專利名稱：一株用于堿性果膠酶生產的工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株用于堿性果膠酶生產的工程菌及其應用。
背景技術：
果膠是植物細胞壁的重要組成成分，包括原果膠，果膠酸和果膠酯酸。果膠物質的存在可以增加植物細胞壁的堅硬度，有利于維持植物的特定外形結構，但增加了對植物進行深加工的工業操作的難度。果膠酶是指能夠分解果膠質的一類酶，普遍存在于自然界的高等植物和微生物中，是重要的工業酶制劑。堿性果膠酶(EC :4. 2. 2. 2)是一類在堿性條件下，以反式消去作用斷開果膠質主鏈，產生不飽和的寡聚半乳糖醛酸的酶，在紡織工業的麻類脫膠、棉織品精煉等領域內有著廣泛的應用。相比于傳統的高堿、高溫處理手段，使用堿性果膠酶不僅對果膠質有較好的去除作用，對天然纖維素纖維損傷較小，而且可以減少材料消耗和環境負擔，為紡織工業開辟了 一條綠色清潔之路。國內對于堿性果膠酶的的研究大多集中在野生產酶菌株的篩選以及發酵條件優化等方面，但野生菌的生產能力與工業應用的需求尚有一定的距離。利用工程菌生產堿性果膠酶可以很好的填補這一空白。近年來，出現了用重組畢赤酵母表達堿性果膠酶的報道， 但這種技術發酵周期長、能耗大。因此構建發酵周期短、操作簡單的工程菌株成為堿性果膠酶工業化應用的關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一株用于堿性果膠酶的工程菌及其應用。本發明提供的工程菌屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，命名為BL21 (DE3) PGL04,已于2012年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC No. 5697。大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)PGL04 CGMCC No. 5697簡稱大腸埃希氏菌BL21 (DE3) PGL04。所述大腸埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04可用于生產堿性果膠酶。本發明還保護一種生產堿性果膠酶的方法，包括如下步驟(I)將大腸埃希氏菌BL21 (DE3) PGL04接種至發酵培養基，得到OD6tltol = O. 1-0. 2 (如O. 1-0. 15或O. 15-0. 2)的發酵初始體系；(2)將發酵初始體系進行如下發酵先35-37°C (如35_36°C或36_37°C )振蕩培養3-5小時(如3-4小時或4-5小時)，然后加入IPTG至終濃度為50-100 μ M(如50-75 μ M 或 75-100 μ Μ)，25-30°C (如 25-28。。或 28-30°C )繼續振蕩培養 40-48 小時(如 40-45 小時或45-48小時)，得到堿性果膠酶。所述發酵培養基制備方法如下取10_15g(如10_12g或12_15g)胰蛋白胨、15-23g(如 15-19g 或 19-23g)酵母提取物、5_10g(如 5_7g 或 7-10g)氯化鈉、10_15g(如
10-12g 或 12-15g)甘油、10-17mM(如 10_14mM 或 14_17mM)磷酸二氫鉀和 65_75mM(如 65-70mM或70-75mM)磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至1L。所述發酵培養基的pH可為7. 0-7. 2 (如7. 0-7. I或7. 1-7. 2)。所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04可以以種子液的方式接種至所述發酵培養基。所述種子液的制備方法如下將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養基，35-370C (如 35-36。?；?36-37°C )振蕩培養至 OD600nm = 3-6 (如 3-4. 5 或 4. 5-6)，即為種子液。所述種子培養基的制備方法如下取10_15g(如10_13g或13_15g)胰蛋白胨、 5-8g (如5-7g或7-8g)酵母提取物和5-10g (如5_7g或7_10g)氯化鈉，用水溶解并定容至 1L。所述種子培養基的pH可為7. 0-7. 2 (如7. 0-7. I或7. 1-7. 2)。以上任一所述振蕩培養可為100-200r/min(如 100_150r/min 或 150_200r/min)
的振蕩培養。以上任一所述方法生產得到的堿性果膠酶均屬于本發明的保護范圍。所述堿性果膠酶可用于降解多聚半乳糖醛酸。所述堿性果膠酶可用于以多聚半乳糖醛酸為底物生產不飽和多聚半乳糖醛酸。所述堿性果膠酶為具有如下功能的物質在堿性環境(如pH9. 4)中，將多聚半乳糖醛酸轉化為不飽和多聚半乳糖醛酸。本發明提供工程菌和方法可用于生產堿性果膠酶，具備潛在工業化價值(如麻類脫膠、生物制漿、環境保護等行業)，為后續的工業化研究奠定了基礎。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例I、工程菌的獲得和保藏一、工程菌的獲得I、提取土壤的全基因組DNA。2、根據堿性果膠酶相關基因序列，設計簡并引物。3、以全基因組DNA為模板，用步驟2設計的簡并引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。4、將步驟3的PCR擴增產物測序，發現一個新基因。5、將新基因插入載體pET28b的NcoI和XhoI酶切位點之間，得到重組質粒。6、將重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到一株重組菌(工程菌)，命名為 BL2UDE3)PGL04。二、工程菌的保藏
BL21(DE3)PGL04 屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。BL21 (DE3)PGL04 已于2012年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC No. 5697。大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3)PGL04 CGMCC No. 5697簡稱大腸埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04。實施例2、應用工程菌生產堿性果膠酶一、培養基的制備種子培養基(pH7. O) -M IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化鈉，用水溶解并定容至 IL ;121°C滅菌 30min。發酵培養基(pH7. O):取IOg胰蛋白胨、15g酵母提取物、5g氯化鈉、IOg甘油、IOmM 磷酸二氫鉀和65mM磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。二、應用工程菌生產堿性果膠酶I、將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養基，35°C振蕩培養(IOOr/ min)至OD6citlnm = 3,即為種子液。 2、將步驟I的種子液接種至40mL發酵培養基(采用250mL搖瓶)，得到OD6tltlnm =
O.I的發酵初始體系；發酵過程如下(共43小時)先35°C振蕩培養(100r/min)3小時，然后加入IPTG至終濃度為50 μ M繼續25°C振蕩培養(100r/min)40小時。3、將完成步驟2的發酵體系離心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活測定將步驟二得到的上清液用甘氨酸-NaOH緩沖液(O. 2mol/L, pH9. 4)稀釋后進行酶活測定，具體方法如下實驗組在2ml溶液甲中加入20 μ L待測溶液，45°C反應15min，加入3mL0. 03mol/ L H3PO4水溶液(終止液)，測定235nm的吸光度值；對照組在2ml溶液甲中依次加入3mL O. 03mol/L H3PO4水溶液和20 μ L待測溶液，測定235nm的吸光度值。溶液甲的配方含O. 2g/100ml多聚半乳糖醒酸(購自Sigma-Aldrich公司，貨號 81325-50G)和 O. 44mmol/L CaCl2 的甘氨酸-NaOH 緩沖液(O. 2mol/L, ρΗ9· 4)。堿性果膠酶一個標準酶活單位(IU)定義為在上述條件下，Imin反應時間內使 PGA產生I μ mo I的不飽和聚半乳糖醛酸所需的酶量。堿性果膠酶酶活(U/mL)計算公式如下
PGL咖+_ =獅ΥΙΟ、稀釋倍數X'
IO3 χ χ4600χ χ V1 Δ OD235 =實驗組235nm的吸光度值-對照組235nm的吸光度值；4600為不飽和聚半乳糖醒酸在235nm處的摩爾吸光系數,單位為L · moF1 · cnT1 ；t為酶促反應時間(在酶反應的線性范圍內)，單位為min，本實驗中為15min ；b為比色杯厚度，單位為cm，本實驗中為Icm ；V0為體系總體積數，單位為mL，本實驗中為5. 02mL ；V1為酶液體積數，單位為mL，本實驗中為0. 02mL。步驟二得到的上清液的堿性果膠酶酶活力為600U/mL。
5
實施例3、應用工程菌生產堿性果膠酶一、培養基的制備種子培養基(pH7. 2) -M 15g胰蛋白胨、8g酵母提取物和IOg氯化鈉，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。發酵培養基(pH7. 2):取15g胰蛋白胨、23g酵母提取物、IOg氯化鈉、15g甘油、 17mM磷酸二氫鉀和75mM磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。二、應用工程菌生產堿性果膠酶I、將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養基，37°C振蕩培養(200r/ min)至OD6citlnm = 6,即為種子液。2、將步驟I的種子液接種至20mL發酵培養基(采用250mL搖瓶)，得到OD6tltlnm =
O.2的發酵初始體系；發酵過程如下(共53小時)先37°C振蕩培養(200r/min)5小時，然后加入IPTG至終濃度為100 μ M繼續30°C振蕩培養(200r/min)48小時。3、將完成步驟2的發酵體系離心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活測定同實施例2的步驟三。步驟二得到的上清液的堿性果膠酶酶活力為800U/mL。實施例4、應用工程菌生產堿性果膠酶一、培養基的制備種子培養基(pH7. I):取13g胰蛋白胨、7g酵母提取物和7g氯化鈉，用水溶解并定容至 IL ;121°C滅菌 30min。發酵培養基(pH7. I):取12g胰蛋白胨、19g酵母提取物、7g氯化鈉、12g甘油、14mM 磷酸二氫鉀和70mM磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。二、應用工程菌生產堿性果膠酶I、將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至種子培養基，36°C振蕩培養(150r/ min)至 OD6citlnm = 4. 5,即為種子液。2、將步驟I的種子液接種至30mL發酵培養基(采用250mL搖瓶)，得到OD6tltlnm =
O.15的發酵初始體系；發酵過程如下(共49小時)先36°C振蕩培養(150r/min)4小時， 然后加入IPTG至終濃度為75 μ M繼續28°C振蕩培養(150r/min)45小時。3、將完成步驟2的發酵體系離心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活測定同實施例2的步驟三。步驟二得到的上清液的堿性果膠酶酶活力為700U/mL。
權利要求
1.大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)PGL04，它的保藏編號為CGMCC No.5697。
2.權利要求I所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04在生產堿性果膠酶中的應用。
3.—種生產堿性果膠酶的方法，包括如下步驟(1)將權利要求I所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至發酵培養基，得到OD6tltol =O. 1-0. 2的發酵初始體系；(2)將發酵初始體系進行如下發酵先35-37°C振蕩培養3-5小時，然后加入IPTG至終濃度為50-100 μ M，25-30°C繼續振蕩培養40-48小時，得到堿性果膠酶。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述發酵培養基制備方法如下取10-15g 胰蛋白胨、15_23g酵母提取物、5-10g氯化鈉、10-15g甘油、10-17mM磷酸二氫鉀和65_75mM 磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至1L。
5.如權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04以種子液的方式接種至所述發酵培養基。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述種子液的制備方法如下將所述大腸埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04接種至種子培養基，35-37°C振蕩培養至OD6tltol = 3-6,即為種子液。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述種子培養基的制備方法如下取 10_15g胰蛋白胨、5-8g酵母提取物和5-10g氯化鈉，用水溶解并定容至 >1L。
8.權利要求3至7中任一所述方法生產得到的堿性果膠酶。
9.權利要求8所述堿性果膠酶在降解多聚半乳糖醛酸中的應用。
10.權利要求8所述堿性果膠酶在以多聚半乳糖醛酸為底物生產不飽和多聚半乳糖醛酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株用于堿性果膠酶的工程菌及其應用。本發明提供的工程菌屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，命名為BL21(DE3)PGL04，保藏號為CGMCC No.5697。本發明還保護一種生產堿性果膠酶的方法，包括如下步驟(1)將大腸埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接種至發酵培養基，得到OD600nm＝0.1-0.2的發酵初始體系；(2)將發酵初始體系進行如下發酵先35-37℃振蕩培養3-5小時，然后加入IPTG至終濃度為50-100μM，25-30℃繼續振蕩培養40-48小時，得到堿性果膠酶。本發明提供工程菌可用于生產堿性果膠酶，進一步可用于麻類脫膠產業。
文檔編號C12P19/14GK102586158SQ201210064448
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者宋江寧, 李小曼, 王輝林, 馬延和 申請人:天津工業生物技術研究所