專利名稱：一種包含l-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著L-丙氨酸生產(chǎn)工藝的日臻成熟，利用L-丙氨酸生產(chǎn)高附加值衍生產(chǎn)品的需求與日俱增，其中DL-丙氨酸的高效和綠色生產(chǎn)工藝正得到業(yè)界的重視。DL-丙氨酸是L-丙氨酸的結(jié)構(gòu)消旋物，其化學(xué)名稱是DL- α -氨基丙酸(簡稱丙氨酸)，分子式為CH3CH(NH2) C00H，成品是無色至白色無臭針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，有較強(qiáng)的甜味，易溶于水、無旋光性。
權(quán)利要求
1.一種L-丙氨酸消旋酶，其特征在于，它具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
2.—種權(quán)利要求I所述的L-丙氨酸消旋酶的編碼基因，其特征在于，它具有如SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
3.一種外源表達(dá)L-丙氨酸消旋酶的基因工程菌，其特征在于，它包含如SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，它包括以下步驟(1)構(gòu)建含有L-丙氨酸消旋酶基因的表達(dá)載體提取發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921的基因組DNA作為模板，以包含EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)的下列核苷酸序列作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物 I :5’ -GGAATTCATGGTAAGTGCAC-3，；引物 2 :5，-AAGCGGCCGCGCCTAGGTAGC-3，；PCR擴(kuò)增體系為:基因組DNA 2yL，引物I和引物2各2yL，dNTP 4 μ L，IOXTaq緩沖液 5 μ L, Taq 酶 I μ L, ddH20 34 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，然后50°C退火lmin，72°C延伸lmin， 循環(huán)25次；最后72°C延伸IOmin ；回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒 pET-28a在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET_alr。(2)將重組質(zhì)粒pET-alr轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中將重組質(zhì)粒pET-alr轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12 16h得到單克隆；(3)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆分別挑取單克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI酶切；根據(jù)電泳結(jié)果判斷含有與air基因相同分子量大小DNA片段的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pET-alr，具有該重組質(zhì)粒的菌落為陽性克隆，即為基因工程菌。
5.一種L-丙氨酸消旋酶的表達(dá)方法，其特征在于，將包含如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的基因工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后以O(shè). 5 10% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 40°C發(fā)酵培養(yǎng)I 3h，再加入終濃度O. I 10g/L的乳糖或終濃度O. I I. 5mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20 40°C下誘導(dǎo)表達(dá)3 48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的L-丙氨酸消旋酶的表達(dá)方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其碳源的是L-丙氨酸，濃度為10 50g/L ;氮源是蛋白胨或酵母粉，濃度為5 40g/L ； 發(fā)酵培養(yǎng)基用氨水或NaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH值到4 10，經(jīng)高壓濕熱滅菌后即可使用。
7.權(quán)利要求3所述的基因工程菌在制備DL-丙氨酸中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將L-丙氨酸加入到經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌的發(fā)酵液中，維持反應(yīng)溫度4 60°C，反應(yīng)3 24h，反應(yīng)過程檢測反應(yīng)液的比旋光度，待比旋光度為O時，停止反應(yīng)，加入活性炭在20-80°C脫色反應(yīng)10-120min，抽濾除去活性炭后真空濃縮結(jié)晶，即得到DL-丙氨酸精制樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌發(fā)酵液離心并收集菌體，加入L-丙氨酸水溶液，重新懸浮菌體，調(diào)整溶液pH值為7 14，維持反應(yīng)溫度4 60°C，反應(yīng)3 24h，反應(yīng)過程檢測反應(yīng)液的比旋光度，待比旋光度為O時，停止反應(yīng)，離心收集菌體，加活性炭至上清液中，在20-80°C脫色反應(yīng)10-120min，抽濾除去活性炭后真空濃縮結(jié)晶，即得到DL-丙氨酸精制樣品；二次收集的菌體可以重復(fù)用于DL-丙氨酸的生產(chǎn)直至酶活性完全喪失。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其應(yīng)用。該菌株包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的基因工程菌可以通過消旋L-丙氨酸生產(chǎn)DL-丙氨酸，且用量少、反應(yīng)時間短、可以多批次重復(fù)利用，通過本發(fā)明的基因工程菌，消旋過程的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.0％以上，產(chǎn)品純度達(dá)到99.5％以上，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
文檔編號C12N9/00GK102604899SQ20121007756
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者馮小海, 徐虹, 徐錚, 李莎, 許露 申請人:南京工業(yè)大學(xué)