專利名稱：一種采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備卵孢菌素晶體的方法，特別是涉及一種采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法。
背景技術：
卵孢菌素是許多土壤真菌、蟲生真菌和擔子菌的代謝產物。據文獻報道，卵孢菌素具有廣泛的生物活性，主要用于生物防治，1984年D Brewer報道卵孢菌素具有抗細菌作用，1992年BJ Terry報道卵孢菌素具有抑制I型單純皰疹病毒DNA聚合酶的活性，1994年J Eyal報道卵孢菌素具有較強的抗蟲害作用如植物葉片粉虱，土壤昆蟲象鼻蟲等，2000年Hermann Strasser研究表明卵孢菌素對人類和動物沒有毒害作用，2006年胡豐林報道卵孢菌素具有抑制單胺氧化酶(MAO)的活性。鑒于卵孢菌素具有廣泛的生物活性，人們正在研 究將其作為生物農藥使用。很多栽培銀耳菌的人都知道銀耳菌在膠質化之前會出現“吐黃水和吐紅水”的現象，但是至今沒有文獻報道產生這種現象的原因，以及所吐黃水和紅水為何種化合物。本申請人通過大量跟蹤、分析發現了產生這種現象的原因，即銀耳菌在合適培養條件下可代謝卵孢菌素，并通過篩選合適的培養基培養出了紅色物質一卵孢菌素，由此產生了本發明。迄今為止還未有有關用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法。本發明所提供的一種采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法包括如下步驟(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在2(T30°C、轉速10(T200r/min的條件下培養2飛d，獲得種子液，將種子液以5 10%的接種量接種到發酵培養基中，在2(T30°C、轉速10(T200r/min的條件下培養4 10d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為碳源2(T30g. Γ1+氮源5 15g.L—1+磷酸二氫鉀O. 46g. L—1+磷酸氫二鉀lg. L—1+硫酸鎂lg. L—SpHe. 0，所述碳源和氮源為適合銀耳菌生長的碳源和氮源；(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在40°C 80°C減壓濃縮后加入無水乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂吸附，然后依次用蒸餾水和乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。上述(I)步驟中培養基所采用的碳源為葡萄糖、蔗糖、’乳糖或麥芽糖，氮源為有機氮源或/和氨基酸。上述有機氮源為豆柏、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉中的一種或幾種的組合，氨基酸為纈氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸中的一種或幾種的組合。上述(2)步驟中所加入的無水乙醇體積為濃縮后發酵液體積的2飛倍。上述(3)步驟中洗脫時所用乙醇的濃度為55、5%。上述(4)步驟中所用乙醇的濃度與(3)步驟所用乙醇的濃度相同。本發明所采用的銀耳菌種子是由四川省通江山霸王野生食品有限公司提供的通江椴木銀耳菌二級母種通過原生質體育種的方法分離得到的(命名為TJ001，現保藏于成都大學藥食同源植物資源重點實驗室)。具體步驟是先將銀耳菌二級母種接種于PDA液體培養基中培養5天，然后采用4000r/min離心獲得菌絲體，將菌絲用O. 6mol/L的氯化鉀溶液清洗后，取O. 5g菌絲體溶解在O. 6mol/L的氯化鉀溶液中，再加入濃度為3%溶壁酶，在25°C酶解4h后用無菌脫脂棉過濾酶解液獲得原生質體，將原生質體涂布于再生培養基麥 芽糖IOg. L—1+葡萄糖IOg. L—1+蛋白胨4g. L—1+磷酸二氫鉀O. 46 g. L—1+硫酸鎂I. O g. L-1+瓊脂20 g. L-1上生長6d，ρΗ6· O,挑取單菌落。上述原生質體育種的方法已是成熟方法，并已在有關文獻上進行了刊載，如《菌物系統》〔2003.22 (4)〕上登載的的由謝寶貴、朱虎撰寫的“銀耳原生質體分離與再生條件優化研究”。本發明首次通過選擇合適的培養基發酵銀耳菌產生卵孢菌素，同時利用簡單的除雜方法和柱純化技術獲得高純度卵孢菌素晶體，產率可達30mg. L—1。本發明具有發酵周期短、發酵液中卵孢菌素含量高、操作簡單、使用有機溶劑少等優點。下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明,但本發明的內容并不僅限于此。
具體實施例方式實施例I(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在25°C、轉速150r/m的條件下培養5天，獲得種子液，將種子液以10%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養5d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為葡萄糖20g. Γ1+蛋白胨5g. Γ1++磷酸二氫鉀O. 46g. Γ1+磷酸氫二鉀I. Og. Γ1+硫酸鎂I. 0g. L_\ pH6. 0，發酵3天后發酵液開始變紅，12小時后顏色變化明顯；(2)采用10000r/min的轉速將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離,取發酵液，在70°C減壓濃縮后加入4倍體積的無水乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂DlOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其在70°C濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為75%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例2(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在20°C、轉速200r/min的條件下培養4d，獲得種子液，將種子液以8%的接種量接種到發酵培養基中，在30°C、轉速150r/min的條件下培養7d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為蔗糖30g. L—1+蛋白胨6g. L—1+玉米漿4g. L—1+磷酸二氫鉀O. 46g.Γ1+磷酸氫二鉀I. Og. Γ1+硫酸鎂I. Og. ΙΛ ρΗ6. 0，發酵5d發酵液開始變紅，12h后顏色變化明顯；(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在50°C減壓濃縮后加入5倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂AB-8吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為85%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為85%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。 實施例3(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在20°C、轉速200r/min的條件下培養4d，獲得種子液，將種子液以5%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養8d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為蔗糖30g. Γ1+牛肉膏5g. Γ1+酵母浸粉5g. Γ1+豆柏5g. Γ1+磷酸二氫鉀O. 46g. L—1+磷酸氫二鉀I. 0g. L—1+硫酸鎂I. 0g. L'pHe. O，發酵5d發酵液開始變紅，12h后顏色變化明顯；(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在50°C減壓濃縮后加入5倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂AB-8吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為75%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例4(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在30°C、轉速150r/min的條件下培養3d，獲得種子液，將種子液以6%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速200r/min的條件下培養5d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為乳糖25g. Γ1+纈氨酸IOg. Γ1+磷酸二氫鉀O. 46g. Γ1+磷酸氫二鉀I. Og. Γ1+硫酸鎂I. 0g. L—1，pH6. 0，發酵4d發酵液開始變紅，12h后顏色變化明顯；(2)采用lOOOOr/min的轉速將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，80°C減壓濃縮后加入3倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂D-IOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為65%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為65%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例5(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養5d，獲得種子液，將種子液以10%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養5d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為麥芽糖25g. Γ1+纈氨酸2g. Γ1+異亮氨酸4g. Γ1+磷酸二氫鉀O.46g. L—1+ 磷酸氫二鉀 I. Og. L—1+ 硫酸鎂 I. Og. L—1，ρΗ6· O ；(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在70°C減壓濃縮后加入5倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂DlOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為75%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例6(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在25°C、轉速120r/min的條件下培養3d，獲得種子液，將種子液以5%的接種量接種到發酵培養基中， 在25°C、轉速120r/min的條件下培養5d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為蔗糖25g. Γ1+纈氨酸3g. L—1+異亮氨酸3g. Γ1+蘇氨酸3g. L—1+磷酸二氫鉀 O. 46g. I71+ 磷酸氫二鉀 I. 0g. I71+ 硫酸鎂 I. 0g. I71, pH6. O ；(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在70°C減壓濃縮后加入5倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂DlOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為75%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例7(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養5d，獲得種子液，將種子液以10%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養8d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為麥芽糖20g. Γ1+谷氨酸2g. Γ1+天冬氨酸4g. Γ1+甘氨酸6g. Γ1+磷酸二氫鉀 O. 46g. I71+ 磷酸氫二鉀 I. 0g. I71+ 硫酸鎂 I. 0g. I71, pH6. O ；(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在70°C減壓濃縮后加入5倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂DlOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為65%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為65%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例8(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養5d，獲得種子液，將種子液以10%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養10d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為葡萄糖28g. Γ1+纈氨酸2g. Γ1+異亮氨酸2g. Γ1+絲氨酸2g. Γ1+天冬氨酸2g. Γ1+甘氨酸2g. Γ1+磷酸二氫鉀O. 46g. Γ1+磷酸氫二鉀I. Og. Γ1+硫酸鎂 I. 0g. L—1，pH6. O ；(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在70°C減壓濃縮后加入5倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂DlOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為85%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為85%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例9(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養5d，獲得種子液，將種子液以10%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速150r/min的條件下培養8d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為葡萄糖30g. Γ1+纈氨酸2g. Γ1+異亮氨酸2g. Γ1+絲氨酸2g. Γ1+天冬氨酸2g. Γ1+甘氨酸2g. Γ1+豆柏2 g. Γ1+磷酸二氫鉀O. 46g. Γ1+磷酸氫二鉀I. Og.L—1+硫酸鎂 l.Og. ΛρΗ6·0 ;(2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在70°C減壓濃縮后加入5倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂DlOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；(4)將粗晶體放入濃度為75%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。實施例10(I)制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在30°C、轉速150r/min的條件下培養3d，獲得種子液，將種子液以6%的接種量接種到發酵培養基中，在25°C、轉速200r/min的條件下培養5d，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為乳糖30g. Γ1+纈氨酸5g. L—1+蛋白胨3g. Γ1+玉米漿2g. Γ1+磷酸二氫鉀 O. 46g. L—1+ 磷酸氫二鉀 I. 0g. L—1+ 硫酸鎂 I. 0g. L—1，pH6. O ；(2)采用lOOOOr/min的轉速將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，80°C減壓濃縮后加入3倍體積的乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀；(3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂D-IOl吸附，然后依次用蒸餾水和濃度為75%的乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體；
(4)將粗晶體放入濃度為75%的乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。
權利要求
1.一種采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法，其特征在于包括如下步驟 (O制備銀耳菌的發酵培養物挑取銀耳菌種子接種于種子培養基中，在2(T30°C、轉速10(T200r/min的條件下培養2 5d，獲得種子液，將種子液以5 10%的接種量接種到發酵培養基中，在2(T30°C、轉速10(T200r/min的條件下培養flOd，獲得銀耳菌發酵培養物，所述種子液培養基和發酵培養基相同，其組成為碳源2(T30g. L—1+氮源5 15g. L—1+磷酸二氫鉀O. 46g. L—1+磷酸氫二鉀I. 0g. L—1+硫酸鎂I. 0g. L—1，pH6. 0，所述碳源和氮源為適合銀耳菌生長的碳源和氮源； (2)將發酵培養物中的發酵液和菌絲體分離，取發酵液，在40°C 80°C減壓濃縮后加入無水乙醇以除去多糖和蛋白質，高速離心除去沉淀； (3)將(2)步驟制得的發酵液濃縮后采用大孔樹脂吸附，然后依次用蒸餾水和乙醇洗脫，收集洗脫液，將其濃縮后低溫結晶得粗晶體； (4)將粗晶體放入乙醇溶液中進行重結晶，所獲得的棕紅色晶體即為卵孢菌素晶體。
2.根據權利要求I所述的采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法，其特征在于(I)步驟中培養基所采用的碳源為葡萄糖、蔗糖、’乳糖或麥芽糖，氮源為有機氮源或/和氨基酸。
3.根據權利要求2所述的采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法，其特征在于所述有機氮源為豆柏、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉中的一種或幾種的組合，所述氨基酸為纈氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸中的一種或幾種的組合ο
4.根據權利要求I所述的采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法，其特征在于(2)步驟中所加入的乙醇體積為濃縮后發酵液體積的2飛倍。
5.根據權利要求I所述的采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法，其特征在于(3)步驟中洗脫時所用乙醇的濃度為55、5%。
6.根據權利要求I所述的采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法，其特征在于(4)步驟中所用乙醇的濃度與(3)步驟所用乙醇的濃度相同。
全文摘要
本發明公開了一種采用銀耳菌制備卵孢菌素晶體的方法，該方法先通過選擇合適的培養基制備銀耳菌的發酵培養物，再將發酵液加入乙醇除去多糖和蛋白質后，采用大孔樹脂吸附、洗脫后低溫結晶。本發明具有發酵周期短、發酵液中卵孢菌素含量高、操作簡單、使用有機溶劑少等優點。
文檔編號C12P7/26GK102703528SQ201210184940
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者何鋼, 劉嵬, 茍小軍, 陳封政, 顏軍 申請人:成都大學