專利名稱：桑樹查爾酮異構酶基因及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，特別是涉及桑樹類黃酮化合物生物合成關鍵基因查爾酮異構酶基因及其應用。
背景技術：
類黃酮是一類重要的植物次生代謝物質， 是由兩個苯環通過中央三碳鏈相互聯結而成的一系列化合物，小部分以游離形式存在，大部分與糖類合成苷類，以配基形式存在。桑樹中類黃酮化合物種類豐富、分布廣泛，主要有花色素、黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類等四大類，藥理研究證明桑樹類黃酮化合物具有良好的抗氧化、降血糖、抗病菌、降血壓、降血脂等功能。類黃酮合成途徑中，查爾酮異構酶基因^///是極為關鍵的限速酶，控制類黃酮的合成和組分分化，因此桑樹查爾酮異構酶基因可應用于桑樹類黃酮生物合成的調控。

發明內容
本發明的目的之一在于提供桑樹查爾酮異構酶基因核苷酸全序列、桑樹查爾酮異構酶基因開放閱讀框ORF序列及3'端非編碼區、桑樹查爾酮異構酶基因編碼的氨基酸序列，以及在此序列基礎上進行密碼子優化或點突變所產生的與原始序列相似度在90%以上的序列。針對桑樹中類黃酮含量較低、提取成本高的困難，提供一個調控桑樹類黃酮生物合成的基因以及在轉基因植物中的應用。本發明所述的桑樹查爾酮異構酶基因全長的克隆，依次通過以下步驟實現
1)根據薔薇科植物草莓或蘋果的查爾酮異構酶基因保守序列設計兼并引物，以桑樹葉片基因組為模板，擴增桑樹查爾酮異構酶基因的保守區域；
2)基于獲得的桑樹查爾酮異構酶基因的保守區域設計基因特異引物，采用接頭PCR獲得保守區域的側翼序列；
3)采用軟件sequencher(http://genecodes. com/)將獲得的側翼序列與保守區域序列進行拼接，采用NCBI網站的blastx程序預測拼接序列中含有的基因開放閱讀框(ORF)及編碼的氨基酸序列；
4)以桑樹葉片cDNA為模板擴增桑樹查爾酮異構酶基因開放閱讀框(0RF)，并連接到PMD19-T Vector (TaKaRa)，挑選陽性克隆并測序。
本發明同時提供桑樹查爾酮異構酶基因在桑樹中的應用，即采用CaMV35S啟動子、35SPolyA以及桑樹查爾酮異構酶基因構建過表達查爾酮異構酶基因的植物表達載體，并采用農桿菌感染桑樹叢生芽的方式獲得轉基因植株，具體步驟如下
一、植物表達載體的構建
I)以pCMBIA2301質粒為模板，采用PCR法分別擴增得到35S啟動子及35SPolyA片段，以桑樹葉片cDNA為模板擴增桑樹查爾酮異構酶基因片段；2)將各片段分別插入植物表達載體PCMBIA2301的相應酶切位點中，構建成35S啟動子-CHI-35SPolyA的表達盒，并進行序列測定；
二、桑樹查爾酮異構酶基因ifed的過表達
1)利用凍融法將植物表達載體轉入農桿菌，采取PCR法鑒定陽性克隆；
2)以桑樹種子為材料進行組織培養獲得叢生芽，構建具有相同遺傳背景的無性繁殖
系;
3)采用含植物表達載體的農桿菌感染叢生芽，獲得轉基因植株；
4)根據標記基因的序列設計引物對轉基因苗子進行PCR檢測；
5)以槲皮素為標準品，采用高效液相色譜(HPLC)技術檢測轉基因苗與對照組類黃酮含量的變化。上述基因側翼序列的克隆中，接頭PCR為依賴于銜接頭的側翼序列分析方法。上述植物表達載體的構建中，CaMV35S啟動子是花椰菜花葉病毒啟動子，一種強啟動子，被廣泛應用于轉基因植物中進行過量表達。35SPolyA為35S的終止序列。載體pCMBIA2301是目前常用的植物雙元表達載體，含卡那的抗性以及Gus標記基因。
桑樹查爾酮異構酶基因的應用，將該基因應用于真核及原核表達。桑樹查爾酮異構酶基因ifeCT/J應用于過量表達提高桑樹類黃酮的含量。桑樹查爾酮異構酶基因ifeCT/J應用于抑制查爾酮異構酶基因的表達獲得新的轉基因株系。桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI應用于其他植物品種的轉基因。


圖I為MaCHI保守區域PCR電泳圖。M Trans2000 ； I -MaCHI保守區域片段擴增 圖2為側翼序列的擴增電泳圖。M Trans2000 ；1 5/端側翼序列擴增；2-4:3/
端側翼序列擴增
圖3為全長擴增電泳圖。M Trans2000 ；1 :0RF全長PCR擴增；2 :基因全長基因組擴增
圖4為ifeCT/J基因結構圖。黑色長方形外顯子；直線內含子；白色長方形3'端非編碼區
圖5為轉基因植株的PCR檢測圖。0 :陰性對照；M Trans2000 ;1_7 :為轉基因植株 圖6為轉基因植株黃酮類物質含量(％)。CK :對照植株；1_7 :轉基因植株 本發明的優點是
本發明為類黃酮合成代謝路徑中第一個關鍵酶基因，將桑樹查爾酮異構酶基因(ifed)采用基因工程的方法，導入桑樹中，實現過表達，可提高桑樹各組織中類黃酮的含量(詳見實施例)。此外，該發明還可以應用到其他植物中，改變植物體內類黃酮的含量及種類，降低從植物中提取類黃酮的成本，有利于促進類黃酮物質在醫藥產業中的開發利用。
具體實施例方式實施例I :桑樹查爾酮異構酶基因(MCHI、全長的克隆
I)以桑樹中山5801 (華東蠶業研究所，顧青虹，1958)為材料(也可以其它公知公用的桑樹品種為材料)，分別提取嫩葉基因組和總RNA，并將提取的總RNA進行反轉錄合成cDNA ；
2)根據薔薇科植物的草莓或蘋果的查爾酮異構酶基因序列，設計兼并引物Pl-F(5' >ACTATAGGGCACGCGTGGT〈3')和P1_R(5' >GAYTCVGACTCCARDACYGC〈3')，以中山5801基因組DNA為模板，擴增得到長1729bp的基因片段(圖I)，連接到T克隆載體PMD19-Tsimple vector上,轉化進入大腸桿菌,挑取陽性克隆并測序；
3)根據步驟2)獲得的基因片段核苷酸序列，分別設計兩條5'端特異引物upGSPl(5' >CATGCAGAGTCAATAGGACT〈3' )、upGSP2(5' >CTCTAAAGAACTCGACGGACTCC〈3')以及3'端特異引物 downGSPl (5' >GCTTTTCCAAAGATGAATCCATA<3' )、downGSP2 (5' >GATGAATCCATACCAGAAAAAGAG<3')；
4)合成銜接頭Adaptor I (5，>P03-ACCAGCCC_NH2〈3，)和 Adaptor 2 (5，> GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT〈3’)，根據 Adaptor 2 設計兩條接頭特異序列 API (5' >GTAATACGACTCACTATAGGG〈3')和 AP2 (5' >ACTATAGGGCACGCGTGGT〈3')，銜接頭經高溫退火處理后，分別與經限制性內切酶V、炫^ III和I消化后的基因組DNA相連接，使用引物APl和up-GSPl進行5’端序列第一輪擴增，APl和down-GSPl進行3’端序列第一輪擴增；使用引物AP2和Up-GSP2進行第二輪5’端序列擴增，使用引物AP2和down-GSP2進行3’端序列第二輪擴增，獲得基因側翼片段(圖2)，將片段連接到T克隆載體PMD19-T simple vector上,轉化進入大腸桿菌,挑取陽性克隆并測序；
5)采用軟件Sequencher(http: //genecodes. com/)將步驟4)獲得的側翼序列與步驟
2)獲得的基因片段序列進行拼接，采用NCBI網站的blastx程序預測拼接序列中含有的基因開放閱讀框(ORF)及編碼的氨基酸序列，設計弓I物P-2F (5, >ACCAACGTCCTCAACAAAAACCG〈3')和 P-2R(5' >CTAATTTGTTTCTGCAGGGCAGG<3')，以桑樹葉 cDNA 為模板，擴增出開放閱讀框ORF (圖3)。根據NCBI報道的EST序列gil71462011和gil71462735對比分析，該基因具有290bp的3’端非編碼區。實施例2 :植物過表達載體的構建
1)分別設計35S啟動子、35SPolyA以及桑樹查爾酮異構酶基因片段的特異引物，并添加酶切位點及保護堿基，具體序列如下
35S-F 5' >CGGGGTACCCTGTCGTGCCAGCTGCATTA<3'
35S-R 5' >AAGGGCGCGCCGCATGGTCGATCGACAGATCTGCG<3'
CHI-F 5' >AAGGGCGCGCCGATGGCTCTTACGACAGTCGC<3/
CHI-R 5' > GGATTAATTAAGGTCTTTTGTCTCTTTAAGCAG<3'
35spolyA-F :5' >GGATTAATTAAGGGTATCGCCGCTCCCGATTC〈3'
35spolyA-R :5' >CGCGGATCCACGCCGAATTAATTCGGGGG〈3'
2)以載體pCMBIA2301為模板擴增CaMV35S啟動子和35SPolyA片段，以桑樹cDNA為模板擴增
得到桑樹查爾酮異構酶基因ifed片段，擴增片段分別插入PMD19-T Vector載體中測
序;
3)基于步驟2)構建的3個T克隆采用KpnI/Asc I酶切獲得CaMV35S啟動子，采用Asc I/Pac I 酶
切獲得桑樹查爾酮異構酶基因片段，!/BamH I酶切獲得35SPolyA片段，將三個片段與經治w VBamH I消化的pCMBIA2301相連接，轉化大腸桿菌，挑選陽性克隆并進行序列測定，構建成植物表達載體pCMBIA2301-35S-CHI-35SPolyA。實施例3 :桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI的過表達
1)利用凍融法將植物表達載體轉入農桿菌，采取PCR法鑒定陽性克隆；
權利要求
1.桑樹查爾酮異構酶基因ifed，其特征在于具有說明書序列表所示的桑樹查爾酮異構酶基因核苷酸全序列、桑樹查爾酮異構酶基因開放閱讀框ORF序列及3'端非編碼區、桑樹查爾酮異構酶基因編碼的氨基酸序列，以及在此序列基礎上進行密碼子優化或點突變所產生的與原始序列相似度在90%以上的序列。
2.權利要求I所述的桑樹查爾酮異構酶基因全長的克隆方法，其特征在于依次通過以下步驟實現 1)根據薔薇科植物草莓或蘋果的查爾酮異構酶基因保守序列設計兼并引物，以桑樹葉片基因組為模板，擴增桑樹查爾酮異構酶基因的保守區域； 2)基于獲得的桑樹查爾酮異構酶基因的保守區域設計基因特異引物，采用接頭PCR獲得保守區域的側翼序列； 3)采用軟件sequencher(http://genecodes. com/)將獲得的側翼序列與保守區域序列進行拼接，采用NCBI網站的blastx程序預測拼接序列中含有的基因開放閱讀框(ORF)及編碼的氨基酸序列； 4)以桑樹葉片cDNA為模板擴增桑樹查爾酮異構酶基因開放閱讀框(0RF)，并連接到PMD19-T Vector (TaKaRa)，挑選陽性克隆并測序。
3.權利要求I所述桑樹查爾酮異構酶基因ifed的應用，其特征在于將該基因應用于真核及原核表達。
4.權利要求I所述桑樹查爾酮異構酶基因ifeCT/J應用于過量表達提高桑樹類黃酮的含量。
5.權利要求I所述桑樹查爾酮異構酶基因應用于抑制查爾酮異構酶基因的表達獲得新的轉基因株系。
6.權利要求I所述桑樹查爾酮異構酶基因ifeCT/J應用于其他植物品種的轉基因。
全文摘要
本發明公開了一個來源于桑樹的查爾酮異構酶基因MaCHI的序列、克隆方法及應用。該基因全長2112bp，含4個外顯子和3個內含子，開放閱讀框(ORF)全長為660bp，編碼219個氨基酸，包括290bp的3′端非編碼區。該基因為植物類黃酮合成路徑中的關鍵基因之一，采用基因工程的方法，將其導入桑樹中，實現過表達，可提高桑樹各組織中類黃酮的含量。該發明還可以應用到其他植物中，改變植物體內類黃酮的含量及種類，降低從植物中提取類黃酮的成本，有利于促進類黃酮物質在醫藥產業中的開發利用。
文檔編號C12N15/10GK102643846SQ20121011948
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月23日 優先權日2012年4月23日
發明者余茂德, 劉長英, 呂蕊花, 吳存容, 張瓊予, 李軍, 王茜齡, 趙愛春, 金筱耘 申請人:西南大學