專利名稱：選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑及其制備方法。具體地說是在使用混合抑菌劑兩性霉素B、萘啶酮酸、萬古霉素、TMP基礎上添加乳酸鏈球菌素 (Nisin)抑制雜菌生長。本發(fā)明還涉及該混合抑菌劑的制備方法。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是一種彎曲狀的革蘭陰性桿菌，是引起消化道炎癥、潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤的主要致病菌，與胃癌的發(fā)生直接相關，被國際衛(wèi)生組織列為一級致癌因子。全世界約50%人群的胃粘膜有Hp感染，如何根除 HP所致的消化系統(tǒng)疾病已成為消化界學者關注的焦點。HP的生長條件要求非常苛刻，培養(yǎng)過程繁瑣、培養(yǎng)設備復雜、昂貴、培養(yǎng)技術要求高，雜菌生長多，給研究HP帶來很大的困難。目前對于幽門螺桿菌培養(yǎng)方法報道較多，HP的分離培養(yǎng)陽性率與培養(yǎng)基、氣體、 儀器、操作技術等有關。HP生長營養(yǎng)要求高，在一般的培養(yǎng)基上不生長，必須在營養(yǎng)豐富且加有血液的培養(yǎng)基上才可生長。常用的有血培養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂(CBA)、BHI、巧克力瓊脂、skirrow、空腸彎曲菌培養(yǎng)基等基礎上加5% -10%綿羊血(馬血或兔血)、兩性霉素B、 多粘菌素B、鹽酸萬古霉素、TMP以抑制雜菌生長。血液易污染、不便保存、來源受限，目前已研制出無血培養(yǎng)基用環(huán)糊精，卵黃、水解酪蛋白、西紅柿汁、酵母提取物和馬血清替代血液的HP分離培養(yǎng)基。不同的培養(yǎng)基其分離培養(yǎng)效果不同初步分離胃黏膜標本的HP陽性率含7%脫纖維鮮馬血的BHI培養(yǎng)基為96%，卵黃瓊脂為64%，含環(huán)糊精的CBA血瓊脂為32%。液體培養(yǎng)基常常由于氣體條件難于滿足而對培養(yǎng)設備要求高，培養(yǎng)過程復雜。目前HP分離培養(yǎng)基也從無血代替有血、從固體往液體發(fā)展。
HP生長的氣體條件苛刻，在空氣中、無氧條件都不生長，一般采用5% 0 2、10% CO2, 85%隊，有些地區(qū)還要加5%!12。濕度約為90%。最適生長溫度為371，低于271高于421 均不生長。HP在協(xié)迫條件下容易發(fā)生變異菌體從彎曲桿菌變?yōu)榍蛐汀⒔z狀型。球型變一般呈非可培養(yǎng)狀態(tài)，L型、絲狀體一般難于再培養(yǎng)。協(xié)迫條件包括培養(yǎng)時間延長、培養(yǎng)基水份、營養(yǎng)成分損失、培養(yǎng)基在空氣中放置時間過長、氣體條件不適、溫度不適、抗生素作用等不適宜HP生長的條件。其培養(yǎng)效果取決于氣體、濕度、溫度是否最適宜HP生長。經(jīng)查閱文獻，對于分離培養(yǎng)幽門螺旋桿菌常用的抑菌劑為單一的兩性霉素B、多粘菌素B、鹽酸萬古霉素、TMP或其組合物。乳酸鏈球菌素(Nisin)又稱乳鏈菌肽或尼生素，是從乳酸鏈球菌發(fā)酵產物中提取的一類多肽類化合物，由34個氨基酸殘基組成。它能有效地抑制致使食品腐敗的革蘭氏陽性菌的生長和繁殖，特別是對耐熱性芽孢桿菌、肉毒梭菌、李斯特菌及其所產生的芽孢有強烈的抑制效果，可用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐裝食品等的防腐保鮮。由于乳酸鏈球菌素是一種多肽，進入人體后易被植物蛋白酶分解，因此是一種安全、無毒、高效的天然食品防腐劑。對于Nisin (乳酸鏈球菌素)的應用，大多數(shù)文獻報道都用于食品防腐，至今未見用于幽門螺旋桿菌雜菌抑制劑的報道。本發(fā)明是在使用混合抑制劑兩性霉素B、萘啶酮酸、萬古霉素、TMP基礎上添加乳酸鏈球菌素抑制雜菌生長。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑，以解決幽門螺桿菌培養(yǎng)生長條件要求苛刻，培養(yǎng)過程繁瑣、培養(yǎng)技術要求高，雜菌生長多的問題。本發(fā)明的另一目的是提供所述選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑制備方法。實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下
一種選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑，其配方組成為萬古霉素3 50 mg/1， 萘啶酮酸 5 10. 0 mg/l，TMP3 5. 0 mg/1，兩性霉素 1 2. 0 mg/1, Nisin 8 10 mg/1。進一步，所述選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑的制備方法，主要包括下列步驟
1)培養(yǎng)基的配制
培養(yǎng)基配方930 ml/1腦心浸液培養(yǎng)基，80 ml/1胎牛血清，1. 0 g/li3_CD，0.04 g/1 TTC (四氮唑紅)，pH 7. 2-7. 4 ；
1. 1)按上述配方配制好培養(yǎng)基，裝入500 ml錐形瓶(300ml/瓶)，用封口膜將瓶口封緊，121°C高壓消毒15 30 min，待高壓鍋壓力降至0后，取出培養(yǎng)瓶，自然冷卻；
1. 2)解凍綿羊血，56°C、30 min滅活補體(為防止多次開啟，可用小瓶分裝成10 ml小包裝于-20°C保存?zhèn)溆?；
1.3)將步驟1. 1)冷卻至40°C左右的上述培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，加入預先配制好的選擇性抗生素(萬古霉素3-50 mg/1，萘啶酮酸5-10. 0 mg/l，TMP3_5· 0 mg/1，兩性霉素 1-2.0 mg/1, Nisin 8-10 mg/1)和步驟 1. 2)解凍的綿羊血(8% 10%) (ml/100ml,體積分數(shù))；再將該無菌培養(yǎng)皿放置15 30 min,自然凝固后盡快封閉培養(yǎng)基，為防止污染，瓶口開啟時間盡可能短。；
2)細菌接種與培養(yǎng)
2.1)用吸管吸取0. Iml HP菌懸液，滴于步驟1. 3)的固體培養(yǎng)基上，用L形棒涂開；
2. 2)將步驟2. 1)已接種好的培養(yǎng)皿放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐，蓋緊頂口，使用氣體發(fā)生袋；或采用抽氣換氣法，將培養(yǎng)罐內氣壓抽至O或接近0，立即沖入混合氣體(5% O2,10% CO2，85% N2 )，沖混合氣體的速度不能太快，以免雜菌充入污染，側口處塞一滅菌棉花團，可防止污染；
2. 3)將步驟2. 2)培養(yǎng)罐置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)，72 h后觀察菌落生長情況；HP生長的最佳濕度>90%，為保證培養(yǎng)基的濕度，可在培養(yǎng)罐中放入裝有適量水的小燒杯，以維持培養(yǎng)基濕度；
3)細菌的保存選取對數(shù)生長期(一般為培養(yǎng)48h)的HP進行保存；用接種環(huán)刮取培養(yǎng)菌于保存液中， 調整細菌濃度(IXlO8 IXlO9CFU / ml)，保存液基質為腦心浸液和100%甘油；將菌液分裝至0.5 ml Ep管中，每管0.2 0.3 ml，置_70°C或液氮中保存。相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下有益效果
I、本發(fā)明制備以兩性霉素B、萘啶酮酸、萬古霉素、TMP及Nisin的混合抑菌劑，在培養(yǎng)基中加入混合抑菌劑不但能減少枯草桿菌、革蘭陽性球菌、霉菌等雜菌的污染，同時又能提供HP生長所需的胸腺嘧啶脫氧核苷抑制雜菌生長。II、本發(fā)明抑菌劑與現(xiàn)有文獻資料的抑菌劑相比，加入Nisin后明顯提高了抑菌效果
A、兩性霉素1-2.0 mg/1、萬古霉素 3-50 mg/1、萘啶酮酸 5-10 mg/1、ΤΜΡ3_5· 0 mg/1、 多粘菌素B 5-10 mg/1,有雜菌生長，抑制雜菌效果不明顯；
B、兩性霉素1-2.0 mg/1、萬古霉素 3-50 mg/1、萘啶酮酸 5-10. 0 mg/1、TMP3-5. 0 mg/ 1、Nisin 5-10 mg/1,無雜菌生長，抑制效果明顯。


圖1為未加抑菌劑空白培養(yǎng)皿照片。圖2為A組抑菌劑培養(yǎng)HP結果照片。圖3為B組抑菌劑培養(yǎng)HP結果照片。
具體實施例方式為表明本發(fā)明提高HP陽性率的效果，通過以下實施例對本發(fā)明進行進一步說明。選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑，其配方組成為萬古霉素3 50 mg/1, 萘啶酮酸 5 10. 0 mg/l，TMP3 5. 0 mg/1，兩性霉素 1 2. 0 mg/1, Nisin 8 10 mg/1。表1:(單位mg/1)
權利要求
1.一種選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑，其特征在于，其配方組成為萬古霉素 3 50 mg/1，萘啶酮酸5 10. 0 mg/1，TMP3 5. 0 mg/1，兩性霉素 1 2. 0 mg/1, Nisin 8 10 mg/1。
2.根據(jù)權利要求1所述選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑的制備方法，其特征在于，主要包括下列步驟1)培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基配方930 ml/1腦心浸液培養(yǎng)基，80 ml/1胎牛血清，1. 0 g/li3_CD，0.04 g/1 TTC, pH 7· 2 7· 4 ；·1. 1)按上述配方配制好培養(yǎng)基，裝入500 ml錐形瓶(300ml/瓶)，用封口膜將瓶口封緊，121°C高壓消毒15 30 min，待高壓鍋壓力降至0后，取出培養(yǎng)瓶，自然冷卻；·1.2)解凍綿羊血，56°C、30 min滅活補體；·1.3)將步驟1. 1)冷卻至40°C左右的上述培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，加入預先配制好的選擇性抗生素和步驟1. 2)解凍的綿羊血8 lOml/lOOml ；再將該無菌培養(yǎng)皿放置15 30 min，自然凝固后盡快封閉培養(yǎng)基；其中，選擇性抗生素配方為萬古霉素3 50 mg/ 1、萘啶酮酸 5 10. 0 mg/1、TMP3 5. 0 mg/1、兩性霉素 1 ·2. 0 mg/1 和 Nisin 8 10 mg/1 ；2)細菌接種與培養(yǎng)·2.1)用吸管吸取0. Iml HP菌懸液，滴于步驟1. 3)的固體培養(yǎng)基上，用L形棒涂開；·2. 2)將步驟2. 1)已接種好的培養(yǎng)皿放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐，蓋緊頂口，將培養(yǎng)罐內氣壓抽至0或接近0，立即沖入混合氣體；其中，混合氣體為5% O2,10% CO2和85% N2 ；·2. 3)將步驟2. 2)培養(yǎng)罐置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)，72 h后觀察菌落生長情況；HP生長的最佳濕度>90% ；3)細菌的保存選取對數(shù)生長期的HP進行保存；用接種環(huán)刮取培養(yǎng)菌于保存液中，調整細菌濃度為 IXlO8 IXlO9CFU / ml，保存液基質為腦心浸液和100%甘油；將菌液分裝至0.5 ml Ep 管中，每管0.2 0.3 ml，置-70°C或液氮中保存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑，其配方組成為萬古霉素3～50mg/l，萘啶酮酸5～10.0mg/l，TMP3～5.0mg/l，兩性霉素1～2.0mg/1,Nisin8～10mg/1。所述選擇性培養(yǎng)幽門螺旋桿菌的混合抑菌劑的制備方法，主要包括下列步驟培養(yǎng)基的配制、細菌接種與培養(yǎng)和細菌的保存。本發(fā)明以兩性霉素B、萘啶酮酸、萬古霉素、TMP及Nisin的混合抑菌劑，在培養(yǎng)基中加入混合抑菌劑不但能減少枯草桿菌、革蘭陽性球菌、霉菌等雜菌的污染，同時又能提供HP生長所需的胸腺嘧啶脫氧核苷抑制雜菌生長。
文檔編號C12R1/01GK102559565SQ201210058230
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權日2012年3月7日
發(fā)明者樂亮, 劉紅, 周慧, 張云玲, 林海珠, 江娟, 王寧, 王琳琳, 胡少南, 胥秀英, 鄭一敏 申請人:重慶理工大學