專利名稱：亞克隆細胞株tf-1-a2及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是一株用于定量檢測神經生長因子生物學活性的TF-I亞克隆穩定細胞株TF-1-A2，其制備方法以及其在NGF制品生物學活性的測定上的用途。
背景技術：
隨著基因工程技術的發展，大量的基因工程藥物不斷進入臨床和生產。由于基因工程藥物不同于一般的化學藥品，它大多是多肽和蛋白質類物質，來源于活的生物體，具有復雜的分子結構，在生產過程中容易受到各種理化條件等的影響，因此，對于此類產品要從各個方面進行全面的、嚴格的質量控制。對于細胞因子類生物制品來說，由于其化學本質為多肽或蛋白質，其活性由產品的氨基酸序列、氨基酸序列的翻譯后修飾及其空間結構決定，其活性效價和其絕對質量不一致，所以也就不能按化學藥品那樣直接用重量單位來決定。此類產品的生物學活性與藥效學基本一致，是藥效學的直觀反映，利用這類制品的特定生物學活性建立特定的測定效價體系，定出其效價單位，是保證產品藥效的重要手段和質量控制的重要組成部分和關鍵指標(王軍志主編，生物技術藥物研究開發和質量控制(第二版)，北京科學出版社，2007)。由于細胞因子類生物制品的生物學活性的降低或喪失，通常并不表現為物理化學性質的改變，無法使用常規檢測方法來測定，目前最常用的方法是利用分離的器官和組織、原代細胞或傳代細胞系的體外測定法。而基于連續生長、因子依賴的、克隆化的細胞系的體外細胞培養測定法，由于具有測定結果精確、可以定量、重現性好、經濟、容易使用和便于統計分析的優點得到廣泛的應用(Kitamura T, Tange T, Terasawa T et al. Establishmentand characterisation of a unique human cell line which proliferates dependentlyon GM-CSF, IL3 and erythropoietin. J. Cell. Physiol. 1989 ；140 323-334.;賈菌，周興軍，王輝，等.MTT法測定三種基因工程細胞因子生物學活性方法研究.中國生化藥物雜志.2000,21(1) 8-11.;沈世燁.TF-I細胞饑餓在IL-4生物學活性測定中的應用.海峽藥學· 2006，18 (5) =69-70.;袁力勇，饒春明，李響，等· GM-CSF/IL-3融合蛋白質量標準的研究和建立.藥物分析雜志.2008,28(10) =1605-1608.) ο目前利用體外細胞培養法進行活性測定的產品有G-CSF(NFS-60 細胞)、GM-CSF(TF-1 細胞)、EGF(3T3 細胞)、IL-2 (CTLL-2細胞)、IL-3 和 GM-CSF/IL-3 融合蛋白(Mo7E，TF-1 細胞)、IL_6(7TD1，B9-11 細胞)和IL-Il (T-10細胞)等(國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典.2010年版，三部.附錄X D, E，F，G，H ;王軍志主編.生物技術藥物研究開發和質量控制.第二版，北京科學出版社，2007)。神經生長因子(nerve growth factor, NGF)是一種對神經細胞生長發育、分化、新陳代謝等方面具有重要調控作用的活性多肽，作為藥品在醫學上有著廣泛用途(Sun WJ,Sun CK, Lin H, et al. The effect of collagen-binding NGF-beta on the promotionof sciatic nerve regeneration in a rat sciatic nerve crush injury model.Biomaterials, 2009 ；30(27) =4649-4656.)。NGF已從小鼠頜下腺、豚鼠、兔、牛前列腺、公牛精液、人胎盤和蛇毒等組織器官中分離純化獲得。目前國內NGF藥品質量檢測，其生物活性測定方法主要為雞胚背根神經節培養法，需要分離雞胚背根神經節，操作繁瑣，且準確性差，主觀影響因素大(黃玉輝，徐天瑞，龔毅.雞胚背根神經節培養法測定神經生長因子活性的條件優化.細胞生物學雜志.2003，25 (4) :251-253.)。而近年來報道比較多的是PC12細胞體外培養法，包括PC12細胞分化法和PC12細胞增值法，前者根據NGF誘導PC12分化的陽性細胞團的個數判斷NGF活性，后者是根據無血清情況下NGF促進PC12細胞增值能力(董躍偉，徐天瑞，熊郁良，等.PC12細胞定性及定量測定神經生長因子活性的新方法.華西藥學雜志.1999,14(5-6) :311_314.)。用PC12細胞培養法，實驗條件要求高，主觀因素影響大，且PC12細胞較難培養，培養過程會出現分化情況，很難保證不同代次之間的反應性一致；不同的PC12細胞亞系有不同的生物學特性，對NGF的敏感度也不同(駱鵬，譚亞軍，田霖，等.PC12細胞體外培養法測定蛇毒神經生長因子活性.中國生物制品學雜志.2006，19(5) :524-526.)。因此到目前為止，由于沒有合適的生物學活性測定方法，小鼠神經生長 因子(Mouse nerve growth factor,mNGF)的生物學活性測定方法仍未載入藥典,NGF國家標準品也仍未建立。TFl細胞是一種GM-CSF依賴性的人紅系白血病細胞，在無GM-CSF存在下，不能維持正常的增殖。但其表面表達GM-CSF、IL-3、EPO等造血生長因子受體和高親和力NGF受體 TrkA, NGF 能夠與 TrkA 結合(Kitamura T, Tange T, Terasawa T et al. Establishmentand characterisation of a unique human cell line which proliferates dependentlyon GM-CSF IL3 and erythropoietin. J. Cell. Physiol. 1989 ；140 323-334. ；ChevalierS, Praloran V, Smith C, et al. Expression and functionality of the trk Aproto-oncogene product/NGF receptor in undifferentiated hematopoietic cells.Blood. 1994，83 (6) : 1479-1485.)。TrkA作為NGF的高親和力受體，結合NGF后形成二聚體，激活受體胞內區酪氨酸激酶區，引起相應的酪氨酸磷酸化，繼而激活下游信號轉導系統執行調節靶細胞的功能，從而誘導TF-I增值。因此，可以利用NGF誘導TFl增值來檢測NGF生物學活性(俞萍，趙強，柳川，等.神經生長因子體外生物學活性測定國際標準方法的初步建立.中國生化藥物雜志，1999，20 (4) 196-197.;韓春梅，于雷，范文紅，等.TFl細胞增殖法測定鼠神經生長因子(mNGF)生物學活性.2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集.)。然而，在應用中我們發現，由于GM-CSF對GM-CSF依賴的TF-I細胞刺激生長的效應很強，在使用GM-CSF依賴的TF-I細胞進行NGF生物學活性測定時，必須反復調整GM-CSF的使用濃度，只有這樣才能在適當的GM-CSF濃度下使NGF促進TF-I細胞的生長的作用體現出來，但是存在操作復雜、信噪比低和結果偏差大的問題。更為重要的是，往往由于GM-CSF活性較強掩蓋了 NGF的促增值效應，很難保證結果的重復性和穩定性。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一株檢測神經生長因子生物學活性的TF-I單克隆細胞株及其制備方法和用途，該TF-I單克隆株及該優化的檢測方法能較靈敏地檢測神經生長因子生物學活性。一種篩選亞克隆細胞株TF-1-A2的方法，包括如下步驟
I)利用NGF對rhGM-CSF依賴的TF-I細胞株進行馴化，使其轉變為依賴NGF維持正常生長TF-I細胞株，2)對NGF依賴的TF-I細胞株進行克隆化，挑選單克隆細胞擴大培養，3)繪制各單克隆細胞株對NGF的劑量-效應曲線，根據Emax值和信噪比對得到的單克隆細胞株進行篩選，獲得TF-1-A2亞克隆細胞株。所述NGF為小鼠NGF。所述克隆化的方法為半固體培養基克隆化法。所述半固體培養基為甲基纖維素類培養基。所述馴化是在一定濃度的NGF存在下，通過倍比稀釋逐步降低GM-CSF濃度并連續傳代的方法將GM-CSF依賴的TF-I細胞馴化為NGF依賴的TF-I細胞。所述馴化培養基為終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養基，調整活細胞濃度按IXlO5ceIls/孔接種至培養板，依次向孔板中添加含有按I 2的比例倍比稀釋的濃度梯度的rhGM-CSF的基礎培養基，馴化五代即可。上述方法得到的亞克隆細胞株TF-1-A2。所述的亞克隆細胞株TF-1-A2，其保藏編號為CGMCC No. 5969。所述的亞克隆細胞株TF-1-A2在體外定量測定NGF生物學活性中的應用。所述的應用，所述NGF為小鼠NGF或重組人NGF。所述的應用，所述定量測定方法包括如下步驟A、檢測起始孔濃度為200ng/ml,進行4倍系列稀釋，共9個稀釋度，將標準品溶液轉移至培養板的孔板中；B、取對數生長期的mNGF依賴的TF-1-A2細胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細胞，用RPMI 1640基礎培養液洗滌，然后重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液中，調整細胞濃度5X IO4個細胞/ml的細胞懸液，孔板中每孔加入100μ I ;C、將細胞培養板于37°C、5% CO2條件下培養分別培養72h后，每孔加入MTS/PMS溶液20μ 1，于37°C、5% CO2條件下繼續培養4h，D、取出利用BioTek公司的EPOCH超微量微孔板分光光度計于波長490nm處測定吸光度；E、使用GraphPad Prism5軟件分析數據，利用四參數方程繪制劑量_效應反應曲線，通過待測制品的吸光度，計算出待測NGF的生物學活性。本發明利用NGF對rhGM-CSF依賴的TF-I細胞株進行馴化，使其轉變為依賴NGF維持正常生長TF-I細胞株，利用半固體培養基對TF-I依賴NGF混合細胞株進行克隆化，克隆化得到TF-I單克隆細胞株后對單克隆細胞株進行篩選，繪制劑量-效應曲線，根據Emax值和信噪比進行篩選，并篩選得到了一株亞克隆細胞株TF-1-A2，用其檢測NGF生物學活性，并對檢測條件進行優化。經實驗證明，本發明的亞克隆細胞株TF-1-A2，可用于NGF生物學活性的定量檢測。本發明得到的TF-I單克隆細胞株易于培養，傳代穩定性好、對NGF敏感，測定時背景較低，信噪比高，對NGF有陡峭的、可重復的劑量-效應曲線，具有信噪比高、重現性好、操作方便、可精確定量和便于統計分析比活性等優點，可用于建立標準的NGF生物學活性測定方法標定NGF制品的活性，做為NGF制品生產中進行質量控制的關鍵指標，適合在神經生長因子生物學活性檢測中使用。亞克隆細胞株TF-1-A2，其保藏編號為CGMCC No. 5969。、
分類命名人紅系白血病細胞株保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏時間2012年4月12日


圖I.馴化后的NGF依賴的TF-I細胞對mNGF的劑量-效應曲線，圖2.甲基纖維素半固體培養基法克隆化NGF依賴的TF-I細胞(100X)A :培養第4天的細胞；B :培養第8天的單克隆細胞團；C :培養第10天單克隆細胞團圖3. 5株NGF依賴的TF-I亞克隆細胞對鼠NGF的劑量-效應曲線，圖4. TF-1-A2細胞最佳使用密度的優化，圖5. TF-1-A2細胞最佳培養時間的優化，圖6. TF-1-A2細胞檢測鼠NGF和rhNGF制品生物學活性。具體實施方法本發明更詳細的實施方法參見實施例，本實施例是用于解釋、說明而不是以任何方式限制本發明。本發明實施例中所使用的GM-CSF依賴的TF-I細胞株、小鼠NGF和化學試劑均為市售產品，重組人NGF制品為本公司表達并純化。實施例I :GM-CSF依賴的TF-1細胞的馴化I. GM-CSF依賴的TF-1細胞的常規培養GM-CSF依賴的TF-I細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，使用含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養基，添加終濃度為8ng/ml的rhGM-CSF進行維持培養。細胞濃度保持在3X 104-5X 105cells/ml左右，于37°C，5% CO2條件下培養，2-3天換液I次。2. GM-CSF依賴的TF-1細胞的馴化在一定濃度的NGF存在下，通過倍比稀釋逐步降低GM-CSF濃度并連續傳代的方法將GM-CSF依賴的TF-I細胞馴化為NGF依賴的TF-I細胞。具體馴化方法為以添加了終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基為馴化培養基，調整活細胞濃度按I X IO5Cells/孔接種6孔細胞培養板。然后依次向6孔板的6個孔中添加含有按I : 2的比例倍比稀釋6個濃度梯度的rhGM-CSF的基礎培養基，使第I孔中的rhGM-CSF的終濃度為lng/ml，第2孔中的rhGM-CSF的終濃度為O. 5ng/ml，余下各孔依此類推。然后，將6孔板置于37°C，5% CO2條件下靜置培養，于72h后進行細胞計數并測定細胞活力，調整活細胞濃度按IX IO5ceIls/孔接種6孔細胞培養板，繼續傳代培養，馴化過程如表I所示。結果表明，馴化第一代時在最低的rhGM-CSF濃度下(O. 03125ng/ml)，即使有高濃度的mNGF存在細胞活力仍有較大幅度的下降，細胞活力下降為50%左右。而后，隨著傳代次數的增多細胞活力逐漸恢復。馴化至第5代時，在最低濃度的rhGM-CSF (O. 03125ng/ml)存在下細胞活力已恢復至100%。此時使用添加了終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養基將6孔板中的細胞轉移至T25細胞培養瓶中擴大培養，完全去掉了培養基中的rhGM-CSF,細胞也能夠維持正常生長，此時rhGM-CSF依賴的TF-I細胞已經馴化為mNGF依賴的TF-I細胞。然后，以含25ng/ml的mNGF的，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基連續傳代2個月以上，細胞生長良好，對mNGF維持良好的反應性。表IGM-CSF依賴的TF-1細胞馴化結果
EjjllrhGM-CSF 濃度(ng/ml) 化10.50.250.1250.06250.03125
細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞ix 密度*活力密度*活力密度*活力密度*活力密度*活力密度*活力
1492.3%492.3%2.492.3%284.6%250%250%
2696%398%396%386%680%961%
3495%495%2.497%295%295%295%
4698.4%398%390%390%695%990%
54100%4100%2.4100%2100%2100%2100%*細胞密度單位χ105個細胞/ml3. mNGF依賴的TF-I細胞的劑量-效應反應曲線使用MTS/PMS 法(CellTiter 96 Aqueous 試劑，Promega 公司)測定 mNGF 依賴的TF-I細胞對NGF的劑量-效應反應曲線，判斷其是否可用于NGF生物活性測定。具體操作方法為I)樣品的制備取市售注射用鼠神經生長因子I支(規格30ug，生物學活性^ 15000AU/支)用2ml PBS溶解作為儲存液，_20°C保存備用。檢測起始孔濃度為200ng/ml，進行4倍系列稀釋，共9個稀釋度，將標準品溶液轉移至96孔板中，每個濃度3個復孔，每孔100 μ 1，另選擇3個孔加入陰性對照溶液(不含NGF的RPMI 1640完全培養基)。2)加入細胞取對數生長期的mNGF依賴的TF-I細胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細胞，用RPMI 1640基礎培養液洗滌2次，然后重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液中，調整細胞濃度為5X IO4個細胞/ml，向步驟一制備的96孔板中每孔加入100 μ 1，每個濃度加3個復孔；3)測定法將上述制備的96孔細胞培養板于37°C、5% CO2條件下培養72h后，每孔加入MTS/PMS溶液20μ 1，于37°C、5% CO2條件下繼續培養4h，取出利用BioTek公司的EPOCH超微量微孔板分光光度計于波長490nm處測定吸光度；5)數據分析使用GraphPad Prism 5軟件分析數據，利用四參數方程繪制劑量-效應反應曲線，結果如圖I所示。結果表明，馴化后所獲得的NGF依賴的TF-I細胞對NGF敏感，測定時背景較低，信噪比(Signal/Noise值，即S/N值)高(> I. 9)，對NGF有陸峭的、可重復的劑量-效應曲線。而且，該細胞體外連續傳代2個月以上，依然對NGF保持有良好的反應性，測定NGF活性時劑量-效應曲線良好，表明其易于培養，傳代穩定性好，適合進一步克隆化挑選單克隆細胞株。實施例2 =NGF依賴的TF-I細胞的克隆化利用甲基纖維素半固體培養基對已經馴化的mNGF依賴的TF-I細胞進行克隆化，具體方法為I)所使用的甲基纖維素半固體培養基為METHOCULT H4100(Stem cell公司，Catalog#04100)甲基纖維素濃縮液(濃度為2. 6%，_20°C保存備用)，使用前置4°C充分融化。加入含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養液和mNGF與其充分混合進行2. 5倍稀釋，使mNGF終濃度為25ng/ml，甲基纖維素終濃度為I. 0% ;2)取對數生長期的mNGF依賴的TF-I細胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細胞，重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液中，調整細胞濃度至為2 X IO4個細胞/ml的細胞懸液；3)取Iml稀釋好的細胞懸液(2X104個細胞)轉入預混的甲基纖維素半固體培養基中，用帶16號平頭針頭的25ml注射器反復輕柔吹吸使其完全混勻，然后室溫靜置5-10min,除掉氣泡，此時NGF依賴的TF-I細胞終濃度為200個細胞/ml ；4)用帶16號平頭針頭的25ml注射器分裝混有甲基纖維素培養基的細胞懸液，每 個60mm培養皿加入5ml，放入37°C，5% CO2條件下靜置培養，注意平拿平放，不要經常移動；5)分別在第4天、第8天和第10天時于倒置生物顯微鏡下觀察細胞生長情況。結果如圖2所示，第4天時鏡下便可觀察到單克隆細胞團，第10天時用肉眼即可觀察到平皿上的單克隆細胞團。于倒置顯微鏡下鏡檢，標記分散良好、周圍沒有其它克隆的單克隆細胞團，挑取單個細胞團轉移到96孔細胞培養板內用含有終濃度為25ng/ml mNGF的10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液培養。待長滿96孔板的孔底后，依次轉移至24孔細胞培養板、6孔細胞培養板和T75培養瓶擴大培養。經過2次克隆化，共挑選50個單克隆細胞團至96孔板中，其中15株單克隆細胞株得到有效擴增。待15株單克隆細胞擴增至足夠數量后，將細胞株及時凍存并分別制備這15株亞克隆細胞株對NGF的劑量-效應曲線，挑選背景較低、信噪比高以及對NGF有陡峭的、可重復的劑量-效應曲線的細胞株用于NGF定量測定。實施例3 =NGF依賴的TF-I單克隆株的篩選按照實施例I中所述的方法，分別繪制甲基纖維素半固體培養基克隆化所獲得的15株單克隆細胞株的劑量-效應反應曲線，計算細胞的最大增值效應(Maximal effect,Emax)區間和信噪比，結果如表2所示。根據表2數據和劑量-效應反應曲線，挑選曲線良好的細胞株，進行擴大培養并凍存建立細胞庫。表215株TF-I單克隆細胞株的篩選結果
權利要求
1.一種篩選亞克隆細胞株TF-1-A2的方法，包括如下步驟 4)利用NGF對rhGM-CSF依賴的TF-I細胞株進行馴化，使其轉變為依賴NGF維持正常生長TF-I細胞株， 5)對NGF依賴的TF-I細胞株進行克隆化，挑選單克隆細胞擴大培養， 6)繪制各單克隆細胞株對NGF的劑量-效應曲線，根據Emax值和信噪比S/N值對得到的單克隆細胞株進行篩選，獲得TF-1-A2亞克隆細胞株。
2.根據權利要求I所述的方法，所述NGF為小鼠NGF。
3.根據權利要求I所述的方法，所述克隆化的方法為半固體培養基克隆化法。
4.根據權利要求4所述的方法，所述半固體培養基為甲基纖維素類培養基。
5.根據權利要求I所述的方法，所述馴化是在一定濃度的NGF存在下，通過倍比稀釋逐步降低GM-CSF濃度并連續傳代的方法將GM-CSF依賴的TF-I細胞馴化為NGF依賴的TF-I細胞。
6.根據權利要求5所述的方法，所述馴化培養基為終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基，調整活細胞濃度按I X IO5ceIls/孔接種至培養板，依次向孔板中添加含有按I : 2的比例倍比稀釋的濃度梯度的rhGM-CSF的基礎培養基，馴化五代即可。
7.根據權利要求1-6任一所述方法得到的亞克隆細胞株TF-1-A2。
8.權利要求7所述的亞克隆細胞株TF-1-A2，其保藏編號為CGMCCNo. 5969。
9.權利要求7或8所述的亞克隆細胞株TF-1-A2在體外定量測定NGF生物學活性中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，所述NGF為小鼠NGF或重組人NGF。
11.根據權利要求9所述的應用，所述定量測定的方法包括如下步驟:A、檢測起始孔濃度為200ng/ml，進行4倍系列稀釋，共9個稀釋度，將標準品溶液轉移至培養板的孔板中；B、取對數生長期的mNGF依賴的TF-1-A2細胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細胞，用RPMI1640基礎培養液洗滌，然后重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液中，調整細胞濃度5X104個細胞/ml的細胞懸液，孔板中每孔加入100μ I ;C、將細胞培養板于37°C、5%CO2條件下培養分別培養72h后，每孔加入MTS/PMS溶液20 μ 1，于37°C、5% CO2條件下繼續培養4h，D、取出利用BioTek公司的EPOCH超微量微孔板分光光度計于波長490nm處測定吸光度；E、使用GraphPad Prism5軟件分析數據，利用四參數方程繪制劑量-效應反應曲線，通過待測制品的吸光度，計算出待測NGF的生物學活性。
全文摘要
本發明涉及“亞克隆細胞株TF-1-A2及其制備方法與用途”，屬于生物技術領域。TF-1-A2亞克隆穩定細胞株的制備方法，包括將GM-CSF依賴的TF-1細胞馴化為NGF依賴株；對誘導后的NGF依賴的TF-1細胞進行甲基纖維素半固體培養基克隆化；從半固體培養基中挑取單克隆細胞擴大培養；制備各單克隆細胞株對NGF的劑量-效應曲線，篩選獲得亞克隆細胞株TF-1-A2。本發明得到的TF-1-A2亞克隆細胞株對NGF高度敏感且有良好的反應性，連續傳代穩定性好。利用TF-1-A2亞克隆細胞株建立的TF-1細胞增值法，用于體外定量測定神經生長因子的生物學活性，信噪比高，重復性好，優于現有方法。
文檔編號C12Q1/02GK102660505SQ20121011940
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月20日 優先權日2012年4月20日
發明者樂偉, 劉荷中, 史權威, 李曼, 霍立紅 申請人:北京華安科創生物技術有限公司