專利名稱：鹿茸毛細管電泳dna指紋圖譜及鑒定方法
技術領域：
本發明涉及中藥材鑒定技術，具體地說是一種鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜及鑒定方法。
背景技術：
鹿茸為傳統名貴中藥材，《中國藥典》(2010年版)規定其正品為鹿科動物梅花鹿 Cervus nippon Temminck或馬鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生鸞毛的幼角，有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效。由于其價格昂貴、需求量大，市場上常有混偽品出現。 目前，鹿茸主要依據外部形態、顯微特征和理化性狀等進行鑒別。雖然這些方法在一定程度上能對鹿茸的鑒別和質量評價提供依據，但需要豐富的鑒別經驗，主觀性較強。此外，由于鹿類中藥材在干燥和制成飲片過程中性狀的可塑性很大，導致理化性狀鑒別效果不理想， 難以滿足對鹿茸鑒定的準確、快速和客觀的要求。因此，為鹿茸的真偽鑒別提供一種簡便實用、準確性高的方法尤為重要。DNA指紋圖譜是指具有種質特異性、能夠鑒別生物個體之間差異的電泳圖譜，具有特異性強、樣品用量少等優點，非常適用于中藥(尤其是名貴中藥材)易混品種的鑒別。目前廣泛應用于構建DNA指紋圖譜的分子標記方法主要包括限制性內切酶酶切片段長度多態性(RFLP)分析、隨機擴增DNA多態性(RAPD)分析、小衛星DNA (VNTR)技術、微衛星(SSR) 技術和擴增片段長度多態性(AFLP)分析。由于RFLP、VNTR和SSR技術復雜且需要了解實驗材料的遺傳背景，AFLP已被申請專利保護，因此這些技術在生產和應用上均受到一定程度的限制。而RAPD技術由于可以在沒有任何分子生物學研究基礎的情況下對某一物種進行 DNA指紋圖譜的構建和遺傳多樣性的研究，且多態性豐富、DNA用量少、經濟簡便，因而近年來在品種資源鑒定方面得到了廣泛應用。目前，國內外已有利用RAH)技術構建物種DNA指紋圖譜的相關研究報道，但這些研究普遍存在以下幾點不足I.重復性和穩定性較差許多因素均會影響RAPD分析的擴增結果，導致分析結果重復性和穩定性較差。2.檢測技術滯后目前RAPD擴增產物分析主要采用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種方法。瓊脂糖凝膠電泳分辨率和靈敏度均較低，很大程度上掩蓋了擴增產物的多態性，并且DNA的用量較大，使用的染料毒性也較大。聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率和靈敏度均較高，但操作繁瑣(包括組裝、灌膠、電泳、卸膠、染色等步驟)、耗時(整個過程需要幾小時到幾天)，使分析效率較低。因此，目前常用的檢測技術尚不能滿足RAro擴增產物分析需要的高分辨率、高靈敏度、簡便、快速等要求，缺乏合適的檢測手段已嚴重制約了 RAPD技術在構建物種DNA指紋圖譜方面的應用。3.鑒定方法不合理目前利用RAPD技術對物種進行鑒定時，通常是在電泳圖譜中選擇部分具有代表性的擴增條帶，根據這些條帶的有、無進行鑒定。這種方法雖然使結果分析變得簡單，但卻降低了擴增產物的多態性，增加了假陽性結果出現的幾率。而且人為的選擇部分擴增條帶而舍棄其它條帶，還降低了分析結果的客觀性。此外，這種鑒定方法只能反映擴增條帶的有無，不能反映擴增條帶強弱的區別。由于上述原因，目前利用RAro技術構建物種DNA指紋圖譜及進行物種鑒定的相關報道只有理論研究意義，尚不能進行實際應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜及鑒定方法，以解決現有技術的缺陷。本方法分辨率高、靈敏度高、操作簡便、快速、安全、結果準確，能夠用于鹿茸樣品的鑒定。本發明的目的是由以下技術方案來實現的一種鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜的建立方法，其特征是，它包含下述步驟I) DNA提取取鹿茸片，按鹽析法提取其線粒體DNA ；2)PCR擴增對10-mer引物進行篩選，應用300對引物，對上述DNA進行擴增；3)PCR產物鑒定擴增產物進行毛細管電泳分析，記錄電泳圖譜；4)鹿茸DNA指紋圖譜的建立根據電泳圖譜中各引物的擴增情況，選擇有代表性的多態性RAPD電泳圖譜構建鹿茸DNA指紋圖譜。一種鹿茸DNA指紋鑒定方法，其特征是，它包含下述步驟I)先建立鹿茸DNA標準指紋圖譜，方法如下(a)DNA提取取鹿茸對照藥材，按鹽析法提取其線粒體DNA ；(b)PCR擴增對10-mer引物進行篩選，應用300對引物，對上述DNA進行擴增；(c)PCR產物鑒定擴增產物進行毛細管電泳分析，記錄電泳圖譜；(d)鹿茸DNA標準指紋圖譜的建立根據電泳圖譜中各引物的擴增情況，選擇有代表性的多態性RAPD電泳圖譜構建鹿茸DNA標準指紋圖譜；2)測定樣品DNA指紋圖譜以上述相同的方法測定待測鹿茸樣品，得樣品DNA指紋圖譜；3)結果鑒定利用相似度分析軟件比較樣品DNA指紋圖譜與鹿茸DNA標準指紋圖譜的相似度，根據相似度對鹿茸樣品進行真偽鑒定。本發明與現有技術相比，具有以下優點I.本發明將RAPD技術簡便易行、信息量大的特點和高效毛細管電泳快速、分辨率高、靈敏度高的特點結合起來，并將其用于中藥材鹿茸的DNA指紋圖譜及指紋鑒定方法的建立，這在鹿茸鑒定的應用方面屬于首創。2.本發明采用高效毛細管電泳技術分析RAPD擴增產物，與目前常用的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，高效毛細管電泳具有靈敏度高、分辨率高、分析速度快、重復性和穩定性好、樣品用量小、成本低、不使用放射性同位素和劇毒試劑等優點。該方法克服了瓊脂糖凝膠電泳分辨率和靈敏度低、DNA用量大的缺點和聚丙烯酰胺凝膠電泳操作繁瑣、耗時長的缺點，是一種更適合于RAPD擴增產物分析的檢測技術。3.本發明以鹿茸對照藥材的原始電泳圖譜構建鹿茸DNA標準指紋圖譜，不進行人為的刪減或修改，保證了指紋圖譜的完整性，使鑒定結果更準確和客觀。4.由于本發明DNA指紋圖譜以圖的形式表示，看起來比較直觀、易懂；并由于對樣品進行鑒定時利用相似度分析軟件，根據相似度對鹿茸樣品進行真偽鑒定，更容易實現自動化分析。


圖I鹿茸(梅花鹿)DNA標準指紋圖譜圖2鹿茸(馬鹿)DNA標準指紋圖譜
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，下面實施例僅用于說明本發明而并非對本發明的限制。實施例I 鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜的建立I. DNA 提取取鹿茸片，用70%的酒精清洗3min，放在37°C烘箱中使酒精揮發，研磨成粉末， 稱O. Ig細粉放入離心管中，加入500 μ L裂解液，15 μ L蛋白酶K(20mg/ml)和30 μ L 10% SDS，56°C水浴震蕩過夜；取出加500 μ L飽和乙酸鈉，振動lOmin，11000r/min離心IOmin, 去沉淀，取上清再離心一次，然后取上清加等體積異丙醇，混勻，-20°C放置Ih ;取出配平， 12000r/min離心IOmin,去上清留沉淀,干燥,沉淀中加入500 μ L 70%乙醇，10000r/min離心lOmin，去上清留沉淀，干燥；將提取的DNA用80 μ L雙蒸水溶解，-20°C保存。2. PCR 擴增用梅花鹿茸做模板對300個OPERON公司的10_mer引物進行篩選，從中選出15個擴增穩定、多態性豐富的引物，再分別對鹿茸樣品進行擴增。PCR 反應體系為10 X PCR buffer (含 Mg2+) 3 μ l.dNTPs 2. 4 μ I、引物 I μ 1、0· 2μ g Taq DNA 聚合酶、O. 5 μ g DNA 模板。循環參數設置為94°C預變性5min，94°C變性80sec，36°C退火lmin，72°C延伸 2min，45個循環后72°C延伸lOmin。首次循環95°C變性3min，4°C保存。3. PCR產物鑒定將步驟2中的PCR擴增產物進行毛細管電泳分析，具體步驟如下3. I儀器、試劑安捷倫毛細管電泳系統(Agilent HP 3D/CE);安捷倫DAD檢測器(Agilent diode-array detector);安捷倫化學工作站(Agilent ChemStation software package)。羥丙基甲基纖維素(HPMC)、四丁基磷酸銨(TBAP)為色譜純、乙二胺四乙酸 (EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉為分析純、去離子水。梅花鹿鹿茸對照藥材(吉林市鹿場提供并經吉林市藥檢所鑒定)，馬鹿鹿茸對照藥材(吉林市藥檢所提供并鑒定)，市售鹿茸(吉林市參茸市場隨機采購)，常見偽品鹿茸(吉林市藥檢所和中國農科院左家特產研究所提供并經吉林市藥檢所鑒定)。3. 2樣品處理取上述PCR擴增產物10 μ I，用電泳緩沖液稀釋10倍，經0. 45 μ m微孔濾膜過濾，
濾液作為供試品溶液。
3. 3電泳條件色譜柱50cmX 75 μ m，有效長度40cm的未涂層石英毛細管柱(河北永年銳灃色譜器件有限公司)；電泳緩沖液20mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 3)-15mM TBAP_2mM EDTA-I% (w/v)HPMC ；分離電壓-8KV ;溫度25°C ;檢測波長；260nm ；進樣條件電動進樣，-IOkV, 15S。4.鹿茸DNA指紋圖譜的建立根據步驟3所得電泳圖譜中各樣品各引物的擴增情況，挑選具有代表性(穩定性和重復性良好、樣品峰數量適中、分離度好、分析時間短且各樣品彼此區別明顯)的電泳圖譜，構建鹿茸DNA指紋圖譜。梅花鹿茸、馬鹿茸及常見偽品鹿茸均有其特異的DNA指紋圖譜， 可以把它們彼此區分開。分別記錄梅花鹿茸和馬鹿茸的電泳圖譜，作為鹿茸DNA標準指紋圖譜，此標準指紋圖譜可用于鹿茸樣品的鑒定(見圖I、圖2)。實施例2將本發明的鹿茸DNA指紋鑒定方法用于某個鹿茸樣品的鑒定假設現有一批鹿茸樣品不能確定是否是真正的梅花鹿茸，因此，按照如下方法對它進行鑒定。鹿茸DNA標準指紋圖譜建立以后，要對某個樣品進行鑒定時，首先用鹽析法提取其線粒體DNA ;用提取的DNA作為模板，用篩選出的引物對其進行PCR擴增；擴增產物進行毛細管電泳分析并記錄電泳圖譜，即得該批待測樣品的DNA指紋圖譜；利用相似度分析軟件比較待測樣品DNA指紋圖譜與梅花鹿茸DNA標準指紋圖譜的相似度，根據相似度對待測樣品進行鑒定。鑒定結果若二者相似度大于95% (含95% )，這批樣品就是真正的梅花鹿茸；若二者相似度小于95%，那么這批樣品就不是真正的梅花鹿茸。實施例3將本發明的鹿茸DNA指紋鑒定方法用于某個鹿茸樣品的鑒定假設現有一批鹿茸樣品不能確定是否是真正的馬鹿茸，因此，按照本發明的方法構建這批樣品的DNA指紋圖譜，然后利用相似度分析軟件比較待測樣品DNA指紋圖譜與馬鹿茸DNA標準指紋圖譜的相似度，根據相似度對待測樣品進行鑒定。鑒定結果若二者相似度大于95% (含95% )，這批樣品就是真正的馬鹿茸；若二者相似度小于95%，那么這批樣品就不是真正的馬鹿茸。
權利要求
1.一種鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜的建立方法，其特征是，它包含下述步驟DDNA提取取鹿茸片，按鹽析法提取其線粒體DNA ；2)PCR擴增對10-mer引物進行篩選，應用300對引物，對上述DNA進行擴增；3)PCR產物鑒定擴增產物進行毛細管電泳分析，記錄電泳圖譜；4)鹿茸DNA指紋圖譜的建立根據電泳圖譜中各引物的擴增情況，選擇有代表性的多態性RAPD電泳圖譜構建鹿茸DNA指紋圖譜。
2.一種鹿茸DNA指紋鑒定方法，其特征是，它包含下述步驟1)先建立鹿茸DNA標準指紋圖譜，方法如下(a)DNA提取取鹿茸對照藥材，按鹽析法提取其線粒體DNA(b)PCR擴增對10-mer引物進行篩選，應用300對引物，對上述DNA進行擴增；(c)PCR產物鑒定擴增產物進行毛細管電泳分析，記錄電泳圖譜；(d)鹿茸DNA標準指紋圖譜的建立根據電泳圖譜中各引物的擴增情況，選擇有代表性的多態性RAPD電泳圖譜構建鹿茸DNA標準指紋圖譜；2)測定樣品DNA指紋圖譜以上述相同的方法測定待測鹿茸樣品，得樣品DNA指紋圖3)結果鑒定利用相似度分析軟件比較樣品DNA指紋圖譜與鹿茸DNA標準指紋圖譜的相似度，根據相似度對鹿茸樣品進行真偽鑒定。
3.如權利要求I和權利要求2所述的鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜及鑒定方法，其特征是，所述鹿茸DNA標準指紋圖譜為梅花鹿鹿茸DNA指紋圖譜或馬鹿鹿茸DNA指紋圖譜。
4.如權利要求2所述的鹿茸DNA指紋鑒定方法，其特征是，結果鑒定是利用相似度分析軟件比較樣品DNA指紋圖譜與鹿茸DNA標準指紋圖譜的相似度，根據相似度對鹿茸樣品進行真偽鑒定。
5.一種權利要求I和權利要求2所述的鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜及鑒定方法，可應用于鹿茸樣品的真偽鑒定。
全文摘要
本發明涉及中藥鑒定技術領域，具體為一種鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜及鑒定方法。鹿茸毛細管電泳DNA指紋圖譜包括DNA提取、PCR擴增、PCR產物鑒定，最終構建鹿茸DNA指紋圖譜；鹿茸DNA指紋鑒定方法包括鹿茸DNA標準指紋圖譜的建立、樣品DNA指紋圖譜的建立、利用相似度軟件進行結果鑒定。該指紋圖譜及鑒定方法可用于鹿茸樣品的鑒定。本發明能從遺傳本質上對鹿茸進行真偽鑒定，鑒定方法具有簡便、快速、結果可靠等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102586448SQ201210055368
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者傅桂蓮, 張麗華, 李洪宇, 苑廣信, 谷玉娟 申請人:北華大學