專利名稱：哈維氏弧菌的熒光定量pcr快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的突光定量PCR快速檢測方法。
背景技術：
哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是革蘭氏陰性菌，菌體桿狀，極生單鞭毛運動，TCBS (Tniosulfate citrate bile salts sucrose agar culture mediumノ 平十反上生長，落呈黃色或緑色，嗜鹽菌。哈維氏弧菌廣泛存在于海洋環境中，是條件致病菌。在適宜的條件下，它們大量繁殖成為優勢菌，通過消化道或者傷ロ感染，致使傷ロ肌肉潰爛化膿以及內臟器官的嚴重病變而導致海水動物發病死亡，是水產養殖動物魚、蝦的重要致病菌。現有哈維氏弧菌的檢測方法主要有常規分離鑒定法、普通PCR檢測法、膠體金免疫層析試驗法等。熒光定量PCR技術通過TaqMan探針與模板的特異性雜交來鑒別模板，具有很高的準確性，假陽性低，特異性好。目前尚未見用熒光定量PCR方法快速檢測哈維氏弧菌的報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測速度快、靈敏度高的快速檢測哈維氏弧菌的熒光定量PCR方法。研究表明哈維氏弧菌攜帶的toxR基因是其毒力基因的表達調控基因。本發明根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站上公布的哈維氏弧菌toxR基因全序列，以該特異基因的保守序列設計特異性引物和TaqMan探針，并且采用熒光定量PCR快速技術檢測哈維氏弧菌，具有快速、特異性強、靈敏度高等優點。可以作為水產品中哈維氏弧菌的快速、簡便、準確的檢測方法。本發明的技術解決方案是ー種快速檢測哈維氏弧菌的方法，其特征在于有如下步驟(I)首先提取待檢樣品TCBS平板上可疑菌落的基因組DNA。(2)熒光定量PCR反應液(25 μ L體系)其中包括提取的基因組DNA，I μ L ； 10 X PCR buffer，2. 5μ L ;Mg2+，2mmol/L ;Taq 酶2U ；UNG 酶 IU ；dNTP 0. 2mmol/L ;哈維氏弧菌特異性引物 200nmol ；TaqMan 探針 200nmol，最后加滅菌去離子水至25 μ L0(3)熒光定量PCR儀程序參數94°C預變性IOmin ;94°C變性15s，60°C退火lmin，同時收集FAM熒光，40個循環，40 V Imin，4 V保存。其中哈維氏弧菌特異性引物為上游引物Vharveyi-I :5' -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3'，下游引物Vharveyi-2 :5' -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3'特異性TaqMan探針為Vharveyi-3 5/ -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3'
熒光定量PCR反應結束后，哈維氏弧菌能形成典型的S型擴增曲線，而且Ct值
<35。本發明提供了擴增哈維氏弧菌的特異性引物Vharveyi-1、Vharveyi-2和TaqMan探針Vharveyi-3，從而提供了一種快速檢測哈維氏弧菌的方法，同現有檢測技術相比具有如下優勢快 速性沒有后處理，不用電泳、拍照，實時縮短了反應時間。靈敏度高光譜技術和計算機技術的聯合使用，極大提高了檢測的靈敏度。特異性強熒光信號的產生不僅強烈依賴于靶模板同探針的雜交，而且同時強烈依賴于靶模板的擴增，二者缺一不可，故不存在非特異性擴增現象。有效解決PCR污染整個過程均在單管中進行，且勿需打開管蓋，避免了 PCR產物對實驗室的污染。
具體實施例方式首先無菌操作取25g待測水產品，充分剪碎，放入盛有225mL滅菌海水的滅菌容器中，進行10倍梯度稀釋后，選擇2 3個適當稀釋度，各以O. ImL涂布到TCBS平板上，在360C ±1°C培養箱中，倒置培養24h±3h。挑取5個可疑菌落提取基因組DNA并稀釋備用。如果平板上的可疑菌落少于5個，則應該全部挑取進行基因組DNA提取并稀釋備用。最后進行熒光定量PCR反應，每個熒光定量PCR反應總體積為25 μ L，其中包括提取的基因組 DNA，I μ L ； 10 X PCR buffer, 2. 5μ L ；Mg2+, 2mmol/L ;Taq 酶 2U ；UNG 酶 IU ；dNTP0. 2mmol/L ;哈維氏弧菌特異性引物200nmol ;TaqMan探針200nmol,最后加滅菌去離子水至25 μ L0設置熒光定量PCR儀器的程序參數為94°C預變性IOmin ;94°C變性15s，60°C退火Imin，同時收集FAM熒光，40個循環，40°C lmin，4°C保存。其中哈維氏弧菌特異性引物為上游引物Vharveyi-1 :5' -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3'，下游引物Vharveyi-2 :5' -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3'特異性TaqMan探針為Vharveyi-3 5/ -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3'熒光定量PCR反應結束后，哈維氏弧菌能形成典型的S型擴增曲線，而且Ct值
<35。核苷酸序列表<110>山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心<120>哈維氏弧菌的熒光定量PCR快速檢測方法<160>3〈210〉I<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<221>prim_bind<222>(1). . . (19)
〈400〉IGAGTTCGTATGGCGGGAGC 19<210>2〈211 >21<212>DNA〈213〉人工序列<221>prim_bind <222>(1). . . (21)<400>2GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG 21<210>3<211>21<212>DNA〈213〉人工序列<221>prim_bind<222>(1). . . (22)<400>3TCCACTCTACGTAAAATGTTGA 2權利要求
1.一種快速檢測哈維氏弧菌的熒光定量PCR方法，其特征在于首先提取TCBS平板上的可疑菌落的基因組DNA并稀釋備用；再利用哈維氏弧菌保守性強的基因組DNA序列設計特異性引物和探針；最后使用該引物和探針對待測水產品TCBS平板上可疑菌落的基因組DNA進行熒光定量PCR擴增和熒光信號的檢測。其中所述的哈維氏弧菌特異性引物為上游引物 Vharveyi-I :5' -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3'，下游引物 Vharveyi-2 5/ -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3'特異性TaqMan探針為Vharveyi-3 5/ -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3'
2.根據權利要求I所述的快速檢測哈維氏弧菌的熒光定量PCR方法，其反應總體積為 25μ L，包括提取的基因組 DNA，I μ L ；10XPCR buffer, 2. 5μ L ；Mg2+, 2mmol/L ;Taq 酶 2U ；UNG酶IU ；dNTP 0. 2mmol/L ;哈維氏弧菌特異性引物200nmol ;TaqMan探針200nmol，最后加滅菌去離子水至25 μ L0
3.根據權利要求I所述的快速檢測哈維氏弧菌的熒光定量PCR方法，其熒光定量PCR儀器的程序參數為94°C預變性IOmin ;94°C變性15s，60°C退火lmin，同時收集FAM熒光，.40 個循環，40°C lmin，4°C保存。
全文摘要
本發明公開了一種哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的熒光定量PCR快速檢測方法，采用哈維氏弧菌特異性引物和TaqMan探針，即可對水產品中哈維氏弧菌進行檢測與監控。其中上游引物Vharveyi-15′-GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3′，下游引物Vharveyi-25′-GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3′，特異性TaqMan探針為Vharveyi-35′-TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3′。檢測哈維氏弧菌的方法包括細菌基因組DNA的提取、哈維氏弧菌的熒光定量PCR檢測。其優點是快速、特異性強、靈敏度高。另外，本發明與普通PCR技術相比，不需要凝膠電泳拍照觀察，實現了檢測流程一體化封閉檢測，避免了PCR產物對實驗室的污染。
文檔編號C12R1/63GK102618643SQ20121007764
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者唐靜, 房保海, 李正義, 祝素珍, 賈俊濤, 趙麗青, 馬維興 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心