專利名稱：一種用于檢測基因變異的pcr引物設計方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子診斷技術領域，具體 涉及一種全新的、高效易控的PCR引物設計方法，以及利用該方法設計引物參與的癌癥基因檢測試劑盒和耐藥基因檢測試劑盒，利用該方法生產的試劑盒靈敏度高、重復性好、非常穩定可靠，適用于臨床癌癥基因檢測和篩查，以及耐藥基因的檢測。
背景技術：
基因變異在生物體中時刻發生，有的變異是無意義的，它不影響生物體正常生長，但是，有一些變異后果非常嚴重，給人類的生存帶來威脅。現代分子生物學實驗證實癌癥的發生是由于基因重組、突變或缺失等變異造成的。也有充分證據證明，病原微生物在某些條件下基因變異可以獲得某種耐藥抗性，給臨床治療帶來巨大麻煩。例如HBV拉咪呋啶耐藥基因突變、HIV耐藥基因變異、TB利福平耐藥基因變異、TB異煙肼耐藥基因變異、TB乙胺丁醇耐藥基因變異等。癌癥，也叫惡性腫瘤，它可以破壞組織、器官的結構和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終可能由于器官功能衰竭而死亡。人體內存在原癌基因和抑癌基因。原癌基因主管細胞分裂、增殖，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高等保守。抑癌基因負責控制細胞生長和增殖。平時，原癌基因和抑癌基因維持著平衡，但在致癌因素作用下，原癌基因的力量會變大，而抑癌基因卻變得弱小，導致細胞癌變。每年，癌癥在全球致死700萬人，我國也有100萬人因此失去生命。為了降伏這一絕癥，科學家們付出了極大努力。但直到現在，還是沒找到攻克癌癥的辦法。目前，靶向治療已經成為腫瘤臨床治療的重要手段。表皮生長因子受體(EGFR)是靶向治療的主要作用靶點。EGFR的靶向藥物包括EGFR抗單克隆抗體藥愛必妥、帕尼單抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑易瑞沙和特羅凱。這些藥物能通過抑制腫瘤發生發展中必須的表皮生長因子受體酪氨酸激酶阻斷腫瘤細胞的信號傳導，從而達到抑制腫瘤細胞的增生、侵襲、轉移、血管生成并促進腫瘤細胞的調亡。EGFR基因突變與酪氨酸激酶抑制類靶向藥物Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特羅凱)等的治療療效有顯著相關性。大多數EGFR基因突變患者的靶向藥物治療效果顯著。中國人非小細胞肺癌患者EGFR基因突變率為30%左右，為明確是否進行相應的靶向治療，有必要進行EGFR基因突變的檢測。非小細胞肺癌等腫瘤患者在進入個體化靶向治療療程之前應進行EGFR突變檢測，可為患者個體用藥提供用藥科學依據，降低治療風險、減輕患者負擔。但是，臨床試驗表明這些靶向藥物僅對部分病人有顯著療效。進一步的研究發現腫瘤組織中K-ras基因發生突變(體細胞突變)的病人對此類靶向藥物存在完全耐藥。因此，檢測病人K-ras基因是否突變成為決定能否使用EGFR靶向藥物的必要前提條件。ras基因家族與人類腫瘤相關的基因有三種H_ras、K-ras和N_ras,分別定位在11、12和I號染色體上。作為原癌基因的ras基因被激活后就變成有致癌活性的癌基因，ras基因通過突變而激活。其中，K-ras則對人類癌癥影響最大，它好像分子開關當正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則不受上游EGFR的信號影響，導致細胞持續生長，并阻止細胞自我毀滅。這也是具有突變型K-ras基因患者對抗EGFR藥物治療無效的理論基礎。K-ras突變的最常見的方式就是點突變，多發生在N端第12、13和61密碼子，占所有突變率的90%以上。K-ras基因的突變導致細胞逃逸凋亡，這種異常在胰腸癌、大腸癌、肺癌等腫瘤組織中發生率較高。據國外文獻報道，最高為胰外分泌腺癌，達90%，結腸癌為
40% 50 %，肺癌和膀胱癌為40 %，而胃癌較低在10 %以下。因此這幾種癌癥中K-ras基因野生型患者使用易瑞沙的療效也比較顯著，特別是結腸直腸癌，美國癌癥綜合網絡(NCCN)已把K-ras突變的檢測列為《結腸癌臨床治療指南》與《直腸癌臨床治療指南》臨床用藥必檢項目。研究表明，BRAF基因突變的患者接受EGFR-TKI藥物治療的有效率低。而且，BRAFV600E突變可導致部分K-ras基因野生型患者對EGFR-TKI及EGFR單抗藥物治療不敏感。因此檢測腫瘤患者BRAF基因突變情況可用于指導EGFR-TKI的靶向用藥。BRAF基因突變被 發現存在于黑色素瘤、大腸癌等多種惡性腫瘤中，可結合該患者EGFR、KRAS基因突變的檢測信息制定出最為適合病人個體的腫瘤治療方案。為臨床醫生用藥提供用藥科學依據，降低醫生治療風險以及患者經濟負擔。另外，隨著抗生素藥物濫用和個別病原微生物基因易變性，導致過去容易治療的感染性疾病變成難以治愈的疾病，例如超級細菌、多耐藥結核；還有一些病毒，如HBV、HIV,在用藥數月，甚至有的數周就可產生耐藥性。由于沒有進行基因變異監測，傳統的治療方案面對基因變異時，不能及時改變治療策略往往導致治療效果差、病情持續惡化的情況出現。由于上述基因變異存在，極大的影響了患者的生存和生活質量。科學工作者發明了許多檢測基因變異的方法，具體包括PCR-限制性酶切分析、PCR-SSCP分析、PCR-測序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-LDR、連接酶反應LDR、PCR-HRM分析、ARMS-PCR等。其中最為常用方法為PCR-限制性酶切分析、PCR-測序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-HRM分析、ARMS-PCR。PCR-限制性酶切分析是針對位點明確、且突變型與野生型在序列上至少存在一種酶切位點差異。PCR完成后，用該酶進行酶切后，測序鑒定。耗時、繁瑣，但靈敏度高。對于有些樣品由于野生型和突變型之間無差異酶切位點，導致該方法不可用。PCR-測序分析是突變檢測的金標準方法，可發現未知變異位點。實驗周期久、靈敏度低(10%左右^PCR-基因芯片分析是針對大量已知突變位點的有效方法，但是其靈敏度僅能做到5% 10%，且成本較高。PCR-HRM分析成本低、通量大，由于不能自動化分析結果，需實驗人員判讀，僅在科研中有所應用。ARMS-PCR是目前開發基因變異最為常用技術，系統中包含通用引物和變異區域特異引物(以后簡稱“變異引物”)。通用引物可與野生型和突變型同時結合、變異引物與基因變異區域完全互補，與野生型僅在3端有I 5個堿基的差異，因此基因變異的檢測完全依賴于變異引物的設計，變異引物的設計也決定了試劑盒的靈敏度和特異性(見圖I)。由于變異引物與野生型模板僅有I 3個堿基不互補，也存在一定幾率結合而發生錯誤引導的PCR合成，這種結合的概率很高，約為O. 1% 1%。一旦發生此類反應，則結果和試劑盒的可靠性將大大下降。影響此類反應的因素主要是核酸提取殘留鹽離子、模板濃度過高兩個，這兩個因素在實際應用中不是可控因素，因此無法在研究測試初期通過優化反應條件來降低。歐洲DXS基于ARMS-PCR/Scorpion系統開發的Κ-ras試劑已獲得CE認證，并在SFDA提出注冊申請。因此基于ARMS-PCR開發新的分子診斷試劑盒是一個較為可靠的方法。由于基因變異，面對復雜的基因變異，傳統的分子診斷方法顯得很無力，這是因為在此類基因變異樣品中，含有大量的野生型背景，從而為鑒別這些重要基因是否發生后果嚴重的變異帶來巨大麻煩。本發明旨在解決在大量野生型背景下，變異基因檢測引物的設計方法和試劑盒，為腫瘤患者和病原微生物感染者提供可選的、有效的診斷手段。本發明在ARMS-PCR基礎上開發新一代檢測方法，與ARMS-PCR/Scorpion系統比較，本發明的優點具體為I.野生型背景是突變型1000倍以上，仍然可以檢出突變型；2.本方法可與實時熒光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等技術聯合，用于分子診斷領域。

發明內容
本發明屬于分子診斷技術領域，具體涉及一種全新的、高效易控的PCR引物設計方法，以及利用該方法設計引物參與的癌癥基因檢測試劑盒和耐藥基因檢測試劑盒，利用該方法生產的試劑盒靈敏度高、重復性好，非常穩定可靠，適用于臨床癌癥基因檢測和篩查，以及耐藥基因的檢測。本發明包含三項相互獨立而又關聯的內容1. 一種用于基因變異的PCR引物設計方法，其特點是易于設計，可控性高且擴增靈敏度高；2.提供了一種全新的基因變異檢測試劑盒的設計理念；3.利用I和2所述內容開發的基因變異檢測試劑盒，該試劑盒與傳統測序檢測基因變異比較，具有靈敏度高(100倍以上)、特異性強、時間短(3小時內完成檢測)、操作步驟少的優點。本發明的基因變異的PCR引物設計方法，其特征在于ARMS-PCR引物設計中，在通用引物中附加一段與基因變異區域的野生型完全互補序列，該序列在PCR退火時，會優于針對變異基因設計的變異基因檢測引物退火到野生型上。本發明的最終目的是通過設計引物擴增目標序列，并用測序方法檢測K-ras密碼子12/13和61的突變情況，結合兩者突變的情況，指導腫瘤患者對易瑞沙、特羅凱等藥物的治療。根據本發明的基因變異檢測PCR引物設計方法，其特征在于通用引物可以引導一個DNA鏈合成，當此次合成DNA鏈野生型時，“變性一退火”后，可發生自身引導合成的DNA鏈內折疊，阻礙變異引物與野生型模板結合，稱之為阻遏ARMS-PCR系統。在此阻遏ARMS-PCR系統中，通用引物的5’端附加一段與變異引物高度同源、但與變異基因的野生型完全互補的寡核苷酸序列(見圖2)，該序列在分子內優先與變異基因的野生型結合，從而抑制或阻礙了變異引物與野生型結合的幾率(見圖3)，解決了變異引物特異性問題，從而極大的提高了變異弓I物的靈敏度。具體而言,如圖2所不,本發明的通用引物分為A、B兩部分，B部分為正常的PCR引物，A部分為與變異引物C相互競爭結合位點的寡核苷酸序列。通用引物B段與野生型模板D段和突變型模板F段完全互補，是PCR合成的一個引導鏈；變異引物C與突變型模板G’完全互補，是PCR合成的另一個引導鏈。H與H’區是設計熒光探針和雜交探針的位置；E和E’是野生型發生基因變異的位置。G和G’是E和E’發生基因變異的新序列。在適當的條件下，A部分與野生型E’結合效率高于變異引物C ;變異引物C更易于G’結合。特別是，反應完成第I個循環后(如圖3所示)，通用引物合成的野生型DNA鏈在“變性一退火”過程中，會自動形成發卡結構，從而屏蔽掉變異引物的結合位點。此類分子內折疊的效率通常比分子間結合效率高10倍以上，因此能取得較好的屏蔽效果。本發明公開的引物設計方法中引物設計參照通用的引物設計原則不允許引物間或/和引物內3’端出現5個以上堿基互補；變異引物的長度在15bp 25bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在42攝氏度 60攝氏度之間；優選變異引物的長度在16bp 22bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在48攝氏度 52攝氏度之間；通用引物B區的長度在15bp 25bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express3. O計算)在42攝氏度 60攝氏度之間；優選通用引物B區的長度在16bp 20bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在48攝氏度 52攝氏度之間；通用引物A區的長度在IObp 18bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在37攝氏度 55攝氏度之間；可能發生變異的區域設計在通用引物A區的較中間的位置。 依據本發明的引物設計方法設計的引物，可用于實時熒光PCR、PCR_ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等實驗中。與其他方法聯用，可開發多種基因變異檢測試劑盒。根據上述方法，本發明可以與實時熒光PCR技術設計各種用于基因變異(癌癥基因、耐藥突變等)檢測PCR試劑盒，其中包括dNTPs、二價陽離子、耐熱DNA聚合酶、緩沖體系、引物、探針等常規試劑，其特征在于、耐熱DNA聚合酶使用量為(O. 5 1)U/測試、二價陽離子濃度在(O. 5 I. 5)mM、KCl濃度為30 50mM、引物和探針各IOP/測試、10% Gly0PCR循環參數中退火溫度要高于變異引物Tm值10攝氏度 15攝氏度，保證變異引物的嚴謹性和封閉的效果。上述方法或應用，優先用于K-ras基因突變、EGFR外顯子18 20基因變異、Braf基因突變等的分子診斷。上述方法或應用，也優先用于HBV耐藥、HIV耐藥、TB耐藥等的分子診斷。


圖I是通用ARMS-PCR工作原理；圖2是本發明中阻遏ARMS-PCR中弓丨物設計原理；圖3是阻遏ARMS-PCR工作原理。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例I 一種鑒定K-ras密碼子12/13突變情況的方法
I.提取腫瘤患者組織基因組DNA ;2.進行PCR擴增，20 μ I PCR反應體系如下待測腫瘤組織基因組DNA50 lOOng，Taq 酶 O. 125μ 1，上下游引物和探針(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 緩沖液(含Mg2+) 1.5 μ 1，甘油10%，余下為無菌蒸餾水；PCR反應條件為95°C變性5min，隨后95°C變性10sec，58°C退火延伸35sec，進行45個循環，最后37°C延伸Imin ;在58°C進行熒光信號收集。3. PCR結果分析a. CT < 40，判定為陽性；
d. CT > 40，判定為陰性。
權利要求
1.ー種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法，具體為在基因高度同源和保守的區域設計正向PCR通用引物，此通用引物的5’端附加一段與基因變異區域野生型完全互補的6 20個堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設計與變異基因完全互補的反向引物。
2.如權利要求I所述，正向PCR通用引物所附加的寡核苷酸更優選擇為8 15個堿基。
3.如權利要求1、2所述，本方法可與現行用于臨床檢驗的其它技術聯合使用，這些技術包括但不限于實時熒光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等。
4.如權利要求1-3所述的應用，本方法適用于人癌癥基因、耐藥基因的檢測，癌癥基因包括但不限于EGFR 18密碼子的突變基因(突變類型包括G719A、G719S、G719C)、EGFR19密碼子的基因變異(基因變異類型包括2235-2249del、2235-2252 > AAT (complex)、2236-2253del、2237-2251del、2237-2254del、2237-2255 > T(complex)、2236_2250del、2238-2255del、2238-2248> GC(complex),2238-2252 > GCA(complex)、2239_2247del、2239-2253del、2239-2256del、2239-2248delTTAAGAGAAG> C(complex),2239-2258 >CA (complex)、2240-2251del、2240-2257del、2240-2254del、2239_2251 > C(complex)),EGFR 20密碼子的基因變異(基因變異類型包括T790M、S768I、2307_2308ins9、2319-2320ins CAC、2310_2311insGGT)、EGFR 21密碼子的基因變異(基因變異類型包括 L858R、L861Q)、K-ras 12 密碼子突變(Glyl2Asp (GGT > GAT)、Glyl2Ala(GGT > GCT)、Glyl2Val (GGT > GTT)、Glyl2Ser (GGT > AGT)、Glyl2Arg (GGT > CGT)、Glyl2Cys (GGT> TGT))、K-ras 13 密碼子突變(Glyl3Asp (GGC > GAC))、K-ras 61 密碼子突變(Gln61Lys(CAA > AAA)、Gln61Lys(CAA > AAA)、Gln61Arg(CAA > CGA)、Gln61His(CAA >CAT)、Gln61Leu(CAA > TTA))、B-raf基因突變(基因變異類型包括V600E);耐藥基因包括但不限于HBV拉咪呋啶耐藥、TB利福平耐藥、TB異煙肼耐藥、TBこ胺丁醇耐藥等。
5.ー種PCR擴增試劑盒，其中包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、引物，其特征在干對于野生型的擴增，其中所述正向通用引物附加寡核苷酸優于反向引物與野生型模板結合而阻止野生型擴增；對于突變型的擴增，由于所述正向通用引物附加寡核苷酸與之不完全配對，因此反向引物可以結合到突變基因模板上進行擴增。
全文摘要
本發明屬于分子診斷技術領域，具體為一種用于檢測基因變異的PCR引物設計方法及試劑盒。根據本發明提供的PCR引物設計方法，在大量野生型基因存在的情況下，可選擇性擴增變異基因的目的片段，從而實現變異基因的檢測。該方法解決了傳統測序方法靈敏度高不足、基因芯片方法非特異性雜交的問題，大大提高了變異基因的檢測靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK102816834SQ20121006383
公開日2012年12月12日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者樓敬偉, 李炳亮 申請人:上海寶藤生物醫藥科技有限公司