專利名稱：基于Taqman探針的水產品中麥氏弧菌的熒光定量PCR快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種基于Taqman探針的水產品中麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii) 的熒光定量PCR快速檢測方法。
背景技術：
麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii)是革蘭氏陰性菌，短小稍彎曲的弧狀菌，無芽孢、無莢膜，有偏端單鞭毛一根，運動方式呈直線穿梭樣，嗜鹽菌，TCBS(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium)平板上生長，菌落呈黃色。麥氏弧菌是一種致病性弧菌，廣泛存在于河流、海灣和下水道中。麥氏弧菌被國內外學者公認為11 種致病性弧菌之一，能夠引起腹瀉、創傷性感染和敗血癥。在飲用水中與腹瀉病之間存在著密切的聯系。
現有麥氏弧菌的檢測方法主要有傳統常規分離鑒定法、普通PCR檢測法、ATB細菌鑒定法等。
基于Taqman探針的熒光定量PCR技術通過TaqMan探針與模板的特異性雜交來鑒別模板，具有很高的準確性，假陽性低，特異性好。目前尚未見用TaqMan探針快速檢測水產品中麥氏弧菌的報道。發明內容
本發明的目的是提供一種檢測速度快、靈敏度高的快速檢測水產品中麥氏弧菌的基于I1aqman探針的熒光定量PCR方法。
研究表明麥氏弧菌攜帶的rpoB基因是RNA聚合酶β亞單位編碼基因，具有較高的保守性。本發明根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站上公布的麥氏弧菌rpoB 基因全序列，以該特異基因的保守序列設計特異性引物和TaqMan探針，并且采用熒光定量 PCR快速技術檢測麥氏弧菌，具有快速、特異性強、靈敏度高等優點。可以作為水產品中麥氏弧菌的快速、簡便、準確的檢測方法。
本發明的技術解決方案是一種快速檢測麥氏弧菌的方法，其特征在于有如下步驟
(1)首先提取待檢樣品TCBS平板上可疑菌落的基因組DNA。
(2)熒光定量PCR反應液05 μ L體系)
其中包括提取的基因組DNA，2y L ； 10 X PCR buffer，2. 5 μ L ；Mg2+, 2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG酶IU ；dNTP 0. 2mmol/L ；麥氏弧菌特異性引物IOpmol ；TaqMan探針5pmol，最后加滅菌去離子水至25 μ L。
(3)熒光定量PCR儀程序參數94 V預變性5min ；94 V變性30s，58 V退火30s，同時收集FAM熒光，72°C延伸30s，40個循環。
其中麥氏弧菌特異性引物為CN 102534044 A
上游引物Vmetschnikovii-I :5' -GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3‘
下游引物Vmetschnikovii-2 :5' -CCAAGATGGTCGATATCATC-3‘
特異性I^aqMan探針為
Vmetschnikovii-3 5' -CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3‘
熒光定量PCR反應結束后，麥氏弧菌能形成典型的S型擴增曲線，而且Ct值< 35。
本發明提供了擴增麥氏弧菌的特異性引物Vmetschnikovii-l、Vmetschnikovii-2 和TaqMan探針Vmetschnikovii-3，從而提供了一種快速檢測麥氏弧菌的方法，同現有檢測技術相比具有如下優勢
快速性沒有后處理，不用電泳、拍照，實時縮短了反應時間。
靈敏度高光譜技術和計算機技術的聯合使用，極大提高了檢測的靈敏度。
特異性強熒光信號的產生不僅強烈依賴于靶模板同探針的雜交，而且同時強烈依賴于靶模板的擴增，二者缺一不可，故不存在非特異性擴增現象。
有效解決PCR污染整個過程均在單管中進行，且勿需打開管蓋，避免了 PCR產物對實驗室的污染。
具體實施方式
首先無菌操作取25g待測水產品，充分剪碎，放入盛有225mL滅菌海水的滅菌容器中，進行10倍梯度稀釋后，選擇2 3個適當稀釋度，各以0. ImL涂布到TCBS平板上，在 360C 士 1°C培養箱中，倒置培養Mh士池。挑取5個可疑菌落提取基因組DNA并稀釋備用。 如果平板上的可疑菌落少于5個，則應該全部挑取進行基因組DNA提取并稀釋備用。
最后進行熒光定量PCR反應，每個熒光定量PCR反應總體積為25 μ L，其中包括提取的基因組 DNA, 2 μ L ； 10 X PCR buffer,2. 5μ L ；Mg2+, 2mmol/L ； Taq 酶 2U ； UNG 酶 IU ； dNTP 0. 2mmol/L ；麥氏弧菌特異性引物IOpmol ；TaqMan探針5pmol，最后加滅菌去離子水至 25 μ L0設置熒光定量PCR儀器的程序參數為94°C預變性5min ；94°C變性30s，58°C退火 30s，同時收集FAM熒光，72°C延伸30s，40個循環。
其中麥氏弧菌特異性引物為
上游引物Vmetschnikovii-I :5' -GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3‘
下游引物Vmetschnikovii-2 :5' -CCAAGATGGTCGATATCATC-3‘
特異性TaqMan探針為
Vmetschnikovii-3 5' -CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3‘
熒光定量PCR反應結束后，麥氏弧菌能形成典型的S型擴增曲線，而且Ct值< 35。
核苷酸序列表
<110>山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
<120>基于Taqman探針的水產品中麥氏弧菌的熒光定量PCR快速檢測方法
<160>3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1). . . (22)
<400>1
GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC 22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1). . . (20)
<400>2
CCAAGATGGTCGATATCATC 20
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1). . . (25)
<400>3
CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT 2權利要求
1.一種基于Taqman探針的快速檢測水產品中麥氏弧菌的熒光定量PCR方法，其特征在于首先提取TCBS平板上的可疑菌落的基因組DNA并稀釋備用；再利用麥氏弧菌保守性強的基因組DNA序列設計特異性引物和探針；最后使用該引物和探針對待測水產品TCBS平板上可疑菌落的基因組DNA進行熒光定量PCR擴增和熒光信號的檢測。其中所述的麥氏弧菌特異性引物為上游引物 Vmetschnikovii-I 5' -GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3‘下游引物 Vmetschnikovii-2 5' -CCAAGATGGTCGATATCATC-3‘特異性TaqMan探針為Vmetschnikovii-3 5' -CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3‘
2.根據權利要求1所述的基于Taqman探針的快速檢測麥氏弧菌的熒光定量PCR方法，其反應總體積為25 μ L，包括提取的基因組DNA，2 μ L ;10XPCR buffer, 2. 5 μ L ；Mg2+， 2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG 酶 IU ；dNTP，0. 2mmol/L ；麥氏弧菌特異性引物 IOpmol ；TaciMan 探針 5pmol，最后加滅菌去離子水至25 μ L。
3.根據權利要求1所述的基于Taqman探針的快速檢測麥氏弧菌的熒光定量PCR方法， 其熒光定量PCR儀器的程序參數為94°C預變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，同時收集FAM熒光，72°C延伸30s，40個循環。
全文摘要
本發明公開了一種基于Taqman探針的麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii)的熒光定量PCR快速檢測方法，采用麥氏弧菌特異性引物和TaqMan探針，即可對水產品中麥氏弧菌進行檢測與監控。其中上游引物Vmetschnikovii-15′-GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3′，下游引物Vmetschnikovii-25′-CCAAGATGGTCGATATCATC-3′，特異性TaqMan探針為Vmetschnikovii-35′-CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3′。檢測麥氏弧菌的方法包括細菌基因組DNA的提取、麥氏弧菌的熒光定量PCR檢測。其優點是快速、特異性強、靈敏度高。另外，本發明與普通PCR技術相比，不需要凝膠電泳拍照觀察，實現了檢測流程一體化封閉檢測，避免了PCR產物對實驗室的污染。
文檔編號C12Q1/04GK102534044SQ201210077610
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者吳振興, 姜英輝, 張健, 李正義, 祝素珍, 賈俊濤, 馬云 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心