專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用脂肪酰acp還原酶生物合成脂肪醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可再生能源和生物質(zhì)能源以及化工原料生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及改造異養(yǎng)微生物自身脂肪酸代謝途徑從而生產(chǎn)脂肪醇的方法。
背景技術(shù)：
脂肪醇(fatty alcohols)是洗滌劑用表面活性劑的原料之一,在洗滌劑、護(hù)膚品、化妝品、藥品中有大量運(yùn)用。脂肪醇最早是由鯨蠟制取的，所得的混合脂肪醇經(jīng)磺化中和后成為硫酸鹽，是最早的一種陰離子洗滌劑。其后開(kāi)發(fā)利用來(lái)源比較豐富的椰子油、棕櫚油和牛油為原料，所得脂肪酸再還原為醇，統(tǒng)稱(chēng)為天然脂肪醇。石油化學(xué)工業(yè)發(fā)展后，以石油產(chǎn)品為原料，生產(chǎn)的脂肪醇稱(chēng)為合成脂肪醇。全世界總的脂肪醇消費(fèi)量大約在250 萬(wàn)噸左右。至20世紀(jì)末，天然醇與合成醇的比例大致為4. 9 5.1。近年來(lái)由于石油原料價(jià)格持續(xù)高漲，加上美洲和亞洲地區(qū)對(duì)脂肪醇的需求增加，以及人們對(duì)天然原料脂肪醇的偏好，增加了對(duì)天然脂肪醇的需求。脂肪醇的價(jià)格已高達(dá)2000美元每噸，目前全球有許多國(guó)家依然需要依靠進(jìn)口滿足脂肪醇的需求。但是依靠石油產(chǎn)品為原料的脂肪醇也大量消耗石油的儲(chǔ)備量，在資源日益稀缺的今天，這種發(fā)展方式將會(huì)逐漸淘汰，因此，需要一種更環(huán)保、可再生的生產(chǎn)方式。如果能夠通過(guò)在改造后的脂肪酸代謝通路中異源表達(dá)脂肪醇合成酶，即脂肪酰載體蛋白還原酶，即可以通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量的脂肪醇。Michael 等人在 2000年純化了 jojoba 的 fatty acyl CoA reductase,并證明該基
因-jojoba Zkr能將脂肪酸還原成為脂肪醇,該工作發(fā)表在“Plant Physiology^ James
G. Metz, Michael R. Pollard I，Lana Anderson, Thomas R. Hayes, and Michael W.Lassner. 2000.Purification of a jojoba embryo fatty acyl-Coenzyme A reductaseand expression of its cDNA in high erucic acid rapeseed. Vol. 122: 635 - 644)。Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的藍(lán)細(xì)菌Syn-LY2菌株中分別表達(dá)了來(lái)自于jojoba，鼠，擬南芥等的脂肪酰輔酶A還原酶FAR，發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)jojoba及其中一種擬南芥FAR的藍(lán)細(xì)菌能夠合成脂肪醇，而異源表達(dá)其他的幾種FAR的藍(lán)細(xì)菌不能產(chǎn)生脂肪醇。該工作發(fā)表在 “Metabolic Engineering，，上(Tan X，Yao L，Lu X. et al. 2010. Photosynthesisdriven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons incyanobacteria. Metabolic Engineering 13 (2011) 169 - 176)。劉天里教授等人開(kāi)發(fā)了一個(gè)“cell free”體系，將脂肪酸代謝途徑中的限速步驟進(jìn)行了研究，指導(dǎo)如何提高微生物體內(nèi)的脂肪酸含量，該工作發(fā)表于“Metabolic Engineering”(Tiangang Liu，HarmitVora，Chaitan Khosia. 2010. Quantitative analysis and engineering of fatty acidbiosynthesis in E. coli· Metabolic Engineering 12 :378 - 386)。2011 年，石開(kāi)究人員克隆并鑒定了一個(gè)參與單子葉植物水稻花藥及花粉外壁發(fā)育的脂肪酰基載體蛋白還原酶DPW，研究揭不，DPW蛋白定位于質(zhì)體中，重組蛋白可以脂肪酉先基載體蛋白為底物，將碳十TK脂肪酸還原為其相應(yīng)的脂肪醇，從而參與花藥及花粉外壁的合成，并且通過(guò)遺傳互補(bǔ)等實(shí)驗(yàn)證明DPW在雙子葉植物擬南芥中具有保守的生物學(xué)功能(Shi J, Tan H，Yu XHj LiuY， Liang Wj Ranathunge K， et al. Defective pollen wall is required for antherand microspore development in rice and encodes a fatty acyl carrier proteinreductase. The Plant cell 2011; 23:2225_46)。2010年，Andreas Schirmer 等在Science上發(fā)表一項(xiàng)工作，其中證明了來(lái)自于藍(lán)細(xì)菌PCC7942的一段基因序列PCC7942-orfl594UA 基因)和PCC7942-orfl593共表達(dá)可以產(chǎn)生脂肪烷烴(Schirmer A，Rude MAjLi X， Popova Ej del Cardayre SB. Microbial biosynthesis of alkanes. Science2010;329:559-62)。脂酰載體蛋白還原酶基因便于進(jìn)行優(yōu)化，目前可以進(jìn)行遺傳操縱的微生物種類(lèi)繁多，脂肪酸合成代謝途徑又是每種微生物生存的必需條件，并且目前的研究已經(jīng)對(duì)該條途徑認(rèn)識(shí)較為深刻，其限速步驟基本清楚，利于進(jìn)行改造。眾所周知，由于異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)迅速并且需要外源補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這就便于通過(guò)補(bǔ)充培養(yǎng)基或者增加某些營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)提高其生產(chǎn)能力，使其在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。并且由于其必須依賴(lài)人工補(bǔ)給養(yǎng)料，所以可以嚴(yán)格控制其生產(chǎn)的各個(gè)階段，防止其肆意生長(zhǎng)而造成無(wú)法控制的局面。目前工業(yè)上已經(jīng)有許多利用異養(yǎng)微生物生產(chǎn)發(fā)酵獲得產(chǎn)品的成功實(shí)例，利用脂酰載體蛋白還原酶基因在異養(yǎng)微生物體內(nèi)通過(guò)改造其自身代謝途徑生產(chǎn)脂肪醇有很大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，在異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞體內(nèi)改造其脂肪酸代謝途徑以及表達(dá)外源蛋白以生產(chǎn)重要的化工原料一脂肪醇。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，其是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因?qū)氘愷B(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，并誘導(dǎo)表達(dá)。所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示的蛋白質(zhì)。或者編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。優(yōu)選為DPW基因和基因。本發(fā)明所述異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。此外，本發(fā)明方法還包括通過(guò)改造異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞的代謝途徑或者根據(jù)其密碼子的偏愛(ài)性對(duì)脂酰載體蛋白還原酶基因進(jìn)行優(yōu)化，以提高脂肪醇的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明方法還包括對(duì)轉(zhuǎn)化脂酰載體蛋白還原酶基因異養(yǎng)微生物進(jìn)行耐受性篩選，獲得優(yōu)勢(shì)菌株，從而提高脂肪醇的產(chǎn)量。其中，所述改造的異養(yǎng)微生物代謝途徑是該微生物體內(nèi)的脂肪酸代謝途徑，包括提高脂肪酸產(chǎn)量或者降低脂肪酸產(chǎn)量用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑，例如在大腸桿菌中導(dǎo)入PMSD8質(zhì)粒,過(guò)量表達(dá)fatty acetyl-CoA carboxylase,提高用以生產(chǎn)脂肪醇的脂肪酸含量；改變?cè)撐⑸矬w內(nèi)脂肪酸代謝途徑中間物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑，例如敲除大腸桿菌中的治必基因以積累更多脂肪酸代謝途徑中間物的脂肪酰載體蛋白，從而獲得更多的脂肪醇；改變?cè)撐⑸矬w內(nèi)脂肪酸代謝途徑衍生物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。其中，所述的菌種改造包括利用脂肪醇耐受性篩選改造獲得的耐受型菌株。、
本發(fā)明還提供一種異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞，其是轉(zhuǎn)化脂肪酰載體蛋白還原酶基因的異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞。以及通過(guò)上述改造途徑得到的優(yōu)選異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞。所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示的蛋白質(zhì)。或者編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。優(yōu)選為DPW基因和基因。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在異養(yǎng)微生物中引入外源基因改造其自身的脂肪酸代謝途徑以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工業(yè)原料脂肪醇的目的，不需要通過(guò)過(guò)多的化學(xué)合成反應(yīng)，減少了環(huán)境的污染，也減少了對(duì)石油儲(chǔ)量的消耗。同時(shí)，由于大部分異養(yǎng)微生物生長(zhǎng)速度快，便于進(jìn)行遺傳操作，其抗污染性能優(yōu)異，且人工可以調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)速度和防止其肆意生長(zhǎng)破壞環(huán)境，種種因素表明改造異養(yǎng)微生物進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)是切實(shí)可行的。


圖I為設(shè)計(jì)構(gòu)建的pRL108表達(dá)載體示意圖。圖2為設(shè)計(jì)構(gòu)建的pFASR表達(dá)載體示意圖。圖3為大腸桿菌RL6經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ；C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol。圖4為大腸桿菌RL7經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ；C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1 表7j\ Δ 9—octadecanol ο圖5為大腸桿菌RL8經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ；C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1 表7j\ Δ 9—octadecanol ο圖6為大腸桿菌RL9經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ；C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1 表7j\ Δ 9—octadecanol ο圖7為大腸桿菌RLlO經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0表不pentadecanol ;C14:0表不 tetradecanol ； C16:0表不hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο圖8為大腸桿菌RLll經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο圖9為大腸桿菌RL12經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0表不pentadecanol ;C14:0表不 tetradecanol ； C16:0表不hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖10為大腸桿菌RL13經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0表不pentadecanol ;C14:0表不 tetradecanol ； C16:0表不hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖11為大腸桿菌RL14經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖12為大腸桿菌RL15經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖13為大腸桿菌RL16經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖14為大腸桿菌RL17經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ； C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。
圖15為大腸桿菌RL15和RL17經(jīng)分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)后的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到
在異養(yǎng)微生物體內(nèi)弓I入外源基因——脂肪酰載體蛋白還原酶，從而催化自身的脂肪酰載體蛋白還原形成脂肪醇。引入的脂肪酰載體蛋白還原酶還原酶就是來(lái)源于水稻的j/f基因和來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌PCC7942的基因。大腸桿菌作為異源微生物的一種，遺傳操作背景清楚，生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)條件溫和，是進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的首選菌株之一，實(shí)施例中選用一種大腸桿菌BL21 (DE3)或MG1655 (DE3) Z recA Δ endA作為生產(chǎn)菌株，選取其表達(dá)質(zhì)粒pET28，并將其改造為可以表達(dá)j/f基因的pRL108載體和可以表達(dá)基因的pFASR載體。以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I
將已公布的^/1基因序列(SEQ ID No. 1，由金斯瑞生物科技有限公司合成)，并通過(guò)EcoR I和ZAo I兩個(gè)酶切位點(diǎn)將其克隆于pET28載體上，構(gòu)建好的質(zhì)粒被命名為pRL108。將BL21 (DE3)中的脂酰載體蛋白脫氫酶汾必基因敲除，可以減少脂肪酰輔酶A的消耗，從而積累更多的脂肪酰載體蛋白和脂肪酰載體蛋白用于生產(chǎn)脂肪醇。該實(shí)例中將敲除汾必基因的大腸桿菌BL21(DE3)命名為T(mén)L101。將TL101中的脂肪酰輔酶A合成酶/ 必基因敲除，可以中斷脂肪酰輔酶A的形成，使細(xì)胞體內(nèi)只合成脂肪酰載體蛋白。該實(shí)例中按照同源重組的原理，構(gòu)建一敲除質(zhì)粒用于敲除TL101中的/ 必基因。通過(guò)兩條引物 DRLl-S(TTAAGCATGC GAAGATTTTA CTGCGGATAT T (SpA I ))和 pRLl-AS(ATATGGATCC
GCGTTAAGTC AGTCGTCI )) PCR擴(kuò)增一段Ikb左右的左臂-即/aoW基因的上
游序列，通過(guò)另兩條弓 I物 pRL2-S (ATATGGATCC TTCTTCACCT CTAAAATGCG T I ))和
PRL2-AS (ATATGAGCTC GATGAAAACG GTATCTGGCfSac I ))擴(kuò)增一段 Ikb 左右的右臂-
即fadD基因的下游序列，將兩條基因序列拼接并克隆于溫敏質(zhì)粒PMAK705上，成功構(gòu)建敲除質(zhì)粒pRL103。將構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒PRL103導(dǎo)入大腸桿菌TL101感受態(tài)細(xì)胞，由于敲除質(zhì)粒pRL103上含有跟大腸桿菌基因組同源的序列，利用同源重組的原理，這段序列能跟大腸桿菌基因組上的/ 必基因前后的相同序列發(fā)生兩次同源重組，從而可以敲除/ 必基因。并且利用敲除質(zhì)粒PRL103的溫度敏感性質(zhì)進(jìn)行反復(fù)溫度改變培養(yǎng)，讓其既進(jìn)行重組又可以自行丟失，從而利用抗生素敏感試驗(yàn)篩選出疑似正確的重組菌。用兩條引物對(duì)(KS AAGCGAAACCCCATGACATC ；KAS GTCGATGTGAACGGTTTTC)進(jìn)行菌落 PCR 驗(yàn)證，將在大腸桿菌TLlOl基礎(chǔ)上成功敲除/a必的大腸桿菌命名為RL100并進(jìn)行保種。John Cronan教授曾構(gòu)建的質(zhì)粒pMSD8可以在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)fattyacetyl-CoA carboxylase (Mark S. Davis, Joser Solbiati, and John E. Cronan,Jr. 2000. Overproduction of Acetyl-CoA Carboxylase Activity Increases the Rateof Fatty Acid Biosynthesis in Escherichia coli. THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY .275( 37) :28593 - 28598.)。在本實(shí)例中，本發(fā)明使用該質(zhì)粒提高脂肪醇的產(chǎn)量。
用包含有十二醇(dodecanol)、十四醇(tetradecanol)和十六醇(hexadecanol)的LB培養(yǎng)基對(duì)TL101進(jìn)行脂肪醇耐受性篩選，從80mg/L的脂肪醇(fatty alcohols)濃度逐步增加到終濃度為I. 2g/L的脂肪醇(fatty alcohols)對(duì)TL101進(jìn)行篩選，最終在最高濃度為1.2 g/L的脂肪醇(fatty alcohols)濃度的條件下連續(xù)進(jìn)行一周的篩選,將最終存活的細(xì)胞保種，并命名為RL101。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21 (DE3)，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為 RL6。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入MG1655 (DE3) Zl recA Δ 兒利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL7。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入TL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL8。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL9。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL100，利用卡拉霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLlO。將pMSD8和pRL108共轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL101，利用卡那霉素和羧芐青霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLlI。將RL6、RL8、RL10三種菌分別接種于含有相應(yīng)抗生素的5mLLB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)約12h后，將其轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)抗生素的300mLLB培養(yǎng)基中在37°C繼續(xù)培養(yǎng)約90min后，待其OD達(dá)到0. 6時(shí)，加入0. 25mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)37°C培養(yǎng)12h后，再轉(zhuǎn)入30°C培養(yǎng)6小時(shí)。將RL7、RL9、RL11三種菌分別接種于含有相應(yīng)抗生素的5 mL LB培養(yǎng)基中30 °〇培養(yǎng)約12 h后，將其轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)抗生素的300 mL LB培養(yǎng)基中在30°C繼續(xù)培養(yǎng)約120 min后，待其OD達(dá)到0. 6時(shí)，加入0. 25 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)30°C培養(yǎng)18小時(shí)。誘導(dǎo)表達(dá)18h后,取100 mL培養(yǎng)物進(jìn)行fatty alcohols提取。RL6、RL8、RLlO的提取方法為向100 mL培養(yǎng)物中加入100 μ L 10 mg/mL的碳十五醇作為內(nèi)參，使其終濃度為10 mg/L，并加入2 mL正癸烷。隨后加入200 mL的有機(jī)液A (hexane :isopranol=3:2),劇烈萃取10分鐘后,靜置10分鐘,去除下層水溶液后,再加入180 mL硫酸鈉溶液B，繼續(xù)劇烈萃取10分鐘，再靜置10分鐘，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500 mL的圓底燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為50 °C水浴，壓力為50 psi。待有機(jī)液體正己烷和異丙醇被蒸發(fā)完后(在此條件下，正癸烷不能被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，將溶有產(chǎn)物的正癸烷溶液其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。RL7、RL9和RLll提取方法為在100 mL培養(yǎng)物中加入100 μ L 10 mg/mL的pentadecanol 作為內(nèi)參，再加入 200 mL 的溶液 A (hexane: isopranol=3:2),劇烈萃取 10min后,靜置10 min,去除下層水溶液后,再加入180 mL的溶液B(12 g硫酸鈉溶于180 mL水中)，繼續(xù)劇烈萃取10 min,再靜置10 min中，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500mL的圓底燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為40 °C水浴，壓力為250 psi。待有機(jī)液體被蒸發(fā)完后，分別3次用3 mL的正己烷溶解圓底燒瓶?jī)?nèi)壁的產(chǎn)物，再將這9 mL液體轉(zhuǎn)移到一個(gè)25mL的圓底燒瓶中，同樣條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。待有機(jī)層蒸發(fā)完畢后，用300 μ L的正己烷將圓底燒瓶中的產(chǎn)物溶出，將其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。、
將處理好的樣品進(jìn)行GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測(cè)。GC-MS為安捷倫的5975C/7890A系統(tǒng)，使用柱子為HP-INNOWax，氦氣流速I(mǎi) mL/min，進(jìn)樣量I μ L，分流比為10:1，RL6、RL8和RLlO的程序溫度為150 V 2分鐘，每分鐘升高5 1至240 °C，保持5分鐘。RL7、RL9和RLll程序溫度為50 V 2 min，每分鐘升高10 1至240 °C，保持10 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果六株菌中均產(chǎn)生了脂肪醇，產(chǎn)物包括碳十四飽和醇、碳十六飽和醇和碳十八烯醇，在大腸桿菌RLll中產(chǎn)量達(dá)到最高，約為10. 5 mg/L。該實(shí)例充分證明了利用DPW蛋白生產(chǎn)脂肪醇的可行性。實(shí)施例2
將已公布的基因序列經(jīng)優(yōu)化后進(jìn)行全合成(SEQ ID No. 3，由金維智生物科技有限公司合成)，并通過(guò)Afco I和漢I兩個(gè)酶切位點(diǎn)將其克隆于pET28載體上，構(gòu)建好的質(zhì)粒被命名為pFASR。將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21 (DE3)，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL12。將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入MG1655 (DE3) Zl RECA Δ ，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLl3。將將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入TLlOl，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL14。將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL15。將pFASR和pMSD8共轉(zhuǎn)化進(jìn)入TLlOI，利用卡拉霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL16。將pFASR和pMSD8共轉(zhuǎn)化進(jìn)入RLlO I，利用卡那霉素和羧芐青霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLl7。將以上六種菌分別接種于含有相應(yīng)抗生素的5 mL LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)約12 h后，將其轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)抗生素的300 mL LB培養(yǎng)基中在30 °C繼續(xù)培養(yǎng)約120 min后，待其OD達(dá)到O. 6時(shí)，加入O. 25 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)30°C培養(yǎng)18小時(shí)。
誘導(dǎo)表達(dá)18h后,取100 mL培養(yǎng)物進(jìn)行fatty alcohols提取。提取方法為在100 mL培養(yǎng)物中加入100 μ L 10mg/mL的pentadecanol作為內(nèi)參，再加入200 mL的溶液A (hexane:isopranol=3:2),劇烈萃取10 min后，靜置10 min,去除下層水溶液后，再加入180 mL的溶液B (12 g硫酸鈉溶于180 mL水中)，繼續(xù)劇烈萃取10 min,再靜置10 min中，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500 mL的圓底燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為40 °C水浴，壓力為250 psi。待有機(jī)液體被蒸發(fā)完后，分別3次用3 mL的正己烷溶解圓底燒瓶?jī)?nèi)壁的產(chǎn)物，再將這9 mL液體轉(zhuǎn)移到一個(gè)25 mL的圓底燒瓶中，同樣條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。待有機(jī)層蒸發(fā)完畢后，用300 μ L的正己烷將圓底燒瓶中的產(chǎn)物溶出，將其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。將處理好的樣品進(jìn)行GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測(cè)。GC-MS為安捷倫的 5975C/7890A系統(tǒng)，使用柱子為HP-INNOWax，氦氣流速I(mǎi) mL/min，進(jìn)樣量I μ L，分流比為10:1，程序溫度為50 V 2 min，每分鐘升高10 1至240 °C，保持10 min。挑取約為10個(gè)成功轉(zhuǎn)化子RLlOl/pFASR或RL101/pMSD8/pFASR培養(yǎng)于5 mL的含有相應(yīng)抗生素的M9培養(yǎng)基中，30°C過(guò)夜培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)入1000 mL含有相應(yīng)抗生素M9培養(yǎng)基中繼續(xù)在30°C培養(yǎng)24小時(shí)后，將1000 mL的菌液分批轉(zhuǎn)入無(wú)菌的80 mL離心管中，5000rpm離心5分鐘收集菌體，最后將所有菌體用50 mL含有相應(yīng)抗生素M9培養(yǎng)基懸浮均勻作為種子液上罐發(fā)酵，發(fā)酵的規(guī)模為4 L0當(dāng)罐中OD長(zhǎng)到6左右時(shí)，以0. 24 mL/min的速率補(bǔ)充補(bǔ)料培養(yǎng)基，當(dāng)OD長(zhǎng)到13左右時(shí)，加入終濃度0.25 mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后每隔4小時(shí)提取90 mL的培養(yǎng)物用液氮迅速冷凍后，保存于-80 °C冰箱。在補(bǔ)料前保持融氧為80 %以上，補(bǔ)料后由于菌體大量生長(zhǎng)融氧自然下降，盡量保持融氧較高。發(fā)酵產(chǎn)物提取脂肪醇方法將培養(yǎng)物從-80 °C冰箱中取出，自然融化，向40 mL培養(yǎng)物中加入40 μ L 100 mg/mL的碳十五醇作為內(nèi)參,使其終濃度為100 mg/L,并加入2 mL正癸烷。隨后加入200 mL的溶液A(heXane:iS0pran0l=3:2)，劇烈萃取10分鐘后，靜置10分鐘，去除下層水溶液后，再加入180 mL硫酸鈉溶液B(12 g硫酸鈉溶于180 mL水中)，繼續(xù)劇烈萃取10分鐘，再靜置10分鐘，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500 mL的圓底燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為50 °C水浴，壓力為50 psi。待有機(jī)液體正己烷和異丙醇被蒸發(fā)完后(在此條件下，正癸烷不能被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，將溶有產(chǎn)物的正癸烷溶液其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。發(fā)酵產(chǎn)物脂肪醇檢測(cè)方法將提取好的樣品進(jìn)行GCMS (氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測(cè)，GCMS為安捷倫5975C/7890A系統(tǒng)。氣相色譜柱為HP-INNOwax柱，氦氣流速為I mL/min，分流比為10:1。進(jìn)樣量為I yL。程序溫度為50 °C 2分鐘，每分鐘升高10°C至240°C，保持10分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果六株菌中均產(chǎn)生了脂肪醇，產(chǎn)物包括碳十四飽和醇、碳十六飽和醇、碳十六烯醇和碳十八烯醇。將大腸桿菌RL15和RL17進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明RL15的產(chǎn)量最高達(dá)到0. 8 g/L，產(chǎn)率達(dá)到I. 6 g/L/day，RL17的產(chǎn)量最高達(dá)到0. 65 g/L，產(chǎn)率達(dá)到2g/L/day。該實(shí)例充分證明了利用AAR蛋白生產(chǎn)脂肪醇的可行性，并且該蛋白有很大的工業(yè)化生產(chǎn)脂肪醇的潛力。
序列表說(shuō)明SEQ ID No. I和2分別為D/f基因序列和蛋白序列；SEQ ID No. 3和4分別為經(jīng)優(yōu)化后的W/ 基因序列和蛋白序列；SEQ ID No. 5&6是擴(kuò)增/ 必左臂的引物；SEQ IDNo. 7&8是擴(kuò)增fadD右臂的引物；SEQ ID No. 9&10是檢驗(yàn)為RLlOO陽(yáng)性克隆的引 物。
權(quán)利要求
1.一種利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，其是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞體內(nèi)，并使該基因在該宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，將脂肪酰載體蛋白還原酶基因克隆于表達(dá)載體上，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主體內(nèi)或插入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，并誘導(dǎo)表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，還包括通過(guò)改造宿主細(xì)胞脂肪酸合成和降解的代謝途徑或者根據(jù)宿主細(xì)胞密碼子的偏愛(ài)性對(duì)脂肪酰載體蛋白還原酶基因進(jìn)行優(yōu)化，以提高脂肪醇的產(chǎn)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)轉(zhuǎn)化脂肪酰載體蛋白還原酶基因異養(yǎng)微生物進(jìn)行耐受性篩選，獲得優(yōu)勢(shì)菌株，從而提高脂肪醇的產(chǎn)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主細(xì)胞代謝途徑是該宿主細(xì)胞體內(nèi)的有關(guān)脂肪酸合成和代謝的相關(guān)途徑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，改造的宿主細(xì)胞代謝途徑是該宿主細(xì)胞體內(nèi)提高脂肪酸的產(chǎn)量或者降低脂肪酸的產(chǎn)量用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主細(xì)胞代謝途徑是改變宿主細(xì)胞體內(nèi)脂肪酸代謝途徑中間物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，改造的異養(yǎng)微生物代謝途徑是改變?cè)摦愷B(yǎng)微生物體內(nèi)脂肪酸代謝途徑衍生物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。
11.一種異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞，其是接受轉(zhuǎn)脂肪酰載體蛋白還原酶基因的異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的異養(yǎng)微生物，其特征在于，所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因?yàn)閖/f基因或基因，其編碼如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，該方法是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞體內(nèi)，并使該基因在該宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)，從而改造異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞體內(nèi)的脂肪酸代謝途徑以生產(chǎn)脂肪醇。本發(fā)明還進(jìn)一步通過(guò)代謝改造，提高脂肪醇的產(chǎn)量。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在微生物體內(nèi)通過(guò)生物合成的方法合成脂肪醇，該技術(shù)是一種可再生的、低消耗的技術(shù)，且這種環(huán)保的生產(chǎn)方式能夠減少對(duì)稀缺資源石油的消耗，也不需要再進(jìn)行化學(xué)改造就可以直接生產(chǎn)脂肪醇，在工業(yè)上有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/13GK102719467SQ20121023394
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者付愛(ài)思, 劉天罡, 劉然 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)