專利名稱：一種改進的海帶染色體的制備方法
技術領域：
本發明涉及染色體的制備方法，尤其涉及改進的海帶染色體的制備方法。
背景技術：
海帶的孢子體個體大，是人工栽培的對象。海帶配子體為微小的絲狀體，是人工培 育苗種的對象，也是海帶種質資源保存的基礎。海帶配子體有雌雄之分，雌配子體由一個或 幾個細胞組成，雄配子體一般由多個細胞組成，雄配子體細胞較雌配子體細胞個體小。在成 長過程中，雌配子體增加細胞的體積，而雄配子體則進行細胞的分裂，增加細胞的數目，形 成多細胞的分枝體或團在一起的球狀體。海帶染色體較小，由于染色體制備方法的不同，致使海帶染色體數目存在爭議。在 早期主要是用切片法和鐵蘇木精染色。切片法是比較原始的方法，用于計算染色體費時且 不精確。隨后多用壓片法和醋酸洋紅、水合氯醛醋酸鐵蘇木精或醋酸地衣紅染色。二十世 紀六七十年代國內外學者對海帶配子體細胞通過壓片法觀察染色體數目，多數學者認為只 有22條，少數學者認為有31條。到二十世紀九十年代，日本學者Hiroshi Yabu等認為海 帶配子細胞約有32條染色體(見論文“四種海帶(褐藻)的染色體數目”，《日本藻類學雜 志》，1991年第39卷第2期，第185-187頁)。2004年中國學者周立然等利用壓片及蘇木 精染色觀察到海帶配子體具有31條染色體。壓片法得到的染色體多呈點狀，無法鑒別染色 體形態，不能作核型分析(見論文“一種改進的海帶雄配子體(不等鞭毛類)染色體制備 方法”，《水生生物學》，2004年第512期，第141-144頁)。劉宇等學者(見論文“海帶染色 體的DAPI染色及核型初步分析”，刊登在《水產學報》2012年第01期，第50-54頁)利用滴 片法及DAPI熒光染料染色的方法，觀察到海帶配子體細胞具有31條染色體，染色體分散較 好，數目形態可辨。但使用熒光染料染色只能通過熒光顯微鏡才能觀察結果，熒光顯微鏡市 場銷售價位較高，不能普及使用。

發明內容
本發明提供一種染色體分散好，形態可辨且可數的改進的海帶染色體的制備方法。本發明的技術解決方案是一種改進的海帶染色體的制備方法，其步驟是(1)海帶配子體預處理海帶配子體離心后吸除多余水分保留海帶配子體沉淀， 并加入秋水仙素溶液振蕩搖勻靜置；(2)海帶配子體低滲海帶配子體用氯化鉀溶液低滲；(3)海帶配子體固定低滲后的海帶配子體用卡諾固定液進行固定；(4)酶解去壁用纖維素酶R-10溶液、果膠酶溶液、離析酶R-10溶液的混合酶液 進行酶解去壁。(5)冷滴片酶解去壁后的海帶配子體離心后用移液槍吸除上清液，加入冰乙酸，振蕩混勻成細胞懸液，用滴管吸取細胞懸液在離預冷的載玻片的上面滴片，載玻片底面經 過酒精燈火焰燒一次后自然晾干或烘干；(6)姬姆薩染色對附著在載玻片上的海帶配子體染色體采用姬姆薩染色液進行 染色。(7)顯微鏡下觀察和拍照。上述步驟(1)的秋水仙素溶液為重量體積比為0. 2%的秋水仙素溶液，海帶配子 體加入0. 2%的秋水仙素溶液后于4°C下靜置7 8小時。上述步驟(2)的氯化鉀溶液的濃度為0. 075mol/L，海帶配子體沉淀加入濃度為 0. 075mol/L的氯化鉀溶液后振蕩搖勻，在室溫下靜置30 40分鐘。上述步驟(3)的卡諾固定液是由甲醇和冰乙酸按3 1的體積比配置，卡諾固定 液4°C下固定三次，每次20分鐘，最后再換新的卡諾固定液4°C下固定24小時。上述步驟(4)中，纖維素酶R-10溶液、果膠酶溶液、離析酶R-10溶液按2 1 1 的體積比混合搖勻后成為混合酶液，現配現用，4°C下放置。上述步驟(5)中，離預冷的載玻片30 40厘米的高度進行滴片。本發明的技術效果是本發明采用冷滴片及吉姆薩染色的方法，得到了染色體分 散較好，形態可辨且可數的染色體分裂相。同時姬姆薩染色是對整條染色體染色，不會出現 淡染區域，且使用普通顯微鏡即可觀察結果。本發明方法采用冷滴片及姬姆薩染色的方法， 得到了染色體分散較好，形態可辨且可數的染色體分裂相。另外，本發明方法簡便快速，可 重復性強，一般實驗室均可以操作。


1、圖1為本發明方法制備的東方2號雜交海帶配子體染色體照片。2、圖2為中國學者周立然利用壓片法及蘇木精染色的海帶配子體染色體照片。3、圖3為姬姆薩染色載玻片搭橋俯視圖。4、圖4為姬姆薩染色載玻片搭橋側視圖。圖中，1、玻璃板，2、有染色體標本的的載玻片，3、載玻片，4、有染色體標本的的載 玻片與玻璃板之間的孔隙。
具體實施方案下面結合附圖和實施例詳細說明一、本實施例海帶配子體取自山東東方海洋科技股份有限公司國家海藻工程技術 研究中心種質保存庫保存的“東方2號”雜交海帶配子體。海帶配子體也可按照如下方法采集在海帶成熟季節，選擇健壯孢子體，取下有幼 孢子囊的種海帶塊，用滅菌海水(生海水煮沸2分鐘即得到滅菌海水)及滅菌棉花(脫脂 棉花用牛皮紙包裹后入壓力蒸汽滅菌器在溫度120°C，壓力0. 165MPa滅菌15分鐘即得到滅 菌棉花)擦洗多遍，清除附著物和雜藻，種海帶塊陰干后，置于添加了硝酸鈉及磷酸二氫鉀 的滅菌海水培養液中，使海帶孢子集中放散1 3個小時，然后將海帶孢子水倒入放置有載 玻片的染色缸中，使海帶孢子附著在載玻片上形成海帶胚孢子，在適宜的溫度(10±2°C ) 和光照(1000 1500LX)條件下培養一周左右即形成雌、雄可辨的配子體。這時，在顯微鏡下采用微細管分離法將單個的雌、雄配子體分別取出，雌、雄配子體分別置于不同的滅菌海 水培養液中進行單獨培養，雌、雄配子體在滅菌海水培養液中持續24小時在1500LX光照條 件下進行營養生長，就能形成無性繁殖系，即配子體克隆。然后進入海帶配子體保存階段， 海帶配子體在滅菌海水培養液中持續光照(1500LX)，每7天換一次滅菌海水培養液，即將 原滅菌海水培養液倒出，保留海帶配子體，再加入等量的滅菌海水培養液。二、本實施例采用如下實驗儀器a、光照培養箱SPX-300B_G型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠b、臺式離心機TGL_16C型，上海安亭科學儀器廠c、冰箱BCD_216TX型，青島海爾股份有限公司d、顯微鏡XSP_C204型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠e、數碼相機佳能IXUS 310HSf、全溫培養搖床QYC-200型，上海新苗醫療器械制造有限公司三、本實施例采用如下實驗試劑1)配置硝酸鈉溶液稱取121克硝酸鈉(分子式NaN03，上海國藥集團化學試劑有 限公司生產，分析純)，用滅菌海水溶解后，用滅菌海水定容至500ml。本實施例的滅菌海水 均為生海水煮沸2分鐘，并自然冷卻到室溫的滅菌海水。2)配置磷酸二氫鉀溶液稱取17. 5克磷酸二氫鉀(分子式KH2P04，上海國藥集團 化學試劑有限公司生產，分析純)，用滅菌海水溶解后，用滅菌海水定容至1000ml。3)配置滅菌海水培養液分別量取上述1ml硝酸鈉溶液和1ml磷酸二氫鉀溶液， 加到4000ml經煮沸2分鐘并自然冷卻到室溫的滅菌海水中，搖勻備用。4)配置0. 2%秋水仙素溶液稱取0. 2克秋水仙素粉末(上海藍季科技發展有限 公司，進口分裝)，先用1ml無水乙醇溶解后，再用滅菌海水定容至100ml，用帶蓋的棕色瓶 盛裝并于4°C冰箱中保存。5)配置0. 075mol/L氯化鉀溶液稱取氯化鉀(化學式KC1，上海國藥集團化學試 劑有限公司生產，分析純)0. 5588克，用滅菌海水溶解后，用滅菌海水定容至100ml。6)配置卡諾固定液用無水甲醇與冰乙酸按體積比3 1的比例配置，現配現用， 4 °C冰箱放置。7)配置1 %濃度的纖維素酶R-10(Cellulase “0nozuka”R_10)溶液稱取0. 1克 纖維素酶R-10粉末(日本Yakult公司生產)，溶于10ml的pH為7. 0的0. 067mol/L磷酸 鹽緩沖液中，搖勻備用。8)配置1 %濃度的離析酶R-10 (Macerozyme R-10)溶液稱取0. 05克離析酶R-10 粉末(北京索萊寶科技有限公司生產)，溶于5ml的pH為7.0的0. 067mol/L磷酸鹽緩沖液 中，搖勻備用。9)配置1 %果膠酶溶液稱取0.05克果膠酶粉末(上海藍季科技發展有限公司生 產)，溶于5ml的pH為7. 0的0. 067mol/L磷酸鹽緩沖液中，搖勻備用。10)配置pH為7. 0的0. 067mol/L磷酸鹽緩沖液配置A液0. 067mol/L磷酸二 氫鉀溶液，稱取磷酸二氫鉀(分子式KH2P04，上海國藥集團化學試劑有限公司生產，分析 純)9. 112克，用50 100ml蒸餾水60°C下溶解后，用蒸餾水定容至1000ml。配置B液 0. 067mol/L十二水磷酸氫二鈉溶液，稱取十二水磷酸氫二鈉(分子式Na2HP04 12H20，上海國藥集團化學試劑有限公司生產，分析純)23. 986克，用50 100ml蒸餾水60°C下溶解 后，用蒸餾水定容至1000ml。量取38. 8ml的A液和61. 2ml的B液混合，既可得到pH為7. 0 的0. 067mol/L的磷酸鹽緩沖液。11)配置姬姆薩(Giemsa)染色液將姬姆薩濃縮液與姬姆薩稀釋液按體積比 1 9的比例混合，現用現配，用帶蓋棕色瓶保存。姬姆薩濃縮液與姬姆薩稀釋液均為北京 索萊寶科技有限公司生產。12)甲醇、無水乙醇、冰乙酸均為上海國藥集團化學試劑有限公司生產，分析純。四、本實施例海帶配子體染色體制備方法(1)秋水仙素預處理培養狀態良好的海帶配子體系指顯微鏡下觀察海帶配子體細胞大小均勻，色素分 布均勻的海帶配子體(雌、雄配子體均可)，取體積有大米粒大小的培養狀態良好的海帶配 子體放入體積為L 5ml塑料離心管中，在轉速1000rpm(轉/分鐘)，離心5min(分鐘)后 用移液槍吸除多余水分保留海帶配子體沉淀，加入上述0.2%的秋水仙素溶液lml，振蕩搖 勻，于4°C冰箱中靜置7 8小時。這里采用秋水仙素預處理目的是①阻止或破壞植物有絲分裂過程中紡垂體微管 的形成，由于沒有紡垂體的作用，細胞有絲分裂過程被阻抑在細胞分裂中期階段，從而可以 累積比較多的處于細胞分裂中期的染色體圖像促進染色體濃縮變短，減少染色體之間 相互纏繞重疊，有利染色體的高度分散；③改變胞質粘度，促進染色體清晰，促進細胞質清潔。(2)海帶配子體低滲在轉速lOOOrpm，離心5min后用移液槍吸除上清，保留配子體沉淀，加入濃度為 0. 075mol/L的氯化鉀(KC1)溶液1ml低滲，振蕩搖勻，室溫下靜置30分鐘。低滲的主要作用有兩個①促進細胞質壁分離，有利于酶解法去除細胞壁；②促 進細胞質粘度改變，有利于染色體圖像清晰。(3)海帶配子體固定在轉速lOOOrpm,離心5min后用移液槍吸除上清，保留海帶配子體沉淀。加入新 配置的4°C放置的卡諾固定液1ml，用移液槍輕輕吸打(吸入并推出)溶液10次，在4°C冰 箱中靜置20min,在轉速lOOOrpm,離心5min后用移液槍吸除上清，保留配子體沉淀。再加 入新配置的4°C放置的卡諾固定液1ml，用移液槍輕輕吸打溶液10次，在4°C冰箱中靜置 20min,在轉速lOOOrpm,離心5min后用移液槍吸除上清，保留配子體沉淀。再次加入新配置 的4°C放置的卡諾固定液1ml，用移液槍輕輕吸打溶液10次，在4°C冰箱中靜置20min，在轉 速lOOOrpm,離心5min后用移液槍吸除上清，保留配子體沉淀。最后加入1ml卡諾固定液, 在4°C冰箱中靜置24小時以上。固定的主要作用①迅速殺死細胞，保留分裂圖像。②使染色體核蛋白變性、沉淀， 呈現出染色體真實形態及結構。③使細胞質原生質體蛋白變性、沉淀，有利于染色體背景清 晰。(4)酶解去壁在轉速lOOOrpm,離心5min后用移液槍吸除上清，保留海帶配子體沉淀。加蒸懼 水1ml入離心管，用移液槍輕輕吸打溶液10次沖洗海帶配子體沉淀，在轉速lOOOrpm，離心5min后再用移液槍吸除離心管中的蒸餾水，注意不要吸走海帶配子體，保留海帶配子體。 加入新的蒸餾水1ml入離心管，用移液槍輕輕吸打溶液10次沖洗海帶配子體沉淀，在轉速 lOOOrpm，離心5min后再用移液槍吸除離心管中的蒸餾水，保留海帶配子體。上述循環步 驟重復沖洗海帶配子體沉淀共計3 5次。在轉速lOOOrpm,離心5min后用移液槍吸除上 清，保留海帶配子體沉淀，加入新配的混合酶液(將纖維素酶R-10溶液、果膠酶溶液、離析 酶R-10溶液按2:1:1的體積比混合后搖勻，現配現用，4°C冰箱放置)1ml，在37°C全溫 培養搖床上于200rpm酶解18小時。在轉速lOOOrpm，5min離心后用移液槍輕輕吸除上清 酶液，再用移液槍取1ml蒸餾水并輕輕吸打溶液10次沖洗配子體沉淀，再在轉速lOOOrpm， 離心5min后用移液槍吸除蒸餾水，加入新的1ml蒸餾水輕輕吸打溶液10次，對配子體沉淀 進行沖洗。酶解去壁的作用①生物解離處理替代理化解離處理，減少了染色體變形、畸變， 呈現出真實的硬染色體。②去掉細胞壁纖維、果膠及胞質對染色體數量影響，使染色體分散 空間更大。③有利染色體著絲點隨體等圖像完整清晰。(5)冷滴片在轉速lOOOrpm，離心5min后用移液槍吸除上清液，加入100 200 iiL (微升)冰 乙酸，振蕩混勻成細胞懸液。取放在4°C冰箱蒸餾水中浸泡的干凈載玻片，在濾紙上控控水， 用滴管吸取細胞懸液在離預冷的載玻片30 40厘米的高度滴片，每張載玻片滴2 3滴， 然后立即將載玻片一端抬起，并輕輕吹氣，使細胞迅速分散，然后未滴細胞懸液的載玻片一 面在酒精燈火焰上過一次，使染色體分散和展開，在載玻片沒有染色體的一面的一端作標 記，室溫下晾干。冷滴片的作用①利用一定高度差讓細胞在載玻片上破裂，使染色體從細胞內釋 放出來。②沒有破裂的細胞滴在預冷的載玻片上經過酒精燈火焰后，利用溫度差讓細胞破 裂，這種細胞破裂方式可避免滴片時染色體的丟失。(6)姬姆薩染色如圖3和圖4所示，取一張玻璃板平放在實驗臺上，另取兩張干凈的新載玻片依長 的一面平行排好，距離小于一張載玻片的長度。將室溫晾干有染色體標本的載玻片擺在兩 張新載玻片上，且有染色體的一面朝下，象搭橋一樣，將其它有染色體標本的載玻片依次擺 好，兩個有染色體標本的載玻片之間不要有空隙，有染色體標本的載玻片與玻璃板之間就 形成一個兩端相通的孔隙，用滴管吸取姬姆薩染色液，由孔隙的一端，慢慢注入姬姆薩染色 液，注意用力均勻不要產生氣泡，姬姆薩染色液全部充滿孔隙后，室溫下靜置30 40min。 打開水龍頭，用很慢的水流沿孔隙一端沖凈染色液，注意水流速度不要太快，防止有染色體 標本的載玻片被沖走，然后將有染色體標本的載玻片取出，室溫晾干。(7)顯微鏡下觀察和拍照本實驗選用放大16倍的目鏡(WF16X/10，即放大16倍，視場直徑為10毫米)不 變，轉動物鏡旋座，先在10倍物鏡下找到染色體分散好且可數的染色體分裂相，然后將香 柏油滴在染色體上，再轉到100倍物鏡下拍照，即油鏡下拍照。圖1是利用本發明方法制備的海帶配子體染色體的照片，由圖可見，染色分散好， 長度大小可辨，數目為31條。圖2為2004年中國學者周立然利用壓片法及蘇木精染色的海帶配子體染色體，染色體呈點狀，形狀大小不能辨認。
權利要求
1.一種改進的海帶染色體的制備方法，其步驟是 (1)海帶配子體預處理海帶配子體離心后吸除多余水分保留海帶配子體沉淀，并加入秋水仙素溶液振蕩搖勻靜置； (2)海帶配子體低滲海帶配子體用氯化鉀溶液低滲； (3)海帶配子體固定低滲后的海帶配子體用卡諾固定液進行固定； (4)酶解去壁用纖維素酶R-IO溶液、果膠酶溶液、離析酶R-IO溶液的混合酶液進行酶解去壁； (5)冷滴片酶解去壁后的海帶配子體離心后用移液槍吸除上清液，加入冰乙酸，振蕩混勻成細胞懸液，用滴管吸取細胞懸液在離預冷的載玻片的上面滴片，載玻片底面經過酒精燈火焰燒一次后自然晾干或烘干； (6)姬姆薩染色對附著在載玻片上的海帶配子體染色體采用姬姆薩染色液進行染色； (7)顯微鏡下觀察和拍照。
2.根據權利要求I所述一種改進的海帶染色體的制備方法，其特征在于步驟(I)的秋水仙素溶液為重量體積比為O. 2%的秋水仙素溶液，海帶配子體加入O. 2%的秋水仙素溶液后于4°C下靜置7 8小時。
3.根據權利要求I所述一種改進的海帶染色體的制備方法，其特征在于步驟(2)的氯化鉀溶液的濃度為O. 075mol/L，海帶配子體沉淀加入濃度為O. 075mol/L的氯化鉀溶液后振蕩搖勻，在室溫下靜置30 40分鐘。
4.根據權利要求I所述一種改進的海帶染色體的制備方法，其特征在于步驟(3)的卡諾固定液是由甲醇和冰乙酸按3 I的體積比配置，卡諾固定液4°C下固定三次，每次20分鐘，最后再換新的卡諾固定液4°C下固定24小時。
5.根據權利要求I所述一種改進的海帶染色體的制備方法，其特征在于在步驟(4)中，纖維素酶R-IO溶液、果膠酶溶液、離析酶R-IO溶液按2 I I的體積比混合搖勻后成為混合酶液，現配現用，4°C下放置。
6.根據權利要求I所述一種改進的海帶染色體的制備方法，其特征在于在步驟(5)中，離預冷的載玻片30 40厘米的高度進行滴片。
全文摘要
本發明公開一種改進的海帶染色體的制備方法，其步驟是海帶配子體離心后吸除多余水分保留海帶配子體沉淀，加入秋水仙素溶液搖勻靜置；海帶配子體用氯化鉀溶液低滲；低滲后的海帶配子體用卡諾固定液固定；用纖維素酶R-10溶液、果膠酶溶液、離析酶R-10溶液的混合酶液酶解去壁；海帶配子體離心后用移液槍吸除上清液，加入冰乙酸混勻成細胞懸液，用滴管吸取細胞懸液在離預冷的載玻片的上面滴片，載玻片底面經過酒精燈火焰燒一次后自然晾干或烘干；對附著在載玻片上的海帶配子體染色體采用姬姆薩染色液染色；顯微鏡下觀察和拍照。本發明得到染色體分散較好，形態可辨且可數的染色體分裂相，方法簡便快速，可重復性強，一般實驗室均可操作。
文檔編號C12Q1/68GK102703599SQ20121023282
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月26日 優先權日2012年6月26日
發明者吳家奇, 宋少峰, 崔翠菊, 張立楠, 彭偉, 李曉捷, 田萍萍, 盛寶利, 羅世菊, 賽珊, 趙楠, 邵偉 申請人:山東東方海洋科技股份有限公司