專利名稱：一種體外準(zhǔn)確檢測kras基因突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測KRAS基因突變的方法。
背景技術(shù)：
基因突變是指基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生堿基組成或排列順序的改變，主要包括堿基的替代和片段的插入缺失，是導(dǎo)致基因型疾病的重要原因之一?；蛲蛔兎治鲈谏镝t(yī)學(xué)研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。KRAS基因編碼的蛋白參與由表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細(xì)胞的增殖、生長和轉(zhuǎn)移；正常的KRAS基因編碼的蛋白在接受上游信號活化后被激活，并將在信號傳遞給下游細(xì)胞因子后恢復(fù)非激活狀態(tài)；而突變的KRAS基因所編碼的蛋白無需上游信號 活化便始終處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞的非正常增殖和生長，引起惡性腫瘤。抗EGFR類腫瘤藥物通過特異性阻滯EGFR與受體結(jié)合，阻斷細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖的目的；多項研究發(fā)現(xiàn)，接受抗EGFR藥物治療的結(jié)直腸癌患者中，KRAS基因野生型的病人較KRAS基因突變型病人更能從治療中受益具有更高的藥物客觀反應(yīng)率和較長的生存時間。因此，能夠準(zhǔn)確檢測KRAS突變狀態(tài)對指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者臨床用藥有重要意義。人類KRAS基因的突變主要發(fā)生該基因第二號外顯子上，其中最常見的突變有G12S、G12R、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D7 種形式。傳統(tǒng)檢測KRAS基因突變的方法多種多樣，其中最為經(jīng)典是雙脫氧測序技術(shù)，此外還包括等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、連接酶檢測反應(yīng)(LDR)、多聚酶鏈限制性長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技術(shù)。雖然這些方法能夠檢測突變是否存在，但大多數(shù)方法不能確定突變的類型并且只能檢測到突變的一部分；同時大多數(shù)方法需要瓊脂糖凝膠電泳等PCR后處理檢測才能分析結(jié)果，準(zhǔn)確度和靈敏度受到限制。近年來，蝎型引物(Scorpion primers)、高分辨溶解曲線(HRM)、變性高效液相色譜分析(dHPLC)和焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)等方法技術(shù)改善了檢測的靈敏度和特異性,但仍存在耗材昂貴，假陽性現(xiàn)象嚴(yán)重和操作繁瑣等缺點。等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR)，也稱為 ARMS (Amplificationrefractory mutation system)技術(shù),是一種利用特異性引物對模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增而達(dá)到檢測基因突變的方法。其原理是根據(jù)PCR過程中DNA聚合酶引導(dǎo)的引物延伸從3’末端開始，所以引物3’末端的堿基與模板的互補程度強烈影響聚合酶的識別作用和PCR反應(yīng)的進(jìn)行若這個堿基與模板正?；パa配對(A-T，G-C)，則引物可以不間斷延伸，PCR得以高效進(jìn)行，得到完整的產(chǎn)物；反之，若這個堿基與模板非正常配對，則引物的延伸受到阻滯，PCR效率大大降低。故只需將與突變位點對應(yīng)的堿基放置在引物的3’末端，當(dāng)用突變型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，只要突變型模板可以得到擴(kuò)增，而野生型模板的擴(kuò)增受到了抑制。SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，可以非特異性與DNA雙鏈小溝結(jié)合。在游離狀態(tài)下SYBRGreen只有本底水平熒光，而與DNA結(jié)合后其熒光強度增強1000倍以上。PCR反應(yīng)過程中，產(chǎn)物成指數(shù)形式擴(kuò)增，熒光強度也隨之倍增，起到實時監(jiān)測作用。傳統(tǒng)的等位基因PCR法特異性不足，常常出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確
發(fā)明內(nèi)容

為了克服傳統(tǒng)等位基因特異性PCR法特異性不足，存在假陽性現(xiàn)象的缺點，本發(fā)明提供了一種體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，通過設(shè)計高特異性引物與延伸阻滯引物，結(jié)合快速PCR法實現(xiàn)體外準(zhǔn)確檢測KRAS突變。為實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明的基本技術(shù)方案如下一種體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟(I)等位基因特異性引物的設(shè)計及合成針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變分別設(shè)計等位基因特異性引物，作為上游引物；序列信息如下G12S5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3’ (24nt)G12R5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3’ (24nt)G12C5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3’ (24nt)G12D5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3’ (25nt)G12A5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3’ (25nt)G12V5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3’ (25nt)G13D5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3’ (24nt)針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變設(shè)計共同的下游引物為延伸阻滯引物；序列信息如下延伸阻滯引物(38nt)
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額外序列基礎(chǔ)引物序列(2)模板的準(zhǔn)備提取被測樣本的KRAS基因組DNA ;另制取野生型基因組DNA (作為野生型模板)；(3)實時熒光PCR針對步驟(I)中的7種特異性引物，建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系；被測樣本的每個反應(yīng)體系中均加入被測樣本的KRAS基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物；野生型模板的每個反應(yīng)體系中均加入野生型基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物；將配制好的各反應(yīng)體系在熒光實時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，觀察比較特異性引物對應(yīng)的被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線，判斷被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變。基于以上基本方案，為取得更佳的技術(shù)效果，本發(fā)明還可作出以下優(yōu)化限定。上述所有反應(yīng)體系中還均加有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)和2 X SYBR GreenMastermix。UNG酶可用于消除PCR污染，2 X SYBR Green Mastermix是商品化的酶混合體系，屬于PCR常用的試劑。上述反應(yīng)體系可以有兩種模式
a、針對每一種特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系；按照該模式，不僅能夠判斷被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變，還能確定具體是何種突變。b、將7種特異性引物分為三類；其中，G12S、G12R、G12C為一類，G12A、G12D、G12V為一類，G13D為一類；針對這三類特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系。以每個反應(yīng)體系的總量20 Ul計，若采用上述a模式，則加入特異性引物200nM-500nM、延伸阻滯引物 200nM_500nM，UNG 酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U, 2 X SYBRGreen MastermixlO u I, ddH20 補足體積 20 U I ；以每個反應(yīng)體系的總量20 ill計，若采用上述b模式，則將G12S、G12R、G12C上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物300nM構(gòu)成混合引物體系；將G12A、G12D、G12V上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物
300nM構(gòu)成混合引物體系；G13D上游引物200nM_500nM與延伸阻滯引物300nM構(gòu)成單獨的引物體系；這三類引物體系也均加入有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U, 2 X SYBR GreenMastermixlO u I, ddH20 補足體積 20 y I ;在每個反應(yīng)體系的總量確定的情況下(比如20 ill)，以上加入物的量綱均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)取量方式。上述擴(kuò)增過程的最佳擴(kuò)增參數(shù)為50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，8 IOsec ；60°C,8 IOsec ;65。。，8 IOsec ;50 55 個循環(huán)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點和有益效果I.特異性強。在本發(fā)明中，針對KRAS突變位點設(shè)計的特異性引物和延伸阻滯引物具有很高的特異性；同時延伸阻滯引物對野生型模板擴(kuò)增起到阻滯作用，二者共同保證了檢測的特異性。2.靈敏度高。在本發(fā)明中，延伸阻滯引物在其基礎(chǔ)功能之外起到了阻礙野生型模板擴(kuò)增，富集突變的效果；同時所用的聚合酶具有很高的酶活力，可以在極短的時間內(nèi)(5^10秒)高效擴(kuò)增突變型模板，兩種效果共同保證了該發(fā)明具有很高的靈敏度。3.節(jié)省耗材和時間。基于本實驗中設(shè)計和反應(yīng)程序的特殊性，使得該方法可以很大程度上節(jié)省實驗時間和耗材，PCR反應(yīng)過程總共只需要60-70min ;尤其是按照b模式，檢測7個突變位點可以只需要3個反應(yīng)孔。


圖I為KRAS突變位點序列信息，等位基因特異性引物和延伸阻滯引物信息示意圖。圖2為該發(fā)明實驗流程和設(shè)計原理示意圖。圖3、4、5為本發(fā)明應(yīng)用于KRAS突變檢測實驗結(jié)果圖。
具體實施例方式本發(fā)明是一種利用熒光等位基因特異性PCR和延伸阻滯引物檢測KRAS基因突變的技術(shù)，應(yīng)用于體外KRAS基因序列分析和突變檢測。延伸阻滯引物(Extension-Refractory primes)是一種可以和自身延伸產(chǎn)物形成“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)的引物；除了普通引物序列部分之外，延伸阻滯引物5’端額外包含的一段堿基序列，這段序列可以與自身延伸得到的產(chǎn)物單鏈中包含突變位點在內(nèi)的一段堿基序列互補，形成“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)；由于野生型和突變型模板間序列的不同，故形成的“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)強度(Tm值)有明顯差別。本發(fā)明針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變分別設(shè)計等位基因特異性引物，7種引物均作為上游引物。各引物的3 ’末端堿基對應(yīng)不同突變位點，同時將其臨位堿基(3’端倒數(shù)第二位)人為改變，使其和模板序列形成錯配以提高引物的特異性。下游引物為延伸阻滯引物，其基礎(chǔ)引物部分對模板沒有選擇性，但其5’端額外序列部分與野生型模板延伸得到產(chǎn)物完全互補配對，該配對區(qū)域與上游引物結(jié)合位置有重疊部分。同時延伸阻滯引物與野生型模板所得到的延伸產(chǎn)物形成的“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)的Tm值為70°C，而上游引物的Tm值為61°C，因此延伸阻滯引物二級結(jié)構(gòu)的形成能夠阻礙上游引物與模板的結(jié)合或?qū)е陆Y(jié)合后不能擴(kuò)增，并且這種阻礙作用主要對野生型模板起作用，而對突變型模板擴(kuò)增幾乎無影響，因此達(dá)到富集突變，提高靈敏度的作用。在PCR反應(yīng)完成后通過擴(kuò)增曲線便可以準(zhǔn)確判斷樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變。
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圖I為KRAS基因部分序列(含突變位點在內(nèi)95nt)信息以及本發(fā)明中用到的延伸阻滯引物的示意圖。請參閱圖1-1所示，為本發(fā)明中所涉及到KRAS序列信息及引物和探針位置示意圖。其中左上部分黑色半箭頭指代針對7個突變位點設(shè)計的特異性上游引物，長度為25nt左右；左下方折疊式半箭頭指代延伸阻滯引物，其基礎(chǔ)引物部分為26nt，5’端額外序列(頸環(huán)形成所需)為12nt ;箭頭指示堿基(3個G)為KRAS突變發(fā)生位點，其中前兩個位點可以發(fā)生G>T、G>A、G>C突變，第三個位點發(fā)生G>A突變；7種特異性引物的3’末端堿基分別對應(yīng)7種突變形式，同時臨位堿基故意設(shè)計為與模板錯配。請參閱圖1-2所示，為本發(fā)明中延伸阻滯引物的延伸產(chǎn)物所形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)示意圖。其中“頸”由其5’端額外序列與其自身延伸產(chǎn)物(野生型模板)包含突變位點在內(nèi)的序列互補配對形成，Tm 70°C。延伸阻滯引物與突變型模板延伸得到的產(chǎn)物在PCR延伸時不能形成類似二級結(jié)構(gòu)。圖2為該發(fā)明所涉及到的實驗流程和設(shè)計原理示意圖。請參閱圖2-1所示，為本發(fā)明中檢測KRAS基因突變的實驗原理圖。由于等位基因特異性引物的3’末端堿基與突變位點堿基正?；パa配對，即使存在臨位錯配，DNA聚合酶依然可以同引物模板形成復(fù)合體，延伸得以進(jìn)行。而特異性引物的3’末端堿基與野生型位點不能正?；パa配對，在同時存在臨位錯配的情況下，DNA聚合酶不能識別引物，延伸難以進(jìn)行。綜合以上兩點，等位基因特異性引物可以在野生型模板的干擾下選擇性擴(kuò)增突變型模板。請參閱圖2-2所示，為本發(fā)明中延伸阻滯引物對突變模板進(jìn)行富集的示意圖。圖中左部分為延伸阻滯引物與突變型模板產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物，由于其額外序列與產(chǎn)物序列不能完全互補(突變位點錯配)，在延伸時不能形成“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)，所以上游引物可以正常的延伸。右部分所示為延伸阻滯引物與突變型模板產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物，其額外序列可以和產(chǎn)物序列完全互補，在延伸時形成了“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)，因“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)與上游引物的結(jié)合位置有重疊部分，所以引物的的結(jié)合與延伸均受到阻礙，PCR不能正常進(jìn)行。因此，樣本中的突變型模板可以得到富集，而野生型模板的擴(kuò)增受到了抑制。本發(fā)明的體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟(I)等位基因特異性引物的設(shè)計及合成針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變分別設(shè)計等位基因特異性引物，作為上游引物；序列信息如下G12S5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3’ (24nt)G12R5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3’ (24nt)G12C5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3’ (24nt)
G12D5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3’ (25nt)G12A5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3’ (25nt)G12V5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3’ (25nt)G13D5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3’ (24nt)針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變設(shè)計共同的下游引物為延伸阻滯引物；序列信息如下延伸阻滯引物(38nt)
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額外序列基礎(chǔ)引物序列(2)模板的準(zhǔn)備提取被測樣本的KRAS基因組DNA ;另制取野生型基因組DNA (作為野生型模板)；(3)實時熒光PCR針對步驟(I)中的7種特異性引物，建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系；被測樣本的每個反應(yīng)體系中均加入被測樣本的KRAS基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物；野生型模板的每個反應(yīng)體系中均加入野生型基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物；將配制好的各反應(yīng)體系在熒光實時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，觀察比較特異性引物對應(yīng)的被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線，判斷被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變。上述所有反應(yīng)體系中還均加有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)和2 X SYBR GreenMastermix。UNG酶可用于消除PCR污染，2 X SYBR Green Mastermix是商品化的酶混合體系，屬于PCR常用的試劑。上述反應(yīng)體系可以有兩種模式a、針對每一種特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系；按照該模式，不僅能夠判斷被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變，還能確定具體是何種突變。b、將7種特異性引物分為三類；其中，G12S、G12R、G12C為一類，G12A、G12D、G12V為一類，G13D為一類；針對這三類特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系。以每個反應(yīng)體系的總量20 Ul計，若采用上述a模式，則加入特異性引物200nM-500nM、延伸阻滯引物 200nM_500nM，UNG 酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U, 2 X SYBRGreen MastermixlO u I, ddH20 補足體積 20 u I ；以每個反應(yīng)體系的總量20 ill計，若采用上述b模式，則將G12S、G12R、G12C上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物300nM構(gòu)成混合引物體系；將G12A、G12D、G12V上游引物按200nM: 200nM: 300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物300nM構(gòu)成混合引物體系；G13D上游引物200nM_500nM與延伸阻滯引物300nM構(gòu)成單獨的引物體系；這三類引物體系也均加入有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U, 2 X SYBR GreenMastermixlO u I, ddH20 補足體積 20 y I ;上述擴(kuò)增過程的最佳擴(kuò)增參數(shù)為50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，8 IOsec ；60°C,8 IOsec ;65。。，8 IOsec ;50 55 個循環(huán)。下面以制備的7種突變型KRAS基因克隆質(zhì)粒(作為樣本)，按照本發(fā)明的突變檢測方法，進(jìn)行實驗說明，以體現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。將野生型KRAS基因克隆質(zhì)粒(野生型模板)及7種突變型KRAS基因克隆質(zhì)粒(突變 型模板)進(jìn)行提取，并使用Nanodrop核酸定量儀定量，并將所有質(zhì)粒模板使用TE緩沖液進(jìn)行稀釋，至濃度為0. OOOOlng/u I0取部分稀釋好的野生型KRAS基因克隆質(zhì)粒和7種突變型KRAS基因克隆質(zhì)粒，分別按照一定梯度比例混合制備得到混合型模板(該梯度比例將直接體現(xiàn)最終的檢測靈敏度)，具體可將稀釋好的7種突變型質(zhì)量與野生型質(zhì)粒按I: I (50%)，1:9 (10%) ,1:19 (5%) ,1:99 (1%)混合制備混合型模板；擴(kuò)增體系為20 ill。若采用a模式，每反應(yīng)體系中均加入特異性引物和延伸阻滯引物200nM_500nM，UNG 酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U，2XSYBR Green MastermixlOu I, ddH20 補足體積20u I0每種特異性引物配制多管體系，一管中加入野生型模板，另一管中加入相應(yīng)的突變型模板；另外四管分別加入各混合型模板(四種比例梯度)。若采用b模式，則將G12S、G12R、G12C引物按200nM: 200nM: 300nM比例混合，再加入延伸阻滯引物300nM制備混合引物體系，分為三組；第一組加入G12S突變型模板和野生型模板以及I I (50%)，1:9(10%) ,1:99 (1%)混合型模板，第二組與第三組分別加入G12R與G12C系列模板；G12A、G12D、G12V混合引物配制及加樣同上所述。將配制好的體系在熒光實時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)為50°C，2飛min ；95°C，12 15min ;95。。，8 IOsec ;60。。，8 IOsec ;65。。，8 IOsec ;50 55 個循環(huán)；觀察擴(kuò)增曲線。結(jié)果如圖3所示。請參閱圖3所示，使用上述反應(yīng)體系，可以保證7種突變型模板的順利擴(kuò)增，同時抑制野生型模板的擴(kuò)增，與理論結(jié)果完全符合。圖中每一條線代表一個反應(yīng)，呈現(xiàn)明顯“S”型的曲線對應(yīng)的反應(yīng)體系中加入的是各突變型模板，而未呈“ S”型的曲線對應(yīng)的反應(yīng)體系中加入的是野生型模板(WT)；請參閱圖4所示，以G12S突變型和G12V突變型為例，在使用上述反應(yīng)體系，混合型突變模板均有擴(kuò)增，檢測的靈敏度均可以達(dá)到1%。圖中每一條線代表一個反應(yīng)，呈現(xiàn)明顯“S”型的曲線對應(yīng)的反應(yīng)體系中加入的是突變型模板和混合型模板，而未呈“S”型的曲線對應(yīng)的反應(yīng)體系中加入的是野生型模板(WT)；請參閱圖5所示，將G12S/R/C突變特異性引物按比例混合(b模式)后，使用上述反應(yīng)體系，突變型模板依然可以順利擴(kuò)增，同時在保持1%的檢測靈敏度情況下達(dá)到在一管中對3種突變型進(jìn)行檢測的目的；G12A/D/V突變特異性引物按比例混合后，使用上述反應(yīng)體系得到類似結(jié)果。圖中每一條線代表一個反應(yīng)，呈現(xiàn)明顯“S”型的曲線對應(yīng)的反應(yīng)體系中加入的是突變型模板和各混合型模板，而未呈“S”型的曲線對應(yīng)的反應(yīng)體系中加入的是野生型模板(WT)。以上實施例不應(yīng)視為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本發(fā)明在模板的準(zhǔn)備和實時熒光PCR的環(huán)節(jié)確定了最佳的實施方式和參數(shù)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本發(fā)明技術(shù)思想和設(shè)計的引物體系，按照常規(guī)的操作方式(如試劑、配比、擴(kuò)增過程參數(shù)等)足以準(zhǔn)確地檢測KRAS突 變，較之于現(xiàn)有技術(shù)有顯著進(jìn)步。
權(quán)利要求
1.一種體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟 (1)等位基因特異性引物的設(shè)計及合成 針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變分別設(shè)計等位基因特異性引物，作為上游引物；序列信息如下 G12S5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3’ (24nt) G12R5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3’ (24nt) G12C5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3’ (24nt)G12D5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3’ (25nt)G12A5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3’ (25nt)G12V5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3’ (25nt) G13D5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3’ (24nt)； 針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變設(shè)計共同的下游引物為延伸阻滯引物；序列信息如下 延伸阻滯引物(38nt)//6'^7^(76^7'QT7YY/TCATATTCGTC；CACAAAATGATTCTG-3, V-V-------- 額外序列基礎(chǔ)引物序列 (2)模板的準(zhǔn)備 提取被測樣本的KRAS基因組DNA ;另制取野生型基因組DNA ； (3)實時熒光PCR 針對步驟(I)中的7種特異性引物，建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系； 被測樣本的每個反應(yīng)體系中均加入被測樣本的KRAS基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物；野生型模板的每個反應(yīng)體系中均加入野生型基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物； 將配制好的各反應(yīng)體系在熒光實時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，觀察比較特異性引物對應(yīng)的被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線，判斷被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于所有反應(yīng)體系中還均加有UNG酶和2 X SYBR Green Mastermix。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于，步驟(3)的反應(yīng)體系采用以下兩種模式之一 a模式針對每一種特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系；b模式將7種特異性引物分為三類;其中，G12S、G12R、G12C為一類，G12A、G12D、G12V為一類，G13D為一類；針對這三類特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應(yīng)體系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于 以每個反應(yīng)體系的總量20 ill計，采用上述a模式，則加入特異性引物200nM-500nM、延伸阻滯引物 200nM-500nM，UNG 酶 0. 2U, 2 X SYBR Green MastermixlOu l，ddH20 補足體積20u I ； 或者，以每個反應(yīng)體系的總量20 ill計，采用上述b模式，則將G12S、G12R、G12C上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物300nM構(gòu)成混合引物體系；將G12A、G12D、G12V上游引物按200nM: 200nM: 300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物300nM構(gòu)成混合引物體系；G13D上游引物200nM_500nM與延伸阻滯引物300nM構(gòu)成單獨的引物體系；這三類引物體系也均加入有UNG酶0. 2U，2XSYBR Green MastermixlO u I,ddH20補足體積20 ii I。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一所述的體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于步驟(3)中的擴(kuò)增參數(shù)為50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，8 IOsec ;60°C，8 IOsec ；65°C,8 IOsec ;50 55 個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，以克服傳統(tǒng)等位基因特異性PCR法特異性不足，存在假陽性現(xiàn)象的缺點。該體外準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟(1)等位基因特異性引物的設(shè)計及合成，包括針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變分別設(shè)計的等位基因特異性引物，作為上游引物；共同的下游引物為延伸阻滯引物；(2)提取被測樣本的KRAS基因組DNA；另制取野生型基因組DNA(作為野生型模板)；(3)實時熒光PCR反應(yīng)。本發(fā)明的檢測方法特異性強、靈敏度高、節(jié)省耗材和時間。
文檔編號C12Q1/68GK102796816SQ201210233090
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者劉金輝, 陳超, 戴鵬高, 王鴻 申請人:陜西北美基因股份有限公司