專利名稱：一種優質雞抗a亞群禽白血病病毒的抗性分型方法
技術領域：
本發明涉及一種雞抗病毒基因的分型方法，具體涉及一種優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法。
背景技術：
我國是肉雞生產大國和消費大國，肉雞產量居世界第二位。2010年，我國優質雞年出欄率達到50億只，約占中國肉雞產量的50%，中國成為世界最大的優質雞生產基地和消費市場，優質雞產業已成為最具有中國特色的家禽產業，在國際市場上優勢地位明顯。本課題組多年流行病學調查結果顯示，禽白血病在優質雞中的發病率高于快大型肉雞，成為威脅優質雞產業的主要疾病之一。
禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)引起的以造血細胞惡性增生為主的一類免疫抑制性傳染病。ALV分為A-J 10個亞群，A、B、C、D為外源性病毒，E 為內源性病毒(Bai, J. , Payne, L. N. & Skinner, M. A. 1995. HPRS-103 (exogenousavian leukosis virus, subgroup J) has an env gene related to those of endogenouselements EAV-O and E51 and an E element found previously only in sarcomaviruses J Virol., 69: 779-784; Benson, S. J. , Ruisj B. L，Garbers, A. L.，FadlyjA. M. & Conklin, K. F. 1998.Independent isolates of the emerging subgroup Javian leukosis virus derive from a common ancestor J Virol. , 72: 10301—10304;Payne, L N.，Gillespie, A. M. & Howes, K. 1992. Myeloid leukaemogenicity andtransmission of the HPRS-103 strain of avian leukosis virus Leukemia, 6:1167-1176)。在雞群中A亞群病毒最常見，B亞群病毒次之。宿主范圍廣泛、感染率高、傳播速度快和致死率高等特點。目前禽白血病的防控主要方法是通過淘汰陽性雞來凈化種群，沒有疫苗進行免疫防控。ALV的清除是一項極其費力、費時且花費巨大的工作，雞群中ALV的凈化可能需要多年堅持不懈的努力。培育ALV抗性雞是未來替代傳統凈化雞群方法的必然趨勢。制約ALV抗性育種的根本原因是沒有切實可行的ALV抗性育種方法。遺傳抗性和免疫接種是降低疾病危害的基本策略，而遺傳抗性顯然更符合可持續發展的要求，并且在一定程度上具有一勞“永”逸的意義。顯然，從遺傳角度選育對禽白血病具有抗性的雞是完全可行。在雞ALV的遺傳抗性研究上，Zhang的團隊研究了 ALV-B\D\E抗性雞與易感雞的禽白血病受體基因情況，建立了快速監測ALV-B\D\E抗性雞和易感雞的方法(Zhang, H. M. , Bacon, L. D. , Cheng, Η. H.& Hunt, H. D. 2005.Development and validation of a PCR-RFLP assay to evaluateTVB haplotypes coding receptors for subgroup B and subgroup E avian leukosisviruses in White Leghorns Avian Pathol. , 34: 324-331),為 ALV_B\D\E 的抗性育種和本項目的深入研究打下基礎(Zhang et al, 2005)。Zekarias等(Zekarias, B.,Songserm, T. , Post, J. , Kok, G. L. , Pol, J. Μ. , Engel, B. & ter, H. A. 2002.Development of organs and intestinal mucosa leukocytes in four broiler linesthat differ in susceptibility to malabsorption syndrome Poult.Sci., 81:1283-1288)認為雞的遺傳抗性主要由免疫系統及一些生理和環境因子來控制。在獲得性免疫反應中，抗原的特異性識別、抗原遞呈細胞(APC)-抗原肽-主要組織相容性復合體(MHC)之間關系、T細胞和B細胞的激活都可以影響免疫應答。MHC、T細胞亞群、免疫球蛋白和細胞因子等的網絡調節作用很大程度上決定了雞的天然抗病力的強弱。因此，負責編碼這些蛋白成分的基因的內在多態性直接影響著機體的抗病能力。目前所發現的與雞綜合抗病力有關的基因不多，研究主要圍繞主要組織相容性復合體(MHC)、天然抗性相關巨噬蛋白I (NRAMPl)、模式識別受體編碼基因、干擾素基因(IFN)和雞的免疫球蛋白編碼基因等(劉紅等，2006)。雞中存在著一些可調節機體對某些特定病原(禽白血病病毒、馬立克氏病病毒、沙門氏菌、傳染性法氏囊病病毒、球蟲等)不易感的基因；白細胞介素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、趨化因子及生長因子等均可被當成機體抗病性的候選基因而加以利用，這方面的報道目前主要以揭示人類疾病發生的遺傳控制機理為主(劉紅，廖明，曹偉勝.2006.抗性基因在雞抗病育種中的研究進展.中國家禽，28(17):55-57;Kramer, J. , Malekj M. & Lamontj S. J. 2003. Association of twelve candidate genepolymorphisms and response to challenge with Salmonella enteritidis in poultry Anim Genet. , 34: 339-348)。對于這些因子與疾病的聯系，雖然對畜禽尚無多少成果報道，但可以借鑒人類的研究成果來揭示畜禽疾病的遺傳控制機理。如何通過遺傳標記輔助選擇將抗性基因運用于抗病育種，并發現新的與抗病性狀連鎖的遺傳標記將是優質雞抗病育種的熱點。雞抗病性的遺傳基礎研究，建立雞的抗性基因分型育種方法，快速選育抗性個體更是優質雞產業發展極其緊迫的工作。2000年，歐洲5個學術團體和2個公司合作開始了一個大規模的合作，目的是了解雞抗病性的遺傳基礎，并且能建立快速簡單地發現抗性個體的遺傳實驗，這項計劃被稱為IMAGE，是第一個對家禽免疫表達基因進行測序，也是唯一的聚焦于研究疾病領域的遺傳基因功能研究。他們主要集中于三種疾病的抗病性研究(傳染性法氏囊病、馬立克氏病和球蟲病)，研究結果發現在正常雞和具有抗病性的雞之間某些基因的表達有明顯差別。項目負責人指出，接下來的研究主要集中于研究由免疫產生的抗病力和天然抗病力的區別。一般抗病力受多基因或環境影響。雞一般抗病遺傳力估計在0. I 以下(Bacon, L. D. , Hunt, H. D. & Cheng, H. H. 2000. A review of the developmentof chicken lines to resolve genes determining resistance to diseases PoultSci, 79:1082-1093)，而特殊抗病遺傳力常常較高(Govora，J. S., Spencer, J. L，Okadaj I. & Grunderj A. A. 1990.Correlation of genetic resistance of chickensto Marekis disease viruses with vaccination protection and in vivo response tophytohemaglutinin Genet. Sel. Evol. , 22: 457)。不同遺傳背景的雞對ALV-A亞群的易感性不同，選育LVA-A亞群抗性雞是防控禽白血病的主要手段之一。Elleder D 等(Elleder，D.，Melderj D. C.，Trejbalovaj K·，Svobodaj J. & Federspielj M. J. 2004a. Two different molecular defects in the Tvareceptor gene explain the resistance of two tvar lines of chickens to infectionby subgroup A avian sarcoma and leukosis viruses J. Virol., 78: 13489-13500)研究得出禽白血病病毒(ALV)是通過特定膜蛋白作為受體位點吸附進入細胞的，其中ALV-A亞型受體為tva，相應的編碼基因屬于低密度脂蛋白受體家族成員；ALV-B、ALV-D,ALV-E亞型受體是tvb，相對應的編碼基因是腫瘤壞死家族的成員；ALV-C亞型的受體是tvc0 Elleder D 等(Elleder, D. , Plachy, J. , Hejnar, J. , Geryk, J. & Svoboda, J.2004b.Close linkage of genes encoding receptors for subgroups A and C of aviansarcoma/leucosis virus on chicken chromosome 28 Anim Genet. , 35: 176-181)石開究發現易感雞的DT40細胞能通過同源重組破壞tvc等位基因而抗ALV-C的感染。ZekariasB 等(Zekarias, B. , Songserm, T. , Post, J. , Kok, G. L. , Pol, J. Μ. , Engel, B. &ter, H.A. 2002. Development of organs and intestinal mucosa leukocytes in fourbroiler lines that differ in susceptibility to malabsorption syndrome Poult.Sci., 81: 1283-1288)表明，一些內源性反轉錄病毒基因表達的膜糖蛋白(如gp85)可阻斷ALV受體，使機體產生抗ALV抗性，而且這種抗性可垂直傳播。ALV的抗性基因的挖掘和抗性育種方法的建立具有極為重要的意義和價值。目前ALV還沒有好的疫苗可用于該病的防控，而且沒有關于優質雞抗禽白血病A的抗性基因的任何報道，沒有一個成熟的抗性基因可應用于優質雞抗ALV-A的遺傳抗病性 選育，更沒有相關的優質雞抗禽白血病A抗性分型育種方法的建立，這對優質雞ALV抗病育種提出了巨大的挑戰。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法。本發明通過以下技術方案實現上述目的
本發明根據ALV-A的受體基因TVA為研究對象，發現該TVA基因的第619位核苷酸具有多態性，因而設計PCR-RFLP實驗，同時結合TVA基因序列305 308位是否有4_base(CGCT)，來對雞進行A亞群禽白血病病毒抗性基因分型。一種優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法(以下簡稱抗性分型方法)，以TVA基因序列619位的SNP位點為研究對象，進行PCR-RLFP分析，檢測SNP位點是否發生突變，同時結合TVA基因序列的測序檢測305 308位點是否有4個堿基的插入；
按如下標準進行基因抗性分析
遺傳易感型=TVA基因序列兩個等位基因619位的SNP位點均未發生突變且305 308位點無4個堿基的插入、TVA基因序列其中一個等位基因619位的SNP位點發生突變且305^308位點均無4個堿基的插入，或TVA基因序列其中一個等位基因619位的SNP位點未發生突變且另一個等位基因305 308位點有4個堿基的插入；
遺傳抗性型TVA基因序列619位的SNP位點均發生突變且305 308位點無4個堿基的插入、TVA基因序列其中一個等位基因619位的SNP位點發生突變且另一個等位基因305^308位點有4個堿基的插入，或TVA基因序列兩個等位基因305 308位點均有4個堿基的插入。作為一種優選方案，上述抗性分型方法中所述SNP位點發生突變是由C突變為G，4個堿基為CGCT。
作為一種優選方案，上述抗性分型方法中所述PCR-RLFP分析中，以雞全基因組DNA為模板，引物核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示，PCR方法擴增包含TVA基因619位點的片段(以下簡稱TVA619片段)，擴增產物用Ar I酶進行酶切。作為一種優選方案，上述抗性分型方法中，在進行PCR-RLFP分析后還有一個焦磷酸測序步驟,驗證SNP位點是否發生突變，測序引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。作為一種優選方案，上述抗性分型方法中，TVA基因序列的測序首先以SEQ IDNO: 4^5所示核苷酸序列為引物，PCR方法擴增包含TVA基因305 308位點的片段(以下簡稱TVA223片段)，擴增產物用焦磷酸測序方法進行測序。焦磷酸測序的引物核苷酸序列優選如SEQ ID NO:6 所示。本發明的實驗原理如下
I.根據已知TVA基因的mRNA序列(GenBank登錄號AY531262. 1，該基因DNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示)上的619位核苷酸多態性設計PCR-RFLP實驗。具體方法為根 據TVA基因mRNA序列上的619位的SNP位點(C/G)，設計PCR-RFLP的擴增引物序列例如TVA6195、TVA6193，引物TVA6193用生物素標記。在TVA6195序列的5，端帶有fer I酶切位點CTCTT，引物序列見表I。抽提雞的基因組DNA，用引物TVA6195和TVA6193擴增的片段長69bp。然后用fer I酶切，上述PCR的產物用fer I內切酶酶切可以看到不同大小的酶切條帶，分別為69bp、38bp、31bp。如果該PCR產物能被fer I酶完全或不完全切開，則該SNP位點的核苷酸為C或含有C，如為遺傳易感型(完全切開定義為TVA*S，不完全切開定義為TVA*S/R1);如不能切開，則該位點的核苷酸為G，為遺傳抗性型(定義為TVA*R1)。2.同時用619位SNP位點的焦磷酸測序(Pyrosequence)方法進行SNP測序驗證，測序引物Pyro_primer619(見表I)。TVA619 SNP位點的pyrosequence測序的引物和位置見圖I。如果619位點的核苷酸為C，為遺傳易感型(上述的TVA*S)，若果619位點的核苷酸可能是C或G，則為雜合易感型(上述的TVA*S/R1);如該位點的核苷酸為G，為遺傳抗性型(上述的TVA*R1)。3.本發明根據TVA基因的mRNA序列(GenBank登錄號AY531262. I)的305 308位4-base插入的情況設計焦磷酸測序(pyrosequence)實驗。TVA的305 308位有4-base的插入，則該雞為ALV-A的遺傳抗性型；反之為遺傳易感型。根據TVA基因的mRNA序列設計引物，例如TVA2235、TVA2233和Pyro_primer223，引物TVA2233用生物素標記。引物序列見表I。TVA619 SNP位點的pyrosequence測序的引物和位置見圖2。抽提雞的基因組DNAj引物TVA2235和TVA2233擴增樣品的PCR產物為223bp，然后用焦磷酸測序(pyrosequence)測序儀進行4-base插入位點的測序。若有4_base插入，則為遺傳抗性型(定義為TVA*R2);如沒有4-base插入，則為遺傳易感型(同樣屬于TVA*S)。4.本發明根據PCR-RFLP和4-base pyrosequence測序的結果,制定判定雞抗A亞群禽白血病病毒(ALV-A)的基因型的標準。TVA是ALV-A亞型禽白血病病毒進入宿主的受體基因。本發明定義的TVA抗性有三個等位基因，即TVA*S，TVA*R1和TVA*R2。所以就有六種基因型，TVA*S/S、TVA*S/R1、TVA*S/R2、TVA*R1/R1、TVA*R1/R2、TVA*R2/R2。一只雞如果帶有一個或兩個TVA*S等位基因，這只雞將是ALV-A的易感型，即遺傳易感型。一只雞如果帶有一個TVA*R1和一個TVA*R2、或者兩個TVA*R1或兩個TVA*R2等位基因，那么，這只雞就是抗ALV-A的基因型，即遺傳抗性型?；蛐头中团卸ㄈ绫?。
5、結合2、3的方法，按照4的標準，建立雞抗A亞群禽白血病病毒(ALV-A)的抗性基因分型方法。表I PCR擴增和焦磷酸測序引物
權利要求
1.一種優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法，其特征在于以TVA基因序列619位的SNP位點為研究對象，進行PCR-RLFP分析，檢測SNP位點是否發生突變，同時結合檢測TVA基因序列305 308位的SNP位點是否有4個堿基的插入，按如下標準進行基因抗性分析 遺傳易感型=TVA基因序列兩個等位基因619位的SNP位點均未發生突變且305 308位點無4個堿基的插入、TVA基因序列其中一個等位基因619位的SNP位點發生突變且305^308位點均無4個堿基的插入，或TVA基因序列其中一個等位基因619位的SNP位點未發生突變且另一個等位基因305 308位點有4個堿基的插入； 遺傳抗性型TVA基因序列619位的SNP位點均發生突變且305 308位點無4個堿基的插入、TVA基因序列其中一個等位基因619位的SNP位點發生突變且另一個等位基因305^308位點有4個堿基的插入，或TVA基因序列兩個等位基因305 308位點均有4個堿基的插入。
2.根據權利要求I所述優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法，其特征在于所述SNP位點發生突變是由C突變為G，4個堿基為CGCT。
3.根據權利要求I所述優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法，其特征在于所述PCR-RLFP分析中，以雞全基因組DNA為模板，引物核苷酸序列如SEQ ID NO: I 2所示，PCR方法擴增包含TVA基因619位點的片段，擴增產物用Ear I酶進行酶切分析。
4.根據權利要求3所述優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法，其特征在于進行PCR-RLFP分析后還有一個焦磷酸測序步驟，驗證SNP位點是否發生突變，測序引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根據權利要求I所述優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法，其特征在于TVA基因序列的測序首先以SEQ ID NO:4飛所示核苷酸序列為引物，PCR方法擴增包含TVA基因305 308位點的片段，擴增產物用焦磷酸測序方法進行測序。
6.根據權利要求5所述優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法，其特征在于焦磷酸測序的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
全文摘要
本發明公開了一種優質雞抗A亞群禽白血病病毒的抗性分型方法，是以TVA基因序列619位的SNP位點為研究對象，進行PCR-RLFP分析，檢測SNP位點是否發生突變，同時結合檢測TVA基因序列305~308位的SNP位點是否有4個堿基的插入，兩者檢測結果相結合共同判定被檢測雞為遺傳抗性型還是遺傳易感型。本發明的抗性分型方法從源頭上進行檢測，省去了后期檢測的麻煩，同時該檢測方法快速準確，目的性強，操作簡單，具有實踐意義，可以對雞進行遺傳性狀的快速選擇以提高品系的抗病性。
文檔編號C12Q1/68GK102851355SQ20121007371
公開日2013年1月2日 申請日期2012年3月20日 優先權日2012年3月20日
發明者謝青梅, 張煥民, 常爽, 李鴻鑫, 畢英佐 申請人:華南農業大學