專利名稱：山羊真皮成纖維細胞系的構建方法
技術領域：
本發明涉及山羊真皮成纖維細胞系的構建方法，屬于細胞生物學與生物技術領域。
背景技術：
真皮成纖維細胞(Dermal fibroblast, DFB)是構成皮膚真皮組織的主要細胞,其正常的增殖分化對于皮膚生理機能調控、傷口愈合及組織工程皮膚重建等方面均發揮著重要作用。在皮膚組織中，真皮成纖維細胞能夠分泌表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)和轉化生長因子-P (TGF-0 )等多種生長因子，他們作用于表皮細胞、血管內皮細胞以及毛囊相關細胞，可誘導表皮形成，加速血管生長，調控毛囊生成與周期性再生。此外，真皮成纖維細胞還能夠為其它細胞提供膠原蛋白、彈性蛋白等多種細胞外基質。這些細胞 外基質作為真皮結構的重要組成部分，對皮膚正常結構維持、其它皮膚細胞的粘附以及毛囊等皮膚附屬器官形態保持均具有重要作用。近年來研究發現，體外培養的真皮成纖維細胞中可分離得到真皮干細胞，該干細胞可在特定誘導條件下分化生成脂肪細胞、肌細胞、軟骨細胞、黑素細胞以及毛乳頭細胞等多種其它組織細胞。同時，DFB因具有易于培養、增殖快速、形態和生物學特性相對穩定等特點，可為遺傳資源保護、基因組文庫構建、體細胞克隆、基因遺傳多樣性研究等領域提供理想的生物學材料。常用的真皮成纖維細胞原代培養方法主要分為兩類單純機械解離法與酶消化解離法(Christiano AM. et al. , 2004; Schlabe J. et al.，2008)。單純機械解離法是將皮膚真皮組織切割成小塊(1_2)，經PBS潤洗后，貼附于培養瓶或培養板中，待貼附牢固后加入含血清培養液，置于371、5%0)2條件下進行原代培養。該方法操作簡單，適用于從少量皮膚組織中分離細胞(Almqvist S. et al. , 2009;XiangY. et al.，2011)。酶消化解離法是將真皮組織制成組織懸液，然后浸入溫胰蛋白酶中進行消化處理。每隔半小時收集細胞一次，使用含血清培養液重懸細胞后，接種于培養瓶或培養板中啟動原代培養(Park JK.，2007)。以上兩種方法雖然均能獲得真皮成纖維細胞，但仍存在組織塊貼附不牢、細胞因酶消化而損傷等不足，且經多次傳代后較多細胞出現異常二倍體核型，以致喪失其生物學特性。上述真皮成纖維細胞的培養多以人的皮膚為細胞的組織來源。對于其它哺乳動物DFB的培養，上述培養方法與分離技術亦同樣適用。研究表明，將小鼠、牛、豬、兔等多種動物的真皮組織小塊貼附與培養器皿上，加入含FBS的商品化培養液(MEM系列、DMEM系列、RPMI-1640系列、FlO和F12系列等)，靜置培養10 15天，便可獲得較多量的DFB (DameMK. et al.,2008;梅志強等，2007 ;馬紅等，2009)。另有學者應用改進的酶消化解離方法，成功分離培養了大鼠、牛、豬、兔等家畜以及大熊貓等瀕危動物的成纖維細胞，并建立相應細胞系與細胞株(Ikumi S.et al. , 2004; TaoY. et al. , 2009; Li LF. et al. , 2009;GuanffJ.et al.，2010; Liu CQ. et al. , 2011;陳大元等，1999 ;朱慶等，2005)。盡管許多學者在動物真皮成纖維細胞培養方面進行了大量的研究，但有關山羊真皮成纖維細胞體外培養研究，尤其是山羊真皮成纖維細胞系(株)建立等方面的報道相對較少。
發明內容
技術問題為進一步開展真表皮細胞互作、皮膚附屬結構發育與分化、動物毛絨產品質量提升等研究建立離體細胞模型，并為人類創傷愈合、皮膚移植與重建等提供重要參考，本發明提供了一種山羊真皮成纖維細胞系的構建方法。本發明的目的是建立與完善山羊體外培養真皮成纖維細胞系(Dermal fibroblast cell line)的構建方法,不僅可為闡明相關激素、生長因子、紫外線等理化因素對皮膚及其附屬器官生長分化的調節機制提供研究模型；為提聞山羊毛皮廣品廣量和品質的育種改良奠定基礎；還可為提聞其它動物的毛皮品質、數量和花紋品質乃至醫學領域的人類創傷修復、組織工程皮膚研究等奠定基礎。技術方案
本發明所述的構建真皮成纖維細胞系過程中，首先利用中性蛋白酶(Dispase)冷消化法分離皮膚的表皮層和真皮層，以利于純化培養真皮成纖維細胞。然后，采用原代外植與酶消化相結合的方法，分離純一的DFB :即先利用Dispase酶分離皮膚表、真皮層后，剪切真皮部分成Imm3的小塊，再對小組織塊進行酶(胰蛋白酶)消化處理，隨即將真皮外植塊接種于6孔培養板底壁上，待貼牢后添加含有堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblastgrowth factor, bFGF)、青霉素、鏈霉素、泰樂菌素(Tylosin)和 10% FBS 的 DMEM/F12 培養液中，置5 % CO2濃度的37°C飽和濕度培養箱中啟動原代培養。當培養板中的真皮外植塊遷移出大量細胞時(約5飛天)，換為含有bFGF、青霉素、鏈霉素、泰樂菌素(Tylosin)和5%FBS的MEM培養液繼續進行培養，每3天更換I次培養液。待原代真皮成纖維細胞生長至匯合時，進行傳代，并于第一次傳代時更換為25cm2培養瓶中培養，以利于真皮成纖維細胞在體外長期傳代培養與凍存。采用該方法本細胞系已經穩定傳至56代以上，其生長分裂狀態良好。建立山羊真皮成纖維細胞系的過程如下(I)活體采集f 3日齡濟寧青山羊體側偏背部皮膚0. 5cmX0. 5cm大小的完好皮膚組織樣，將皮膚組織樣用碘酒和酒精消毒，再用生理鹽水洗凈酒精后放入無血清培養液，于冰盒中帶回實驗室，在12h內進行分離培養；(2)將步驟I)中采集的皮膚組織樣經70%酒精浸泡，剪除表面毛發后，D-Hank’ s液沖洗干凈，吸去D-Hank’ s液，加入約IOmLO. 25%中性蛋白酶，4°C消化過夜；分離皮膚表皮層與真皮層，將真皮組織剪成約Imm3的小塊，采用原代外植與消化培養相結合的方法，將真皮組織小塊進行胰蛋白酶消化處理后接種于6孔培養板中，干燥處理4h，待組織小塊貼附牢固后，每孔加入3mL完全培養液，在37°C，5% CO2濃度飽和濕度條件下啟動原代培養。待外植塊周圍遷移出大量細胞后(約5飛天)，更換為等量的維持培養液，在37°C，5% CO2濃度飽和濕度培養箱中繼續進行培養；待原代真皮成纖維細胞生長至匯合時，消化移入培養瓶中培養，按照每瓶IOmL量加入完全培養液進行培養，3天后更換為等量維持培養液，此后2 3天更換一次維持培養液；所述的完全培養液為含10ng/mL bFGFU00U/mL青霉素鈉、100 u g/mL硫酸鏈霉素、8 u g/mL Tylosin和10% FBS的DMEM/F12培養液；所述的維持培養液為含有10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素鈉、IOOii g/mL硫酸鏈霉素、8 ii g/mL Tylosin和5% FBS的MEM培養液；
(3)當步驟2)所得的原代細胞生長至會合狀態后，PBS液沖洗細胞I次，加入約ImL濃度為0. 25 %的胰蛋白酶浸潤細胞約5秒，棄去，再加入4mL濃度為0. 25 %的胰蛋白酶消化處理約5min ;當觀察到有細胞貼附的瓶壁逐漸變白，且輕輕晃動有微小細胞團塊脫落時，加入6mL完全培養液洗凈殘余消化液,1000r/min下離心5min后收集細胞,消化移入培養瓶中，按照每瓶IOmL量加入完全培養液繼續培養，3天后更換為等量維持培養液，此后每3天更換維持培養液I次；所述的PBS緩沖液由8g/L NaCUO. 2g/L KCl、I. 56g/LNa2HPO4 H2O和0. 2g/L KH2PO4組成；所述的完全培養液為含10ng/mLbFGF、100U/mL青霉素鈉、100 u g/mL硫酸鏈霉素、8 u g/mL Tylosin和10% FBS的DMEM/F12培養液；所述的維持培養液為含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素鈉、IOOii g/mL硫酸鏈霉素、8 ii g/mL Tylosin和5% FBS的MEM培養液；(4)選擇對數生長期細胞，利用傳代培養的方法制成細胞懸液，然后加入凍存培養液并分裝入無菌凍存管中，封口，標記。將凍存管依次置于4°C lh、-20°C lh、-70°C 12h，最后移入液氮中長期保存細胞。復蘇細胞時，用40°C溫水快速解凍細胞，按5X105個/mL的細胞密度接種于培養瓶；所述的凍存培養液為含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12培養液。 有益效果(I)本發明利用原代外植與酶消化相結合的方法，成功啟動了 DFB的原代培養，添加相關生長因子，成功建立了濟寧青山羊真皮成纖維細胞系。(2)本發明利用Dispase酶在4°C條件下消化處理皮膚組織，能夠在較短時間內(約5飛天)收獲大量活性良好的真皮成纖維細胞，還避免了 37°C條件下酶消化對細胞表面蛋白質的破壞以及對細胞特性的改變。(3)本細胞系已穩定傳至第56代以上，其生長分裂狀態良好，細胞群體倍增時間約為48h。染色體分析結果表明，體外培養細胞盡管出現了非整倍性染色體現象，但其特征染色體數仍為60條。(4)通過對培養物進行細菌、真菌與支原體的檢測，結果顯示，培養至第56代的DFB培養液狀態沒有混濁或其它變化，培養液清亮透明，而陽性對照可見明顯的混濁或沉淀。對培養物支原體污染檢測結果為陰性，說明傳至56代以上的細胞未受到細菌、真菌與支原體的污染，細胞生長狀態正常。經上述細胞染色體分析、微生物污染檢測與熒光蛋白質粒轉染的實驗鑒定結果表明，所建真皮成纖維細胞系特征明顯，細胞活力旺盛，可為研究皮膚細胞基因表達與調控，皮膚附屬結構的生長與分化機制，尤其是皮膚主要細胞間的相互作用機制研究提供良好的實用模型。
四

圖I體外培養的青山羊真皮成纖維細胞(X 100)(a)新游離生長出的DFB，細胞呈圓形和多角形；(b)培養12天左右的DFB，大量細胞由外植塊邊緣長出；(c)傳代培養至第10代的DFB，細胞呈長梭形平行排列；(d)經Giemsa染色后的第56代DFB。
圖2凍存前與復蘇后的山羊真皮成纖維細胞(XlOO)(a)凍存前的DFB，凍存前24h測定的平均細胞活力為94.4% ；(b)復蘇后6h的DFB，多數細胞均貼附于培養瓶壁；(c)復蘇后24h的DFB，經測定的平均細胞活力為92. 1%。圖3青山羊真皮成纖維細胞生長曲線圖4第56代真皮成纖維細胞的微生物污染檢測(a)倒置顯微鏡下觀察，第56代的DFB微生物檢測呈陰性，即未被細菌和真菌污染(X100);(b)肉眼觀察培養體系未出現異常變化，培養液保持清亮；(C)被細菌污染的陽性對照(X 100) ; (d)被真菌污染的陽性對照(X 100) ; (e)支原體污染檢測結果顯示，第56代DFB不存在支原體污染，陽性對照在290bp處出現特異性條帶。圖5第56代真皮成纖維細胞的染色體分析(a)第56代DFB分裂中期染色體形態(X 1000)； (b)第56代DFB染色體核型；(C)第56代DFB染色體數目，具有正常染色體的細胞數占總細胞數的76. 7% ; (d)青山羊正常組織細胞(外周淋巴細胞)染色體核型。圖64種熒光蛋白在體外培養的山羊真皮成纖維細胞中的表達(X100)(a)增強型綠色熒光蛋白PEGFP-N3在轉染細胞48h的轉染率為47. 9%；(b)增強型綠色熒光蛋白AcGFPl在轉染細胞48h的轉染率為50. 3%; (c)紅色熒光蛋白pDsRedl_Nl在轉染細胞48h的轉染率為31. 7%;(d)增強型青色熒光蛋白pECFP-Nl在轉染細胞48h的轉染率為29.4%。
五、具體實施方案本發明以濟寧青山羊真皮成纖維細胞系的構建為例詳細說明如下(一)材料與方法( I)主要試劑與藥品DMEM/F12 (DulbeccoJ s Modified Eagle’ s Medium/Ham’ s Nutrient MixtureF12，I: I)培養基為 Gibco 公司產品；MEM (Minimum Essential Medium)培養基為 Gibco 公司產品；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)為MDgenics產品；中性蛋白酶(dispase)為Gibco公司產品；胰蛋白酶為Sigma公司產品；堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblast growth factor, bFGF)為 Sigma 公司產品；青霉素鈉(benzylpenicillinSodium)為山東魯抗辰欣藥業有限公司產品；硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate)為山東瑞陽藥業有限公司產品；泰樂菌素(tyIosin)為Sigma公司產品；秋水仙堿(colchicine)為Sigma公司產品；Giemsa染液(Giemsa stain)為Fluka公司產品；增強型綠色突光蛋白質粒(pEGFP-N3, AcGFPI)為Takara公司產品；增強型青色熒光蛋白質粒(pECFP-Nl)為Takara公司產品；紅色突光蛋白質粒(pDsRed_Nl)為Takara公司產品；陽離子脂質體(Lipofectamine 2000)為 Invitrogen 公司產品。完全培養液含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素鈉、100 u g/mL硫酸鏈霉素、8 u g/ mL Tylosin 和 10% FBS 的 DMEM/F12 培養液；維持培養液含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素鈉、100 u g/mL硫酸鏈霉素、8 u g/mL Tylosin 和 5% FBS 的 MEM 培養液；
D-Hank，s 液由 8g/L NaCl、0. 4g/L KC1、0. 06g/L Na2HPO4 H20,0. 06g/L KH2PO4'
0.35g/L NaHCO3 和 0. 4g/L 苯酚紅組成；PBS 由 8g/L NaCl、0. 2g/L KCl、I. 56g/L Na2HPO4 H2O 和 0. 2g/L KH2PO4 組成；凍存培養液含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12培養液；Carnoy^ s固定液3份甲醇加I份冰醋酸，現配現用并于冰上保存。(2)實驗動物與樣品采集懷孕母羊購自山東省濟寧市嘉祥縣種羊場，飼養于山東農業大學動物科技學院畜 牧科技試驗站羊場。活體采集出生廣3日齡的羔羊背部約0. 5cmX0. 5cm的皮膚組織樣，先用碘酒和酒精消毒，再用生理鹽水洗凈酒精，迅速將皮膚組織塊放入無血清DMEM/F12培養液，于冰盒中帶回實驗室。在12h內進行原代培養。(3)山羊真皮成纖維細胞的原代培養將步驟2)中采集的皮膚組織樣經70%酒精浸泡，剪除表面毛發后，D-Hank’ s液沖洗干凈，吸去D-Hank’s液，加入約IOmL 0. 25%中性蛋白酶，4°C消化過夜。體式鏡下，用無菌彎頭鑷分離皮膚表皮層與真皮層，用無菌眼科剪將真皮組織剪成約Imm3的小塊，浸入
0.25%胰蛋白酶中消化30min，隨后將其均勻貼附于6孔培養板中，放在37°C，5% CO2濃度的飽和濕度條件下，4h貼附牢固后按照每孔3mL加入完全培養液，放回培養箱中進行培養。待外植塊遷移出大量細胞后，更換為相同體積的維持培養液，在37°C，5 % CO2濃度的飽和濕度培養箱中繼續培養。待游離出的真皮成纖維細胞(DFB)生長成單層后，消化移入培養瓶中進行培養，按照每瓶IOmL量加入完全培養液進行培養，3天后更換為等量維持培養液，此后2 3天更換維持培養液一次。(4)細胞的傳代培養當真皮成纖維細胞(DFB)生長至匯合狀態后，進行傳代。首先棄掉舊維持培養液，PBS液沖洗細胞I次，加入約ImL濃度為0. 25%的胰蛋白酶浸潤細胞約5秒。棄去胰蛋白酶，再加入4mL濃度為0. 25%的胰蛋白酶，常溫下消化處理約5min。當觀察到有細胞貼附的瓶壁逐漸變白，且輕輕晃動有微小細胞團塊脫落時，便可加入6mL完全培養液洗凈殘余消化液，1000r/min下離心5min后收集細胞，分瓶后按每瓶IOmL量加入完全培養液放回培養箱中繼續培養，3天后更換為等量維持培養液，此后每3天更換維持培養液I次。挑選可穩定遺傳的對數期真皮成纖維細胞進行形態學觀察并測定生長曲線。(5)山羊真皮成纖維細胞的Giemsa染色將滅菌蓋玻片放入一次性細胞培養皿中，取2mL真皮成纖維細胞懸液加入培養皿中，置于CO2培養箱中培養。待DFB在蓋玻片上長成良好單層后，取出玻片并浸入無水甲醇中固定15min,再用新的無水甲醇沖洗細胞，隨即放入純的Giemsa染液中染色5"!Omin。從Giemsa染液中取出玻片經過干燥和二甲苯透明。最后，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察、拍照。(6)細胞生長曲線的測定收獲生長狀態良好的對數期DFB，采用細胞傳代的方法制成細胞懸液。經計數后，將密度約為每mL含2. 66 X 104個細胞的細胞懸液接種于24孔細胞培養板中，每孔lmL。每隔24h取出3個孔的細胞分別進行計數，取平均值。以培養時間為橫軸，每天的細胞數平均值為縱軸，作圖，即得到體外培養真皮成纖維細胞的生長曲線。
(7)山羊真皮成纖維細胞的染色體核型分析待傳代培養第56代的DFB生長至對數生長期時，將細胞移入25cm2培養瓶中，CO2培養箱中培養48h。將0. 08 u g/mL秋水仙素加入維持培養液中，繼續培養約2h。消化收集細胞，逐滴加入0. 5mL 37°C的低滲液(即0. 075mol/L的KCl溶液)并混勻，隨即補加低滲液至5 10mL，用吸管輕輕吹打均勻，37°C孵育30min。低滲處理后向管中加入ImL新鮮Carnoy’s固定液進行預固定，離心去上清后加入IOmL新鮮Carnoy’s液進行固定及再固定。最后,收集細胞進行Giemsa染色，中性樹脂封片，鏡檢。(8)微生物污染檢測將待檢DFB接種于無抗生素的完全培養液中，置于37°C，5% CO2濃度的飽和濕度培養箱中培養3d，與存在細菌污染及真菌污染的細胞進行比對，判斷其是否存在細菌及真菌污染。將傳至56代的DFB培養于無抗生素的完全培養液中，一周內不更換培養液。隨后用無菌細胞刮收集待檢細胞，沸水浴10min，12000r/min下離心5min后，吸取上清液作為PCR反應模板，DNA陽性對照和陰性對照共同放入PCR儀進行PCR反應擴增。擴增產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色觀察，照相。(9)真皮成纖維細胞的冷凍保存與復蘇選擇對數生長期細胞，利用傳代培養的方法制成細胞懸液，然后加入凍存培養液(含10 % DMSO和30 % FBS的DMEM/F12培養液)，以每毫升5 X IO6個真皮成纖維細胞的細胞密度，分裝入I. 8mL無菌凍存管中，封口，標記。將凍存管依次置于40C Ih,-200C Ih,-700C 12h，最后移入液氮中長期保存細胞。復蘇細胞時，用40°C溫水快速解凍細胞，然后逐滴加入IOmL完全培養液緩慢稀釋凍存液，混勻后低速離心，去上清。再用完全培養液適當稀釋后，按5 X IO5個/mL的細胞密度接種于培養瓶。( 10)細胞活率與貼壁率的測定運用Trypan藍染料排斥法，計數1000個真皮成纖維細胞，測定DFB凍存前和復蘇后的活率，并觀察DFB復蘇后的貼壁情況，統計分析DFB活率與貼壁率。(11)脂質體介導轉染山羊真皮成纖維細胞收獲傳至56代或56代以上的生長良好的DFB，IX IO6個/mL的細胞密度接種于6孔板中，在37°C，5 % CO2濃度的飽和濕度條件下培養至對數生長期，更換為無血清DMEM/F12 培養液，采用 Lipofectamine 2000 介導方法分別轉染 pEGFP_N3，AcGFPl, pECFP-Nl 和pDsRedl-Nl，6h后將無血清培養液更換為完全培養液繼續培養，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染24h、48h和72h的DFB生長及熒光表達情況，并測定轉染率。(二)結果與分析(I)原代外植法培養細胞的形態學及Giemsa染色的觀察結果利用原代外植法與酶消化法分離真皮成纖維細胞，在含完全培養液中，4飛天便可見真皮組織小塊邊緣向外游離生長出單個細胞，細胞呈圓形，隨后伸展成多角形的形態(圖I (a))。培養一周左右即可明顯看到大量細胞從外植塊邊緣生長出來(圖I (b))。隨著游離生長細胞的增多，生長速率逐漸加快，在第12天左右時，細胞進入對數生長期。在倒置相差顯微鏡下觀察，可見游離出的真皮成纖維細胞以長梭形和多角形為主，細胞飽滿，透明度高，胞體向外伸出f 4個片足，胞核卵圓形，胞質較少。隨后細胞向四周呈放射狀生長，形成致密單層后細胞變化為梭狀平行排列(圖I (C))。純化的真皮成纖維細胞經Giemsa染色后，可見細胞形態均一，呈梭狀或長條狀，對數生長期后的DFB能夠形成良好單層，漩渦狀或平行排列。高倍鏡下觀察，細胞質呈淡藍色，胞體近中央處有橢圓形的細胞核，呈深藍色，其中可見2 4個核仁，細胞輪廓清晰，伸展良好，細胞間排列緊密規則。當培養瓶 內的細胞形成單層后，經染色可見大部分細胞出現接觸抑制，停止分裂。采用Giemsa染色法可使細胞質與細胞核具有強烈的顏色對比性，能夠較清晰的顯示出細胞的形態以及分裂的不同時相，從而有效判斷細胞的生長狀態與健康狀況(圖I⑷)。(2)傳代培養的真皮成纖維細胞的生長特性傳代培養的DFB與其原代細胞在形態及生長速度上均無明顯差異，細胞生長與分裂依然十分旺盛。單層細胞傳代約5d后便可重新長成單層，其對于胰蛋白酶消化的敏感性也較原代培養細胞明顯增強。從體外培養的DFB對數生長期的生長曲線可以看出，細胞貼壁生長的前2天為遲緩期；第3飛天為對數生長期；第5天后便進入平穩期和衰退期(圖3)。細胞群體倍增時間為48h，說明DFB經傳代培養后其生長與分裂能力依然旺盛(表I)。表I青山羊真皮成纖維細胞接種8天的細胞密度XlO4A^mr權利要求
1.一種山羊真皮成纖維細胞系的構建方法，其特征在于包括以下步驟 (1)活體采集1-3日齡濟寧青山羊體側偏背部皮膚0.5cmX0. 5cm大小的完好皮膚組織樣，將皮膚組織樣用碘酒和酒精消毒，再用生理鹽水洗凈酒精后放入無血清培養液，于冰盒中帶回實驗室，在12h內進行分離培養； (2)將步驟I)中采集的皮膚組織樣經70%酒精浸泡，剪除表面毛發后，D-Hank’s液沖洗干凈，吸去D-Hank’s液，加入約IOmL 0. 25%中性蛋白酶，4°C消化過夜；分離皮膚表皮層與真皮層，將真皮組織剪成約Imm3的小塊，采用原代外植與消化培養相結合的方法，將真皮組織小塊進行胰蛋白酶消化處理后接種于6孔培養板中，干燥處理4h，待組織小塊貼附牢固后，每孔加入3mL完全培養液，在37°C ,5% CO2濃度飽和濕度條件下啟動原代培養；待5-6天外植塊周圍遷移出大量細胞后，更換為等量的維持培養液，在37°C ,5% CO2濃度飽和濕度培養箱中繼續進行培養；待原代真皮成纖維細胞生長至匯合時，消化移入培養瓶中培養，按照每瓶IOmL量加入完全培養液進行培養，3天后更換為等量維持培養液，此后2-3天更換一次維持培養液；所述的完全培養液為含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素鈉、100 u g/mL硫酸鏈霉素、8y g/mL Tylosin和10% FBS的DMEM/F12培養液；所述的維持培養液為含有IOng/mL bFGF、100U/mL 青霉素鈉、100 u g/mL 硫酸鏈霉素、8 u g/mL Tylosin 和 5% FBS 的 MEM 培養液； (3)當步驟2)所得的原代細胞生長至會合狀態后，PBS液沖洗細胞I次，加入約ImL濃度為0. 25%的胰蛋白酶浸潤細胞約5秒，棄去，再加入4mL濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化處理約5min ;當觀察到有細胞貼附的瓶壁逐漸變白，且輕輕晃動有微小細胞團塊脫落時，加入6mL完全培養液洗凈殘余消化液，1000r/min下離心5min后收集細胞,消化移入培養瓶中，按照每瓶IOmL量加入完全培養液繼續培養，3天后更換為等量維持培養液，此后每3天更換維持培養液I次；所述的PBS緩沖液由8g/L NaCUO. 2g/L KC1、1. 56g/L Na2HPO4 H2O和0. 2g/L KH2PO4組成；所述的完全培養液為含10ng/mL bFGFUOOU/mL青霉素鈉、100 u g/mL硫酸鏈霉素、8 u g/mL Tylosin和10% FBS的DMEM/F12培養液；所述的維持培養液為含10ng/mL bFGF、100U/mL 青霉素鈉、100 u g/mL 硫酸鏈霉素、8 u g/mL Tylosin 和 5% FBS 的MEM培養液； (4)選擇對數生長期細胞，利用傳代培養的方法制成細胞懸液，然后加入凍存培養液并分裝入無菌凍存管中，封口，標記；將凍存管依次置于4°C lh、-20°C lh、-70°C 12h，最后移入液氮中長期保存細胞；復蘇細胞時，用40°C溫水快速解凍細胞，按5X105個/mL的細胞密度接種于培養瓶；所述的凍存培養液為含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12培養液。
全文摘要
本發明涉及一種山羊真皮成纖維細胞系的構建方法，是利用原代外植與酶消化相結合的方法，成功啟動了DFB的原代培養，添加相關生長因子，成功建立了山羊真皮成纖維細胞系，采用該方法本細胞系已經穩定傳至56代以上，其生長分裂狀態良好。本發明不僅可為闡明相關激素、生長因子、紫外線等理化因素對皮膚及其附屬器官生長分化的調節機制提供研究模型；為提高山羊毛皮產品產量和品質的育種改良奠定基礎；還可為提高其它動物的毛皮品質、數量和花紋品質乃至醫學領域的人類創傷修復、組織工程皮膚研究等奠定基礎。
文檔編號C12N5/071GK102719394SQ20121020392
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者崔志峰, 張嬌, 曾勇慶, 王慧, 胡艷霞, 董忠典 申請人:山東農業大學