lg/L, 1. 5g/L ；)。加入IPTG誘導劑進行重組多肽蛋白的誘導表達，得到的發酵液經細胞破碎后，收集上清液分析其中可溶性蛋白的含量。經SDS-PAGE分析，確定最佳發酵培養基配方為在含100mg/L Amp,34mg/L Cam的LB培養基中，添加5g/L葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20, lg/L K2HPO4 · 3H20。2.發酵誘導條件的優化最佳發酵條件的優化實驗包括誘導發酵溫度(25°C，28°C，30°C，35°C )，IPTG 誘導劑濃度(0. 2mmol/L,0. 5mmol/L,0. 8mmol/L, 1. Ommo 1/L)，誘導發酵時間(4h，6h，8h， 10h)，誘導后搖床轉數Q20rpm，180rpm，150rpm，120rpm)。海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌在上述最佳培養基配方的條件下，370C、160rpm振蕩培養至0D_達0. 6-0. 8，加入誘導劑誘導發酵，試驗各個誘導條件。最后得到的發酵液經細胞破碎后，收集上清液分析其中可溶性蛋白的含量。經SDS-PAGE分析，確定最佳誘導發酵條件為IPTG濃度為0.5mmol/L， 28°C，150rpm,誘導培養 8h。3.最佳條件下誘導發酵結果在上述最佳培養基配方和最佳誘導發酵條件下，檢測重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌是否能夠高效誘導表達，以及表達后的重組蛋白是否具有可溶性。采用生物學軟件BandSCan5. 0分析SDS-PAGE的電泳結果，重組SjLys-N誘導后的菌體表達量占總蛋白含量的75%左右(圖3中泳道幻；而該菌體經細胞破碎后分析其上清液和沉淀物中含有重組SjLys-N蛋白的量，結果是在它的上清液中含目的蛋白50%以上(圖3中泳道4)。這表明重組SjLys-N多肽在大腸桿菌中能夠高效表達，而且表達的大部分蛋白能夠以可溶性形式存在。4.產物的分離和純化低溫離心收集誘導發酵后的菌體G V，IOOOrpm, IOmin)，用磷酸鹽緩沖液 (lXPBS，pH 7. 4)洗滌菌體兩次，將菌體反復凍融數次。按照菌體濕重體積的兩倍加入預冷的IXPBS緩沖液(pH 7. 4)，并加入Triton-100至終濃度為體積比1%，以重懸菌體。該菌懸液置冰浴中超聲裂解細胞，功率400W，超聲ls，靜置3s，共處理IOmin至不再粘稠。再經 40C、12000rpm離心15min，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE檢測。收集上清液，_20°C保存備用。準備ImL HisTrap HP column (即Ni2+-NTA親和層析柱)，用10倍柱體積蒸餾水沖洗柱子，用10倍柱體積的結合緩沖液GOmmol/L咪唑，20mmol/L磷酸鈉溶液，500mmol/ L NaCl, pH 7.4)平衡。上述經超聲裂解的上清液樣品經0. 22 μ m過濾膜處理后，以約 1. OmL/min的流速上柱，再用25倍柱體積的結合緩沖液洗柱，最后用10倍柱體積的洗脫液(150mmol/L咪唑，20mmol/L磷酸鈉溶液，500mmol/L NaCl，pH 7. 4)，洗脫目的重組蛋白 SjLys-N，收集海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分。再用截留分子量為5kDa的Millipore超濾膜將蛋白濃縮至8 10mg/mL。將濃縮樣品經kphadex G-25凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，分別得到重組海參溶菌酶N端多肽的精制產品(圖3中泳道5)。實施例4重組海參溶菌酶N端多肽抑菌活性的測定采用瓊脂平板擴散法測定重組海參溶菌酶N端多肽對部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌圈大小，以其半徑(mm)來表示。先稱取SjLys-N的凍干粉若干克，溶于 1XPBS(PH7. 4)中，利用Bradford方法確定其蛋白的含量在100 μ g/mL。此實驗的陰性對照為空載體pET_32a(+)在Ε. coli Rosetta(DE3)pLysS中誘導發酵并純化蛋白，制備成凍干粉后，再定量至蛋白含量為100yg/mL。取革蘭氏陽性菌，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus)，以及革蘭氏陰性菌，大腸桿菌 K88 (Escherichia coli), 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，鰻弧菌(Vibrio anguillarium)，銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)禾口嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)作為指示菌。將這些細菌在LB液體培養基中37°C、200rpm過夜培養，稀釋至0D_為0. 001左右，菌濃度約為 3. OX 109CFU/ml。取100 μ L上述所選菌液與20mL、50°C的LB固體培養基迅速混勻，并鋪平板冷卻，再進行如下試驗試驗一在含有上述某一特定指示菌的平板上，放置2個無菌牛津杯，分別加入 100 μ L重組SjLys-N原液和經100°C、加熱40min處理的重組SjLys-N溶液。試驗二在含有上述某一特定指示菌的平板上，放置2個無菌牛津杯，分別加入 100 μ L重組SjLys-N原液和陰性對照樣品溶液。將所有試驗的平板置于30°C過夜培養，測量抑菌圈。試驗重復三次，結果取平均值。表1所示為重組海參溶菌酶N端多肽及加熱處理后的該產品的抑菌圈大小，結果發現該重組海參溶菌酶N端多肽對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用，尤其對海產品中常見的革蘭氏陰性致病菌弧菌有明顯的抑制作用，而且加熱失活后的SjLys-C對革蘭氏陰性菌和陽性菌的抑菌能力基本保持不變，說明該產品具有較好的熱穩定性，這對海參溶菌酶多肽作為飼料添加劑的應用非常有益。表1重組SjLys-N多肽抑菌活性測定
權利要求
1.重組海參溶菌酶N端多肽的引物序列，其特征在于引物序列分別為，正向引物SEQ ID NO 1 ；反向引物:SEQ ID NO :2。
2.一種重組海參溶菌酶N端多肽的質粒，其特征在于，制備方法包括以溶菌酶SjLys 基因為模板，將權利要求1所述的引物序列所擴增的基因片段連接至大腸桿菌表達載體 pET32a(+)中，構建重組表達質粒。
3.—種表達重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌，其特征在于，制備方法包括將權利要求2所述的質粒轉化Rosetta(DE;3)pLysS宿主細胞獲得重組基因工程菌。
4.一種重組海參溶菌酶N端多肽的制備方法，其特征在于，制備方法包括①誘導表達培養權利要求3所述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導表達；②分離和純化收集步驟①所得產品，經鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產品。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，誘導表達和分離純化的條件包括③誘導表達將權利要求3所述的重組基因工程菌在優化的液體培養基中，37°C、160rpm振蕩培養至OD6tltl達0. 6-0. 8，再向培養體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L, 28°C、150rpm誘導培養》1，收集發酵液；其中，優化的液體培養基是指在LB培養基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分離和純化將步驟③收集的發酵液離心，收集并洗滌菌體，反復凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體， 并加入Triton X-100至終濃度為1 %后，經冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為51^^的肌11丨？0儀超濾膜將蛋白濃縮至8 1011^/1^ ；再將濃縮樣品經kphadex G-25 凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶N端多肽的產品。
6.根據權利要求4或5所述的方法獲得的重組海參溶菌酶N端多肽。
7.如權利要求6所述的重組海參溶菌酶N端多肽在制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、海水養殖生產領域中的應用。
全文摘要
本發明涉及對來源于海刺參(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)基因(GenBank注冊號為EF036468)進行N端多肽的重組表達。首先構建出重組表達質粒pET-32a-SjLys-N，再轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS細胞，獲得一株高效表達重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌。利用該基因工程菌生產的溶菌酶N端多肽，經發酵培養基及發酵條件的優化，其表達產物具有50％以上的可溶性，產品收率高。生產的重組海參溶菌酶N端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是該產品經100℃加熱40min處理后，它的抗菌活性基本保持不變，這對開發海參溶菌酶多肽作為飼料添加劑非常有利。
文檔編號C12N15/70GK102559672SQ201210055509
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者叢麗娜, 常藝海 申請人:大連工業大學