專利名稱：檢測樣品中的甲基化dna的方法
檢測樣品中的甲基化DNA的方法
技術領域：
本發明涉及從含DNA的樣品檢測甲基化DNA的方法。
背景技木高等真核生物的染色體DNA中已知構成DNA的堿基之中C(胞嘧啶)的5位被甲基化。這樣的DNA的甲基化作為基因表達的控制結構發揮功能。例如，在某基因的啟動子 區域存在的富含CpG序列的區域(也稱為“CpG島”或“ CG島”)被甲基化時，其基因的轉錄被抑制。此現象也稱為“基因的沉默”。對此，當CpG島不被甲基化時，由于轉錄因子可結合到啟動子，從而基因的轉錄變得可能。如上所述，DNA的甲基化是基因表達的控制結構之一。即，DNA的甲基化在初期胚發生、組織特異性的基因的表達、作為哺乳動物中特征性的現象的基因印跡及X染色體的失活、染色體的穩定化、DNA復制之時機等各種各樣的生理的及病理性的現象中實現重要的作用。再者近年明白，DNA的甲基化的異常、即，由DNA的甲基化所致的基因的沉默，與癌等的疾病相關。因此，對于各種的基因檢測甲基化DNA的重要性近年越發增加。檢測甲基化DNA的方法在所述技術中已知各種方法,可例舉例如亞硫酸氫鹽測序法、使用甲基化感受性限制酶的方法、使用甲基化DNA免疫沉降的方法(MeDIP法)等。亞硫酸氫鹽測序法是通過亞硫酸氫鹽的作用將DNA中的非甲基化胞嘧啶變換為尿嘧啶，通過確定堿基序列，檢測DNA中的被甲基化的部位。使用甲基化感受性限制酶的方法是利用甲基化感受性限制酶不可切斷被甲基化的識別序列的特點，通過檢查其切斷結果來檢測甲基化DNA。MeDIP法是使用特異性地識別甲基化DNA的抗體或甲基化DNA結合蛋白質來進行免疫沉降，通過將得到的甲基化DNA供于微陣列解析等來檢測甲基化DNA。再有，此方法也被稱為MeDIP-Chip法。在特開2008-263961號公報中公開了在使用甲基化感受性限制酶的檢測甲基化DNA的方法中，使用抗甲基化DNA抗體將樣品中的甲基化DNA固定到固相，用甲基化感受性限制酶進行消化處理的方法。如此，甲基化DNA的檢測的重要性增加，期望新的檢測甲基化DNA的方法的開發。
發明內容本發明的范圍僅由隨附的權利要求定義，且不以任何程度受此發明內容部分的影響。本發明旨在提供用于檢測樣品中的甲基化DNA的新的方法。本發明人驚人地發現，通過使可結合到甲基化DNA的蛋白質和甲基化DNA結合，該甲基化DNA不被脫氧核糖核酸酶完全地分解而殘留，再者得到的脫氧核糖核酸酶分解產物不給檢測步驟帶來影響，從而完成本發明。S卩，本發明是(I)檢測樣品中的甲基化DNA的方法，其包括
使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結合的蛋白質接觸，從而使上述樣品中的甲基化DNA和上述蛋白質結合；使通過上述結合步驟得到的樣品和至少I種脫氧核糖核酸酶接觸，而將上述樣品中的DNA分解 '及在通過上述分解步驟得到的樣品中，通過與上述蛋白質的結合來檢測不被上述脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA ;其中上述脫氧核糖核酸酶的至少I種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。(2)⑴所述的方法，其中上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是抗甲基化DNA抗體或甲基化DNA結合蛋白質。 (3)⑴所述的方法，其中上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是抗甲基化DNA抗體。(4) (I)所述的方法，其中上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是選自下列的至少I種甲基化DNA結合蛋白質MBD1、MBD2、MBD4 及 MeCP2。(5) (I) ⑷之任一項所述的方法，其中上述樣品是由培養細胞株或從活體采集的血液、體液、組織或細胞制備的樣品。(6) (I) ⑷之任一項所述的方法，其中上述脫氧核糖核酸酶是選自下列的至少I種脫氧核糖核酸酶I、外切核酸酶I、λ -外切核酸酶、Τ7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、緑豆核酸酶、微球菌-核酸酶及T7內切核酸酶。(7) (I) ⑷之任一項所述的方法，其中上述樣品是有含單鏈甲基化DNA的可能性的樣品，在檢測上述甲基化DNA的步驟中，檢測單鏈甲基化DNA。(8) (I) ⑷之任一項所述的方法，其中在檢測上述甲基化DNA的步驟中，使用核酸擴增法、堿基測序法或微陣列法來檢測甲基化DNA。根據本發明可提供用于檢測樣品中的甲基化DNA的新的方法。根據本發明還可省略在以往的檢測甲基化DNA的方法中對于檢測精度的升高必要的清洗操作及純化操作。此時，可更簡便地檢測樣品中的甲基化DNA。

圖I是伴隨以作為合成寡核苷酸的6MeCG寡核苷酸的溶液作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用DNaseI的本發明的檢測方法，通過PCR法檢測該寡核苷酸的電泳照片。圖2是伴隨以作為合成寡核苷酸的6MeCG寡核苷酸的溶液作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用外切核酸酶I的本發明的檢測方法，通過PCR法檢測該寡核苷酸的電泳照片。圖3是伴隨以從乳癌細胞株MCF7得到的基因組DNA作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用DNaseI的本發明的檢測方法，通過PCR法檢測甲基化DNA的電泳照片。
圖4是伴隨以從MCF7細胞得到的基因組DNA作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用外切核酸酶I的本發明的檢測方法，通過PCR法檢測甲基化DNA的電泳照片。實施方式
以下參照

本發明的優選實施方式。本說明書中“CpG部位”是指在DNA的堿基序列中，胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)在從5’向3’的方向依此順序鄰接的部位。再有，CpG的“p”的文字表示胞嘧啶和鳥嘌呤之間的
憐Ife~■酷鍵。本說明書中“甲基化CpG部位”是指胞嘧啶的5位被甲基化修飾的CpG部位。即，在甲基化CpG部位，5-甲基胞嘧啶(甲基化胞嘧啶)和鳥嘌呤在從5’向3’的方向依此順序鄰接。本說明書中“甲基化DNA”是指含至少I個5-甲基胞嘧啶的DNA。在本發明的檢測樣品中的甲基化DNA的方法(以下也稱為“檢測方法”)中，首先，使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結合的蛋白質接觸。通過此接觸，在該樣品中存在甲基化DNA之時,可使甲基化DNA和上述的蛋白質結合(以下，將此步驟稱之為“結合步驟”)。在一方面，本發明的檢測方法是體外方法。在本發明的檢測方法中，與上述的蛋白質結合的甲基化DNA不被以下的步驟中使用的脫氧核糖核酸酶完全地分解。即，通過與上述的蛋白質的結合，甲基化DNA中的5-甲基胞嘧啶及其周邊區域免于被脫氧核糖核酸酶分解。提供于本發明的檢測方法的樣品只要是有含甲基化DNA的可能性的樣品，就不特別限定。那樣的樣品而言，可例舉例如，從活體樣品制備的含有DNA的樣品、含有含至少I個5-甲基胞嘧啶的合成多核苷酸的樣品等。活體樣品而言，可例舉例如培養細胞株、從活體采集的血液、體液、組織、細胞等。本說明書中“血液”是全血、以及從其得到的血清及血漿之任何也可。在本說明書中，“組織”及“細胞”包括從活體采集的組織及細胞的培養物。當有含甲基化DNA的可能性的樣品是由從活體采集的血液、體液、組織或細胞制備的樣品時，本發明的檢測方法的結果可在與DNA的甲基化關聯的疾病的診斷或判斷中利用。在本發明的實施方式中，從活體樣品的含有DNA的樣品的制備可根據所述技術中公知的方法來進行。例如，可將含使細胞或組織可溶化的表面活性劑(膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉等)的可溶化液和活體樣品混合之后，實施物理處理(攪拌、均化、超聲波破碎等)來使活體樣品中含的DNA游離到可溶化液中，通過提取DNA來制備樣品。在本發明的實施方式中，將提取的DNA通過所述技術中公知的方法純化也可。從活體樣品的DNA的提取及純化使用市售的試劑盒進行也可。在本發明的實施方式中，樣品中的DNA優選是100 IOOObp左右的DNA片段。通過將樣品中含的DNA片段化成那樣的長度，可使甲基化DNA和可結合到甲基化DNA的蛋白質有效結合。DNA的片段化可通過物理處理、化學處理、限制酶處理等的所述技術中公知的方法來進行。物理處理而言，可例舉例如超聲波破碎。化學處理而言，可例舉例如使用氫氧化鈉的堿處理。限制酶處理中，可基于目的DNA的堿基序列適宜選擇限制酶，例如可使用MseI、BamHI等。在本發明的實施方式中，優選通過物理處理將樣品中的DNA片段化。
在本發明的實施方式中，有在樣品中含的可能性的甲基化DNA是單鏈甲基化DNA也可。即，上述的樣品是有含單鏈甲基化DNA的可能性的樣品，后述的檢測甲基化DNA的步驟是檢測單鏈甲基化DNA的步驟時，也包括在本發明的范圍內。在本發明的實施方式中，在上述的結合步驟之前，也可進行將樣品中含的DNA變性為單鏈的操作。那樣的操作在所述技術中公知，例如，可通過將有含甲基化DNA的可能性的樣品加熱至95°C左右之后，快速冷卻至4°C，而將樣品中的DNA變成單鏈。在本發明的實施方式中，可與甲基化DNA結合的蛋白質只要是可識別并結合DNA中的5-甲基胞嘧啶或甲基化CpG部位的蛋白質，就不特別限定。那樣的蛋白質而言，可例舉例如抗甲基化DNA抗體、甲基化DNA結合蛋白質等。在它們之中，也優選抗甲基化DNA抗體。特別是，在檢測單鏈的甲基化DNA之時，優選使用抗甲基化DNA抗體。抗甲基化DNA抗體而言，可例舉抗甲基化胞嘧啶抗體及抗甲基化CpG抗體。在本發明的實施方式中，抗甲基化胞苷抗體也可作為抗甲基化DNA抗體來使用。 在本發明的實施方式中，抗甲基化DNA抗體也可為多克隆抗體及單克隆抗體之任何。另外，作為抗甲基化DNA抗體而言，使用通過將抗甲基化DNA抗體片段化而得到的活性片段也可。那樣的活性片段只要是不失向甲基化DNA的特異性結合活性的片段，就不特別限定，可例舉例如Fab片段、F(ab' )2片段、sFv片段等。活性片段，例如，可通過將純化的抗甲基化DNA單克隆抗體用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切斷來制備。在本發明的實施方式中，使用市售的抗甲基化DNA抗體也可。市售的抗甲基化DNA抗體而言，可例舉例如表I所示的抗體。表I
廠商抗體名克隆名免疫動物
Calbiochem抗-5-甲基胞嘧啶小鼠mAb16233D3小鼠
abeam5-甲基胞苷33D3小鼠
Eurogentec5-甲基胞苷單克隆小鼠
Aviva System Biology5-甲基胞喃淀33D3小鼠
Novus Biologicals胞卩密淀(5-甲基)多克隆羊
Diagenode5-甲基胞苷單克隆小鼠在本發明的實施方式中，使用通過所述技術中公知的方法制備的抗甲基化DNA抗體也可。抗甲基化DNA抗體，例如，可通過以下的順序制備。首先，將5-甲基胞嘧啶等的甲基化DNA作為免疫原，根據需要與佐劑一同施用于適宜的哺乳動物(例如大鼠、小鼠等)而免疫。接下來，從免疫的動物的脾臟細胞等，篩選產生對免疫原的抗體的抗體產生細胞來選擇。將得到的抗體產生細胞與骨髄瘤細胞融合而得到雜交瘤，通過將其篩選，可得產生有向甲基化DNA的特異性結合活性的抗體的雜交瘤。從將得到的雜交瘤的培養上清或該雜交瘤施用于小鼠的腹腔內而得到的腹水，可得抗甲基化DNA抗體。
產生抗甲基化DNA抗體的雜交瘤而言，可例舉例如，在獨立行政法人制品評價技術基盤機構(日本國千葉縣木更津市上總錸足2-5-8、郵政編碼292-0818)，于2009年8月25日以保藏號NITE BP-805保藏的雜交瘤SCR2、以及于2009年9月10日以保藏號NITEBP-810、保藏號NITE BP-811及保藏號NITE BP-812分別保藏的雜交瘤SCRl、SCR3及SCR6。
在本發明的實施方式中，可使用由上述的雜交瘤SCR1、SCR2、SCR3及SCR6產生的抗甲基化DNA抗體。甲基化DNA結合蛋白質而言，可例舉例如MBD1(甲基胞嘧啶結合域蛋白I)、MBD2(甲基胞嘧啶結合域蛋白2)、MBD4(甲基胞嘧啶結合域蛋白4)、MeCP2 (甲基CpG結合蛋白2)等。這些的蛋白質自體在所述技術中公知。在本發明的實施方式中，甲基化DNA結合蛋白質只要是可特異性地識別并結合甲基化DNA，是野生型的氨基酸序列中含I個以上的氨基酸的缺失、取代或附加的變異型也可。再有，那樣的變異型的制備方法本身在所述技術中公知。在本發明的實施方式中，有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結合的蛋白質的接觸可通過向樣品中添加該蛋白質來進行。在本發明的實施方式中，可與甲基化DNA結合的蛋白質的添加量不特別限定，只要是可確保此后的檢測步驟中可充分地檢測的甲基化DNA量的添加量即可。例如，樣品中的核酸含量是Ing 10 μ g時，抗甲基化DNA抗體的添加量是Ing 10 μ g左右即可。接觸條件(周圍溫度及時間)根據可結合到甲基化DNA的蛋白質的種類而不同，但通常于4 42°C進行10分鐘 24小時左右即可。在本發明的檢測方法中，使通過上述的結合步驟得到的樣品和至少I種脫氧核糖核酸酶接觸來分解該樣品中的DNA(以下，將此步驟稱之為“分解步驟”)。在此步驟中，未和可與甲基化DNA結合的蛋白質結合的DNA、S卩非甲基化DNA被脫氧核糖核酸酶分解，但與該蛋白質結合的甲基化DNA通過其結合而5-甲基胞嘧啶及其周邊區域不分解。即，在本發明的檢測方法中，通過上述的結合步驟及分解步驟可除去非甲基化DNA。在本發明的實施方式中，脫氧核糖核酸酶也可為內切核酸酶及外切核酸酶之任何。在本發明的實施方式中，作為脫氧核糖核酸酶也可使用限制酶。此時，DNA切斷部位限于該限制酶的識別區域。因此，將在分解步驟得到的樣品直接用于后述的檢測步驟時，要留意分解物不給之后的檢測步驟帶來影響。例如，通過使用多種限制酶，可充分地分解非甲基化 DNA。在本發明優選實施方式中，脫氧核糖核酸酶是選自下列的至少I種脫氧核糖核酸酶I (DNaseI)、外切核酸酶I、λ -外切核酸酶、Τ7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、緑豆核酸酶、微球菌-核酸酶及Τ7內切核酸酶。在本發明的檢測方法中，使用的脫氧核糖核酸酶的至少I種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。其中“可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶”是指可不切斷單鏈DNA中的含被甲基化的胞嘧啶的識別序列，僅切斷含未甲基化的胞嘧啶的識別序列的限制酶。那樣的限制酶而言，可例舉例如Hhal。
在本發明的實施方式中，通過上述的結合步驟得到的樣品和脫氧核糖核酸酶的接觸可通過向樣品添加脫氧核糖核酸酶來進行。在本發明的實施方式中，脫氧核糖核酸酶的添加量不特別限定，只要是在之后的檢測步驟中可充分地分解非甲基化DNA的添加量即可。例如，在樣品中的核酸含量是Ing 10μ g時，DNaseI的添加量是O. I 120U左右即可。接觸條件(周圍溫度及時間)根據脫氧核糖核酸酶的種類而不同，通常是于4 42°C進行10分鐘 24小時左右即可。在本發明的檢測方法中，通過上述的分解步驟得到的樣品直接在以下的檢測步驟中使用也可。因此，也可省略用于除去非甲基化DNA的清洗及甲基化DNA的純化。/在本發明的實施方式中，根據以下的檢測步驟中使用的檢測手段，實行以在上述的分解步驟得到的樣品中含的甲基化DNA作為模板的核酸擴增法也可。擴增DNA的方法本身只要是所述技術中公知的DNA擴增法，就不特別限定。可例舉例如IVT(體外轉錄)擴增法、SPIA(商標)擴增法、GenomiPhi擴增法等。在本發明的檢測方法中，通過與在上述的分解步驟得到的樣品中的，可結合甲基化DNA的蛋白質的結合來檢測不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA(以下，將此步驟稱之為“檢測步驟”)。本說明書中“檢測甲基化DNA的”是指檢測甲基化DNA中的目的CpG部位的甲基化的有無，確定甲基化DNA的堿基序列，及解析甲基化DNA中的CpG部位的甲基化的頻度。其中“甲基化的頻度”是指甲基化DNA中的目的區域中存在的全部的CpG部位或任意的CpG部位之中，甲基化CpG部位的數或其比例。在本說明書中，甲基化DNA的檢測是目的DNA的甲基化的判斷、甲基化DNA的堿基序列的確定、及甲基化DNA的一井解析等，只要是在上述的分解步驟不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA的檢測，就不特別限制。在本發明的實施方式中，檢測步驟中使用的方法只要是可檢測在上述的分解步驟不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA的方法，就不特別限定，可從所述技術中公知的方法適宜選擇。那樣的方法而言，可例舉核酸擴增法、堿基測序法、微陣列法等。例如，將核酸擴增法用于檢測步驟來判斷目的DNA的甲基化的有無之吋，使用設計成夾目的DNA中的CpG部位的引物組來實行PCR法，可判斷擴增產物中目的DNA的甲基化的有無。另外，通過定量PCR法，可定量樣品中的甲基化DNA含量。再者，將作為堿基測序法之一的高速測序法(第二代測序法)用于檢測步驟，則可一井解析甲基化DNA。那樣的高速測序法中使用的測序儀而言，可例舉例如ABI3730 X I (Life Technologies公司)、GSFLX Titanium (Roche 公司)、等。將微陣列法用于檢測步驟也可。此時，微陣列雖然不特別限定，但優選是DNA微陣列或DNA芯片。另外,使用GeneChip (注冊■商標)(Affymetrix公司)等市售的微陣列也可，使用通過所述技術中公知的方法制備的微陣列也可。將作為有從全基因組區域或指定的區域等間隔提取的堿基序列的探針配置成瓦狀的微陣列的鋪瓦陣列用于檢測步驟，則可一井解析甲基化DNA。在本發明的實施方式中，將微陣列法用于檢測步驟時，上述的樣品中的DNA優選用所述技術中公知的標記物質標記。從而，本發明的檢測方法再包括將樣品中的DNA標記的步驟也可。標記物質而言，可例舉熒光物質、生物素等的半抗原、放射性物質等。熒光物質而言，可例舉Cy3、Cy5、Alexa Fluor (商標)、FITC等。在微陣列法中，通過標記DNA而信號測定變得容易。所述技術中公知將DNA用標記物質標記的方法本身。上述的信號可根據微陣列的種類而為適宜的信號。例如，信號是在與微陣列的各探針雜交的DNA存在之時發生的電信號也可，如上所述樣品中的DNA被標記時，是從標記物質發生的熒光、發光、放射線等的信號也可。信號的檢測可通過通常的微陣列測定裝置中具備的掃描儀來進行。掃描儀而言，可例舉例如，GeneChip (注冊■商標)掃描儀30007G (Affymetrix公司)等。接下來根據實施例詳細地說明本發明，但本發明不限于這些實施例。實施例實施例I作為檢測對象的甲基化DNA，使用作為含6個5-甲基胞嘧啶的寡核苷酸的6MeCG寡核苷酸。以下示6MeCG寡核苷酸的堿基序列。< 6MeCG 寡核苷酸 >5' -CGAGGTCGACGGTATTGATm5cGAGTATm5cGATAGTm5cGATATm5cGATATm5cGATATm5cGATATACAACGTCGTGACTGG-3' (SEQ ID NO 1)(堿基序列中的“m5c”示5_甲基胞嘧啶。)(I)樣品的制備將IOpM的6MeCG寡核苷酸的水溶液作為6MeCG寡核苷酸溶液來制備。將6MeCG寡核苷酸溶液于95°C加熱10分鐘而使變性之后，在冰上靜置I分鐘。從變性的6MeCG寡核苷酸的溶液取2μ 1，將其作為輸入樣品。將殘留的溶液作為提供于本發明的檢測方法的樣
品O(2)樣品和抗甲基化DNA抗體的接觸將上述的樣品分成兩份，向ー份添加抗甲基化DNA抗體(Iyg)而作為待測樣品(100μ I),向另ー份不添加抗甲基化DNA抗體而作為對照樣品(ΙΟΟμΙ)。將各樣品于25 °C溫育2小吋。本實施例中使用的抗甲基化DNA抗體是從在獨立行政法人制品評價技術基盤機構(日本國千葉縣木更津市上總錸足2-5-8、郵政編碼292-0818)于2009年8月25日以保藏號NITEBP-805保藏的雜交瘤SCR2得到的單克隆抗體。(3)由脫氧核糖核酸酶的DNA的分解向上述的待測樣品及對照樣品各添加1μ I作為脫氧核糖核酸酶的I種的DNaseI (2U/μ I :ΝΕΒ公司)，于37°C反應I小時。反應后，通過將各樣品于75°C加熱10分鐘來使DNaseI失活。(4)甲基化DNA的檢測為了檢查樣品中是否殘留6MeCG寡核苷酸，進行定量PCR法。(i) PCR反應液的制備將下述的試劑混合而制備12 μ I的反應液。
權利要求
1.檢測樣品中的甲基化DNA的方法，其包括 使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結合的蛋白質接觸，從而使上述樣品中的甲基化DNA和上述蛋白質結合； 使通過上述結合步驟得到的樣品和至少I種脫氧核糖核酸酶接觸，而將上述樣品中的DNA分解 '及 在通過上述分解步驟得到的樣品中，通過與上述蛋白質的結合來檢測不被上述脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA ;其中 上述脫氧核糖核酸酶的至少I種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。
2.權利要求I所述的方法，其中 上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是抗甲基化DNA抗體或甲基化DNA結合蛋白質。
3.權利要求I所述的方法，其中 上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是抗甲基化DNA抗體。
4.權利要求I所述的方法，其中 上述可與甲基化DNA結合的蛋白質是選自下列的至少I種甲基化DNA結合蛋白質MBDI、MBD2、MBD4 及 MeCP2。
5.權利要求I 4之任一項所述的方法，其中 上述樣品是由培養細胞株或從活體采集的血液、體液、組織或細胞制備的樣品。
6.權利要求I 4之任一項所述的方法，其中 上述脫氧核糖核酸酶是選自下列的至少I種脫氧核糖核酸酶I、外切核酸酶I、λ -外切核酸酶、Τ7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、綠豆核酸酶、微球菌-核酸酶及Τ7內切核酸酶。
7.權利要求I 4之任一項所述的方法，其中 上述樣品是有含單鏈甲基化DNA的可能性的樣品， 在檢測上述甲基化DNA的步驟中，檢測單鏈甲基化DNA。
8.權利要求I 4之任一項所述的方法，其中 在檢測上述甲基化DNA的步驟中，使用核酸擴增法、堿基測序法或微陣列法來檢測甲基化DNA。
全文摘要
檢測樣品中的甲基化DNA的方法為了更簡便地得到甲基化DNA樣品，使用使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結合的蛋白質接觸，從而使樣品中的甲基化DNA和蛋白質結合，使得到的樣品和至少1種脫氧核糖核酸酶接觸而將樣品中的DNA分解，在得到的樣品中，通過與蛋白質的結合檢測不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA的方法。在此方法中，脫氧核糖核酸酶的至少1種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。
文檔編號C12Q1/68GK102653787SQ20121005573
公開日2012年9月5日 申請日期2012年2月28日 優先權日2011年2月28日
發明者梶田昌裕, 酒井綾子 申請人:希森美康株式會社