專利名稱：Hla-a0201限制性抗cea抗原特異性ctl的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術開發與應用研究領域，涉及HLA-A0201限制性抗CEA抗原特異性CTL制備方法。
背景技術：
一、腫瘤治療的困境與機會惡性腫瘤已成為人類第一號“殺手”，手術、放療與化療是治療腫瘤的三大常規方法，能在短期內有效的減輕腫瘤負荷，但仍不能有效清除腫瘤細胞。微小殘留病灶、對放療、化療的部分敏感和耐藥是腫瘤復發及轉移的根源，而復發與轉移正是腫瘤患者死亡的主要 原因。常規治療方法已力不從心，開發新型的腫瘤治療技術與產品迫在眉睫。二、細胞免疫治療技術的誕生與發展上世紀80年代起免疫學與腫瘤學的迅速發展，1982年美國NIH Rosenberg教授為首的研究小組研制出淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)免疫療法，并在后續研究中對LAK細胞的臨床應用進行了深入的探討。但是LAK細胞殺傷力不夠強，臨床應用需要大量輸注(3X lO.11)，另一方面擴增能力有限，需要在輸注細胞的同時大劑量應用白細胞介素-2(IL-2) (10萬IU/kg,q8h),因而產生了相關的不良反應。而后Rosenberg又提出了腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其殺瘤能力較LAK有了明顯提高，并且無需大劑量IL-2聯合應用，但細胞需要從腫瘤組織中分離獲得，這極大限制其廣泛的臨床應用。在以上的工作基礎上，1991年Stanford大學的Schmidt-Wolf等采用干擾素Y (IFN- y )、IL-2和鼠抗人CD3單克隆抗體(Mouse anti-HumanCD3mAb)共同誘導出了具有強大抗腫瘤活性的細胞群,命名為細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)。樹突狀細胞(DCs)是迄今為止已知的體內功能最為強大的專職抗原遞呈細胞(APC)，其表面存在豐富的抗原捕獲分子，抗原遞呈分子(MHC I類和MHC II類分子)，免疫共刺激分子(⑶80、⑶83、⑶86、⑶40等)。經抗原刺激后的DC細胞向淋巴結遷移，將其攜帶的抗原信息傳遞給相應的T淋巴細胞，啟動、激發CD4+/CD8+T細胞免疫應答，特異性地殺滅腫瘤細胞。同時經抗原刺激后的DCs可分泌白細胞介素-8 (IL-8)、干擾素a (IFN-a)、白細胞介素-12 (IL-12)、腫瘤壞死因子a (TNF-a )等，增強機體非特異性免疫應答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐劑”的美稱，其發現者Ralph Steinman教授獲得2011年諾貝爾醫學獎。鑒于DC在機體免疫防御系統中所處的中心地位，基于DC開發的抗腫瘤疫苗已使之成為最先進、最有希望的腫瘤免疫治療技術之一，近年來國內外學者對其進行了廣泛的探索。1992年Stanford醫學院的2位教授成立了世界上第一家以DC為基礎的腫瘤疫苗公司(Dendreon, CA),該公司的產品Provenge已于2010年4月29日獲得FDA批準上市。但是DC在體內的功能受到患者本身免疫狀態，腫瘤微環境的影響，而腫瘤患者體內存在大量抑制因子，因此DC的體內效果并不如體外效果理想。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)構建是近期興起的免疫治療技術，因其具有特異、直接殺傷腫瘤靶細胞的能力，因此成為研究的熱點。
三、癌胚抗原(CEA)在腫瘤免疫治療中的作用癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)是1965年首次在腸道腫瘤及胚胎消化道中被發現的，由686個氨基酸組成，分子量為18 20kD。近來研究證實CEA是免疫球蛋白超基因家族的成員之一，可能參與細胞識別與細胞間反應，且CEA還是一種粘附因子，可促進腫瘤細胞與正常細胞的結合，并對腫瘤的轉移起重要作用。因此CEA不僅是一種單純的腫瘤標志物，而且是與腫瘤惡性化有關的分子，在多種腫瘤中表達。超過90%的原發性結直腸癌表達CEA，尤其是在肝轉移患者中，血清CEA濃度在80%肝轉移患者中升高。胃癌患者血清CEA的陽性率在40%左右，且與分期有關，隨病程進展逐漸升高。40%-80%的肺癌患者出現CEA升高，血清CEA水平與治療的反應性及預后有較好的相關性。CEA亦可產生自乳腺組織。因此CEA可以作為腫瘤免疫治療的有效靶抗原。CEA抗原高表達的肺癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌的發病率和死亡率均是排名前三位的腫瘤，而目前還未有針對CEA抗原的藥物上市，因此開發新型針對CEA靶點的藥物勢在必行。抗CEA特異性CTL的開發是一種發展方向。
四、CTL作用機理I、機體T細胞免疫反應過程機體存在龐大的T細胞庫，通過其表面表達不同的T細胞受體(TCR)特異識別不同的外部抗原分子(細菌、病毒和腫瘤抗原多肽)，被活化為具有殺滅靶細胞的CTL，清除細菌、病毒的感染和腫瘤細胞，且能產生免疫記憶性CTL，防止細菌、病毒的再次入侵和腫瘤的復發。CTL免疫應答大致分四個階段(I)抗原識別APC通過表面受體識別并捕獲抗原(細菌、病毒、腫瘤細胞)；(2)抗原加工與遞呈抗原經APC消化、裂解成多肽分子，后者與APC胞內豐富的MHC- I類或II類分子結合分別形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽復合物，并被轉運至APC表面；(3) T細胞激活(雙信號學說)=APC與T細胞相遇，T細胞通過自身TCR識別APC遞呈的MHC-I/II-多肽復合物，其中⑶8+T細胞識別MHC-I-多肽復合物，⑶4+T細胞識別MHC-II-多肽復合物，T細胞接受了抗原的刺激信號(第一信號)加上免疫共刺激信號(第二信號)開始活化，具有細胞毒性作用即CTL ；(4)靶細胞殺滅活化CTL循環至抗原所在部位，通過CTL表面的TCR特異識別抗原表達細胞后進行殺傷和清除。但，已發現腫瘤患者體內存在大量免疫抑制因子，影響CTL的有效活化和增殖，數量甚少，不足以與迅速增殖的腫瘤抗衡。若能在體外制備大量抗原特異性CTL并回輸給患者，可直接、快速殺傷腫瘤細胞起到治療作用，對常規治療無法清除的殘留腫瘤細胞進行殺滅，將可以防止腫瘤的復發和轉移。2、CTL表型與功能差異根據CTL表面分子的表達種類可分為兩型中央記憶型CTL (CTLcm)和效應記憶型 CTL (CTLem)0Klebanoff等研究發現表型分析為CD3+CD45R0+CD62L+CCR7+的CTLcm具有更強的抗腫瘤能力Johnson等比較了 MART-I TCR基因修飾的CTL_cm和CTL_EM，結果發現前者消退惡性黑色素瘤細胞的能力是后者的10倍。Berger等研究結果還顯示CTL.輸注后較表型為CD3+CD45RO+CD62L-CCR7-的CTL_EM在體內能存活更長的時間。3、CTL技術開發現狀綜合國內、國外CTL體外制備技術可歸類為三種方法與來源(I)腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)體外擴增法從腫瘤患者腫瘤組織中分離TIL，加入白細胞介素-2(IL_2)培養，克隆稀釋法篩選腫瘤抗原陽性的T細胞克隆，再加入鼠抗人CD3單克隆抗體和IL-2進行擴增培養獲得。Li等選擇HLA-A201陽性的IV期惡性黑色素瘤患者，將其腫瘤組織制備成單細胞懸液后，加入IL-2培養，5周后篩選擴增細胞中⑶8+T+MART-1+的陽性T細胞克隆，再加入 鼠抗人CD3單克隆抗體和輻照后的PBMC飼養細胞擴增培養，次日加入IL-2，再培養12天可獲得CTLs，能對負載MART-I多肽的T2細胞株特異性識別和殺傷。(2) TCR基因修飾法TCR是T細胞識別抗原、介導免疫應答的關鍵分子，包括a、@、Y、S四條鏈，由二硫鍵連接成a/0和Y/S兩種異二聚體，其中a/0+T細胞占外周血T細胞的90-95%，是主要的免疫效應細胞。TCR基因修飾即通過外源質粒轉染自體T淋巴細胞，導入能識別特異性抗原多肽的TCR基因，挑選陽性克隆，在體外擴增培養獲得CTL。較為常用的質粒有逆轉錄病毒質粒或慢病毒質粒。Morgan等采用抗⑶3+⑶28+磁珠激活⑶8+T細胞，應用慢病毒質粒轉染修飾MART-I或gplOO特異性的TCR基因，采用鼠抗人⑶3單克隆抗體和IL-2培養體系制備CTLs，在12天能擴增培養至IO9個細胞，用于15例HLA-A2+的黑色素瘤患者的治療，結果顯示有2例患者出現了明顯的臨床療效，I例52歲男性患者的腋窩轉移病灶消失，肝轉移病灶縮小了 89%，無病生存期為21個月；1例30歲男性患者，肺部轉移病灶消失，無病生存期為20個月。Perro等采用白細胞介素-15 (IL-15)和白細胞介素_21 (IL-21)細胞因子組合促進TCR基因轉染非增殖的T細胞，可以維持T細胞高表達⑶62L和⑶28。(3)體外抗原致敏法用人工APC (Artificial APC)，或抗原(蛋白質，多肽，或全細胞)體外反復刺激T細胞，獲得抗原特異性CTL。浙江大學的發明專利(專利號CN102168066A)體外誘導乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法即采用該方法。將MHC- I -Ig和抗⑶28mAb包被磁珠構建人工APC，抗原表位肽負載APC后，體外致敏3-4周，再以磁珠吸附分離抗原特異性CTL，Tetramer染色鑒定。上述三種方法的缺陷(I) TIL體外擴增法①需要獲得患者的新鮮腫瘤組織作為CTL來源，僅限于可手術的患者，且腫瘤組織來源有限；②TIL分離，CTL克隆的獲取與鑒定方法復雜，腫瘤組織中各種細胞成分較多，較復雜，分離細胞的時間長，一般都需要I個月以上；③TIL中混有⑶4+⑶25+Treg亞群，其會抑制CTL擴增效率；
④由于體外分離擴增時間長，增加了污染的機會。(2) TCR基因修飾法①外源性質粒(逆轉錄病毒或慢病毒等)的引入，給臨床應用帶來一定的風險；②內源性TCR干擾，導入的TCR基因可能并不能導入預期的位點，而與內源性的TCR發生錯排，其能識別抗原不是預期設計的，且是未知的，存在很大的風險。( 3)體外人工APC負載抗原致敏法
①引入外源物質人工APC，制備的CTL是否有人工APC殘留仍是疑問；②人工APC體外致敏CTL的周期較長，需要3_4周，獲得CTL還需要擴增培養后才能滿足臨床治療的需要，因此體外培養的周期長，污染的幾率較大。目前還沒有文獻報導過制備時間短、擴增倍數高、CTL純度高且殺傷效果好的HLA-A201限制性抗原特異性CTL的制備方法。

發明內容
本發明的目的是針對上述技術問題提供一種制備時間短、擴增倍數高、CTL純度高且殺傷效果好的HLA-A201限制性抗CEA抗原特異性CTL的制備方法。本發明的目的是通過下列技術方案實現的HLA-A0201限制性抗原特異性CTL的制備方法，該方法包括下列步驟a.第一步CTL前體細胞來源細胞的富集與純化方法用自動單個核細胞采集儀(單采儀)采集外周單個核細胞(PBMC)作為細胞來源；采用臨床級陰性磁珠分離法，從PBMC中富集、純化CTL前體細胞即CD8+T淋巴細胞。b.目標CTL誘導與第一輪擴增用負載HLA-A0201限制性CEA抗原多肽的自體成熟樹突狀細胞(mDC)刺激⑶8+T淋巴細胞，不僅提供給T細胞活化的第一信號(抗原)，同時DC提供給T細胞活化必須的第二信號(免疫共刺激分子⑶40、⑶80、⑶83等)；同時加入rhIL-2和rhIL_7兩種細胞因子聯合促進T細胞生長，抑制活化誘導的細胞凋亡反應(AICD)，延長活化細胞的生存周期。c.目標CTL純化方法在第一輪用負載抗原的mDC刺激并擴增目標CTL數量后,米用Tetramer標記方法和流式細胞分選術再一次純化目標CTL(目標CTL是指表達識別CEA抗原多肽TCR的⑶8+T，即Tetramer+Q)8+T淋巴細胞)，即選擇Tetramer+Q)8+T,剔除非特異性擴增的T細胞，以減少其對目標CTL增殖的影響。d.目標CTL的第二輪擴增采用固相包被的anti-human-⑶3mAb和IL_2刺激目標CTL的生長與增殖；再加入經Y射線輻照的自體PBMC增強對目標CTL的活化；加入rhIL-15 —方面可以促進記憶性T細胞的增殖，另一方面可抑制細胞的凋亡。e.第二輪擴增后目標CTL表型鑒定采用流式細胞術對已制備的目標CTL進行表型分析，根據其表達的分子譜不同將其分為中心記憶性 CTL ( CTL_cm :CD8+CD45R0+CD62L+CCR7+)和效應性 CTL (CTL_EM CD8+CD45R0+CD62L-CCR7-)。所述的制備方法，步驟b中的目標抗原為CEA抗原多肽長度優選9-15個氨基酸，進一步優選序列如SEQ ID NO. I所示的HLA-A0201限制性CEA抗原多肽。所述的制備方法，步驟b中負載目標抗原的自體成熟DC是通過下列方法制備得到的PBMC貼壁后加入rhGM-CSF、rhIFN a、滅活的混合正常人AB血清和RPMI1640培養基培養三天，收獲的DC再加入目標抗原孵育即得。所述的制備方法，步驟c中用于目標CTL擴增的Y射線輻照的自體PBMC是通過下列方法制備得到的留取部分單采獲得的PBMC，經30-50GY的、射線輻照后保存；保存液含20% (V/V) DMSO和20% (V/V)正常人AB血清的RPMI1640培養液，保存溫度_80°C超低溫保存。所述的制備方法，步驟d中用于目標CTL擴增的CD3單抗克隆抗體 (anti-human-⑶3mAb,簡稱⑶3單抗)是如下操作的將⑶3單抗固相包被于用于擴增細胞的容器表面，CD3單抗可與多個CTL表面的CD3分子結合，促進CTL細胞克隆的形成，促進細胞接觸，快速進入增殖周期。 所述的制備方法，各步驟中刺激分子或細胞的用量分別為a.目標CTL第一輪擴增每次加入量rhIL_2終濃度為500_750IU/ml，rhIL-7終濃度為50-75ng/ml，DC與起始T細胞數量比為1:5。b.目標CTL第二輪擴增rhIL-2終濃度為200_500IU/ml，rhIL-15終濃度為100-250ng/ml，CD3單克隆抗體包被濃度為I. 0-2. 5 u g/ml, y射線輻照的PBMC與起始CTL數量比為2:1。所述的制備方法，各步驟操作后細胞數量與表型特征見表I。表I
權利要求
1.HLA-A0201限制性抗CEA抗原特異性CTL制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟 a.CTL前體細胞來源細胞的富集與純化 單采收集外周單個核細胞作為CTL前體細胞來源；采用臨床級陰性磁珠分離法，從收集外周單個核細胞中富集、純化CTL前體細胞即CD8+T淋巴細胞； b.目標CTL誘導與第一輪擴增 用負載HLA-A0201限制性CEA抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，同時加入rhIL-2和rhIL-7兩種細胞因子聯合促進T細胞生長；第二周再重復刺激一次，完成第一輪擴增； c.目標CTL純化方法 采用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL,即選擇Tetramer+Q)8+T淋巴細胞； d.目標CTL第二輪擴增 采用固相包被的anti-human-⑶3mAb和IL-2刺激目標CTL的生長；加入經Y射線福照后的自體外周單個核細胞增強對目標CTL的活化；加入rhIL-15繼續培育，完成第二輪擴增，收集鑒定。
2.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟b中HLA-A0201限制性CEA抗原多肽長度為9-15個氨基酸。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的HLA-A0201限制性CEA抗原多肽序列如SEQ ID NO. I所示。
4.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟b中負載HLA-A0201限制性CEA抗原多肽的成熟樹突狀細胞是通過下列方法制備得到的將外周單個核細胞貼壁后加入含rhGM-CSF、rhIFN a、滅活的混合正常人AB血清和RPMI1640培養基培養三天，收獲DC再加入目標抗原孵育即得。
5.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟c中用于目標CTL擴增的Y射線輻照的自體外周單個核細胞是通過下列方法制備得到的留取部分權利要求I中單采獲得外周單個核細胞，經30-50GY的Y射線輻照后保存；保存液含20% (V/V)DMSO和20%(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培養液，保存溫度-80°C超低溫保存。
6.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟d中用于目標CTL擴增的anti-human-Q)3mAb是如下操作的將anti-human-Q)3mAb固相包被于用于擴增細胞的容器表面，anti-human-CD3mAb與多個CTL表面的CD3分子結合，促進CTL細胞克隆的形成，促進細胞接觸，快速進入增殖周期。
7.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于目標CTL是指表達識別CEA抗原多肽TCR 的 CD8+T，即 Tetramer+CD8+T 淋巴細胞。
8.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于各步驟中刺激分子或細胞的用量分別為 a.目標CTL第一輪擴增每次加入量rhIL-2終濃度為500_750IU/ml，rhIL-7終濃度為50-75ng/ml，DC與起始CD8+T細胞數量比為1:5; b.目標CTL第二輪擴增rhIL-2終濃度為200_500IU/ml，rhIL-15終濃度為100_250ng/ml, anti-human_CD3mAb包被濃度為I. 0-2. 5 y g/ml, y射線福照的外周單個核細胞與起始CTL數量比為2 I。
9.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于各步驟操作后細胞數量與表型特征分別為
全文摘要
本發明公開了HLA-A0201限制性抗CEA抗原特異性CTL的制備方法。該方法通過單采收集外周單個核細胞，富集、純化CD8+T淋巴細胞；用負載HLA-A0201限制性CEA抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，并用rhIL-2和rhIL-7聯合促進T細胞生長；采用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL；采用固相包被的抗人CD3單抗和IL-2刺激目標CTL的生長；加入γ射線輻照后的自體PBMC增強目標CTL的活化；加入rhIL-15培育擴增，收集鑒定。本方法制備的目標CTL具備高純度，高增殖能力，高殺傷活性，高比例CTL-CM，可用于腫瘤等免疫治療。
文檔編號C12N5/0783GK102719400SQ20121023157
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者時宏珍 申請人:時宏珍