專利名稱：利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法。
背景技術：
原位肝移植是終末期肝病治療的金標準。然而，肝源的短缺成為了肝細胞移植在臨床應用上最大的瓶頸。所以，找到合適的、豐富的肝細胞來源是現(xiàn)在生物學領域研究的熱點。1981年Evans等人建立了第一個小鼠ES細胞系，以其為模型，研究已證實小鼠ES細胞在體外不僅可以誘導分化為肝祖細胞，而且可以進一步分化為有功能的肝細胞。有動物實驗表明，將體外分化得到的肝細胞移植入肝損傷模型體內(nèi)，移植細胞能夠融合到肝臟組織，并緩解小鼠的肝損傷狀況，且移植3個月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)畸胎瘤和腫瘤的形成。人ES細胞的成功建立打開了體外產(chǎn)生可供移植治療的所有類型的人體細胞、組織乃至器官的大門。多數(shù)研究者利用各種成體干細胞在體外誘導分化為肝臟細胞，并研究其作用于急性肝損傷的動物模型，如腹腔注射四氯化碳、烯丙胺及倒千里光堿等造成的肝持續(xù)性纖維化，以及構(gòu)建肝部分切除動物模型。這些研究中，均對誘導分化后的細胞進行功能特性等研究，如形態(tài)學觀察，細胞表面抗原，成熟肝臟細胞所具有的糖原合成儲備、尿素產(chǎn)生、分泌白蛋白功能，肝臟細胞特異性蛋白(Alb，AFP等)的表達進行了研究。至今已有經(jīng)由骨髓間充質(zhì)肝細胞、胚胎干細胞、臍帶及臍帶血干細胞、胎盤間充質(zhì)干細胞等向肝細胞方向分化的報道。然而，由于骨髓的有創(chuàng)來源、胚胎干細胞等的致畸胎瘤性，使其面臨倫理學的爭議。2007年，Masud a等研究證實宮內(nèi)膜細胞符合干細胞的標準。宮內(nèi)膜細胞具有與人成體干細胞相同的多向分化潛能、表達細胞表面標志物的能力以及貼壁生長的特點。宮內(nèi)膜干細胞能表達干細胞表面標志物，如⑶9，⑶29，⑶41a，⑶44，⑶59，⑶73，⑶90和⑶105等。但一些造血干細胞表面標志物(如⑶34和⑶45等)則為陰性。經(jīng)血干細胞體外能長期培養(yǎng)而保持染色體組型的穩(wěn)定性不變，且其增殖分化潛能明顯高于臍帶血間充質(zhì)干細胞。Borlongan等利用經(jīng)血干細胞與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其并不能刺激淋巴細胞增殖，也就是說其免疫原性低，這為細胞移植的安全性提供了一定的保證。經(jīng)血干細胞能通過非侵入性手段輕易獲得，能利用標準的實驗室條件達到很好的擴增和定向分化結(jié)果。目前，已有報道經(jīng)血干細胞具有可成脂肪細胞、骨與軟骨、神經(jīng)細胞及心肌細胞肺上皮，胰島細胞等三個胚層的許多細胞分化的能力。有文獻報道，經(jīng)血干細胞成功定向分化為心肌細胞，并研究了該干細胞在心肌梗死動物模型中發(fā)揮的作用，發(fā)現(xiàn)其可一定程度緩解梗死灶、恢復心肌收縮功能。Toyoda等報道月經(jīng)血干細胞具有肌源性分化，從而在杜氏肌營養(yǎng)不良的恢復中發(fā)揮重要作用。Murphy則發(fā)現(xiàn)這種細胞在肢段缺血動物中能夠產(chǎn)生一些生長因子，抑制炎癥反應并且能夠在宿主體內(nèi)得到增殖。臺灣國立大學的Li將宮內(nèi)膜干細胞在體外誘導成能產(chǎn)生胰島素的細胞，并將其用于治療I型糖尿病，取得了很好的效果，發(fā)現(xiàn)細胞移植后能有效的控制血糖水平，且移植的干細胞在小鼠胰島內(nèi)發(fā)生分化也被觀察。還有研究稱月經(jīng)血干細胞不僅僅能表達干細胞特定表型標志，而且在實驗動物模型中能發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用，這一發(fā)現(xiàn)具體體現(xiàn)在耶魯大學和南佛羅里達大學的兩個研究組將其用于帕金森和中風的動物模型。經(jīng)血干細胞不僅能夠向神經(jīng)元方向分化而且在修復腦血管損傷上起重要作用。另外，有研究稱，臍帶間充質(zhì)干細胞可以定向分化為低免疫原性的肝細胞樣細胞。理論上，經(jīng)血干細胞僅低表達人類白細胞抗原I型，不表達人類白細胞抗原II型。這為解決異體細胞移植后所必然發(fā)生的排異反應提供了很大突破點。目前，尚無關于經(jīng)血干細胞定向分化為肝臟細胞的研究報道。經(jīng)血干細胞是最近發(fā)現(xiàn)的成體干細胞的一種，屬于間充質(zhì)干細胞(MSC)。子宮內(nèi)膜組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在豐富的間充質(zhì)干細胞，在月經(jīng)期間隨經(jīng)血排出體外，是一種無創(chuàng)、安全的干細胞來源方式。在細胞標記分子表達和細胞增殖、分化能力上，經(jīng)血干細胞與胚胎干細胞更相似。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法，包括以下步驟:I)、宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)和擴增:將經(jīng)血經(jīng)含抗生素 的殺菌液的殺菌處理后，離心，去上清液；然后加入Chang氏通用培養(yǎng)基置于4 6%C02、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后換液去除未貼壁細胞；一旦細胞生長至7515%匯合度時，即采用胰酶消化傳代；2)、體外誘導分化:A、將上述步驟I)所得的第2 4代生長狀況良好的細胞以胰酶消化，當顯微鏡下見細胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含體積濃度9 11%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心，所得的細胞沉淀用PBS (例如為:無鈣鎂離子的PBS洗滌液)清洗；B、將上述步驟A所得的經(jīng)PBS清洗后的細胞沉淀接種于6孔板中進行誘導培養(yǎng)，接種細胞密度為4.8 X IO5 5.2 X IO5/孔，每孔力口 Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基；在36 38°C、4 6%C02、94 96%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；C、選擇以下任意I個體系進行:體系1:待細胞生長密度到達80-90%時，向各孔中加入5-氮胞苷混勻，使5_氮胞苷達到終濃度為擴11 μ M ; 5-氮胞苷處理細胞22 26小時后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS (例如為:無鈣鎂離子的PBS洗滌液)清洗細胞2次；更換成Iml的誘導培養(yǎng)基I (即，每孔加Iml的誘導培養(yǎng)基I);然后置于36 381:、4 6%0)2、94 96%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隨后進行下述步驟D ；誘導培養(yǎng)基I的制備方法為:在Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基中加入0.018 0.022ml的FBS (胎牛血清)、39 41ng的HGF (人肝細胞生長因子)、19 21ng的EGF (人表皮生長因子)，加入DEX (地塞米松)使?jié)舛葹?9 51nM，加入0.008 0.012ml的ITS premix (胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復合物，該ITS premix為:10mg/L胰島素，5.5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ug/L亞硒酸)；體系2:待細胞完全貼壁后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換成Iml的誘導培養(yǎng)基II (S卩，每孔加Iml的誘導培養(yǎng)基II);然后置于5%C02，95%飽和濕度的37°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；隨后進行下述步驟D ;誘導培養(yǎng)基II的制備方法為:在Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基中加入0.018 0.022ml的FBS、19 21ng的HGF(人肝細胞生長因子)、擴IIng的FGF_4(人成纖維細胞生長因子-4)、9 Ilng的OSM (重組人致瘤素M)、39 41ng的DEX (地塞米松)，加入0.008 0.012ml的ITSpremix(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復合物，該ITS premix為:10mg/L胰島素，5.5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ug/L亞硒酸)；D、2_3天半量換液一次(即，用相應的誘導培養(yǎng)基I或者誘導培養(yǎng)基II進行半量換液)，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)；誘導時間為2(Γ22天，得較成熟具有肝臟細胞功能的肝臟細胞樣細胞。作為本發(fā)明的利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法的改進，步驟I)依次為:①、經(jīng)血收集:在采集管內(nèi)設置20ml的Hank’s平衡鹽溶液，并添加以下成分至以下濃度:萬古霉素60 100 Pg/mL、頭孢氨芐150 350 Pg/mL、卡那霉素5(Tl50 Pg/mL、慶大霉素80 160 μδ/mL、兩性霉素B 2^^g/mL及30(Γ500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液；將15 20ml的經(jīng)血放入上述采集管內(nèi)，于4°C的低溫下保存24 48小時；然后離心,去上清液；②、原代培養(yǎng):A)、取6 10ml的Chang氏通用培養(yǎng)基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養(yǎng)瓶中置于4 6%C02、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后全量換液；再將上述培養(yǎng)瓶直立3 8分鐘，從而使未貼壁的細胞滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；C)、在步驟B)所得的培養(yǎng)瓶中加入2 4 mL的Chang氏通用培養(yǎng)基進行潤洗，然后用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；D)、在步驟C)所得的培養(yǎng)瓶中加入6 10 mL的Chang氏通用培養(yǎng)基，置于4 6%C02、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；所述Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下:在無菌條件下，在無菌容器中加入650mL MEM-alpha 培養(yǎng)基、160 200mL 的 Chang B 基液、10 30mL 的 Chang C 基液、5 15 mL青霉素/鏈霉素雙抗(10，000 U/mL芐青霉素鈉，10, 000 Pg/mL鏈霉素)，5^15 mL的濃度為200 mM的L-谷氨酰胺、13(Tl70 mL的胎牛血清；充分混勻，高壓蒸汽滅菌后放入4°C冰箱保存待用；③、細胞傳代培養(yǎng):一旦步驟②原代培養(yǎng)的細胞生長至7515%匯合度時，即采用胰酶消化傳代；具體如下:A)、一旦步驟②原代培養(yǎng)的細胞生長至7515%匯合度時，去除培養(yǎng)液，然后用無鈣鎂離子的PBS進行洗滌；

B)、加入I 2ml胰酶，置于4 6%C02、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中孵育4 6分鐘；
C)、加入Γ6πι1的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；D)、輕柔吹打，使貼壁細胞脫落并成單細胞狀態(tài)；E)、按1:4的比率傳代；F)、在每1ml的細胞懸液中加入2 4ml的Chang氏通用培養(yǎng)基；然后置于4飛%0)2、94^96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)血干細胞是一種新研究發(fā)現(xiàn)的干細胞群，具有取材方便等特點，本發(fā)明通過體內(nèi)、體外實驗，運用免疫組化染色、RT_PCR、ELISA等技術驗證經(jīng)血干細胞治療急性肝損傷以及在終末期肝病干細胞移植的可行性，從而為干細胞治療提供新的種子資源。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:1、細胞來源豐富，分離培養(yǎng)技術已掌握，提供了一種新型的成體干細胞來源；2、通過體外定向誘導分化為肝臟樣功能細胞，提供了一種大量獲得肝臟細胞的方法;3、通過體內(nèi)移植，發(fā)現(xiàn)該細胞不僅能融入受損傷肝臟，而且可以一定程度恢復肝臟白蛋白水平和抑制轉(zhuǎn)氨酶的活性，為臨床終末期肝病的治療提供了一種新的選擇。綜上所述，本發(fā)明采用分離培養(yǎng)的宮內(nèi)膜(經(jīng)血)干細胞，利用體外干細胞誘導技術，研究宮內(nèi)膜干細胞的多能性和肝細胞定向分化，并通過體內(nèi)移植用于小鼠肝臟部分切除的急性肝損傷模型進行研究，證實其用于急性肝損傷治療的可行性，為肝臟疾病的干細胞治療提供一種新的途徑。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是宮內(nèi)膜干細胞分離獲得的結(jié)果圖；(A) i為原代培養(yǎng)細胞第7天的集形成落， 為傳代培養(yǎng)第一代細胞，呈長梭形，典型的成纖維樣細胞，單層生長；(B)宮內(nèi)膜干細胞表型鑒定。利用流式細胞術對傳代培養(yǎng)的第3代細胞進行表面標志的檢測分析，宮內(nèi)膜干細胞表達間充質(zhì)干細胞表型，但不表達造血干細胞表型(CD34，CD45 等)。(C)宮內(nèi)膜干細胞體外生長曲線，其在體外培養(yǎng)大約24小時發(fā)生倍增。圖2是宮內(nèi)膜干細胞成肝分化檢測結(jié)果圖；(A)宮內(nèi)膜干細胞在條件培養(yǎng)基作用下細胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，由原來的長梭形(i )逐漸發(fā)展為多角或者圓形的上皮樣細胞形態(tài)，至第21天呈現(xiàn)“鋪路石”樣形態(tài)(ii )，大體上類似于人肝細胞癌細胞株H印G2的生長狀態(tài)(iii) (50倍)；(B)成肝分化細胞在第10和20天肝臟細胞特異性基因表達的RT-PCR檢測，未分化細胞(control)和HepG2細胞分別作為陰性和陽性對照；(C)免疫細胞化學檢測肝細胞特異性蛋白ALB (ii)和AFP (iii)的表達，棕色為陽性。未分化的宮內(nèi)膜干細胞作為陰性對照(i)，藍色的核為經(jīng)蘇木素復染；(D)PAS染色。陽性結(jié)果為細胞被染色稱為紫紅色，對照組未見染色(圖片未展示)；(E) ICG 吸收實驗；(F)尿素合成實驗；分化第3，6，9，12，15，18，21，24天均可檢測到尿素水平，且呈逐漸升高趨勢，未分化的宮內(nèi)膜干細胞則無。(C、D、E均為100倍)。圖3是免疫組化檢測結(jié)果圖；對第一種誘導體系(即體系I)得到的細胞進行免疫細胞化學檢測，肝細胞特異性蛋白酶染色為陽性，分別為PCK26 (ii),CYPlAl (iii)，CYP3A4 (iv)，陰性對照未見陽性染色結(jié)果(i)。(200倍)。圖4是體內(nèi)試驗圖；( A )體內(nèi)試驗路線圖；(B)細胞移植小鼠(n=10)血清相對于假實驗組小鼠(n=10)血清ALB (p=0.04，i)，ALT (p=0.035，ii)和AST (p=0.049，iii)水平的變化。*:p〈0.05，表示移植干細胞可以一部分恢復白蛋白水平，也可部分抑制轉(zhuǎn)氨酶的活性；(C)免疫熒光化學檢測。用抗人特異性線粒體抗體檢測移植后2個月的小鼠肝臟組織切片中抑制細胞的存在。綠色熒光信號為陽性，表示該處組織中存在人細胞(ii，iii )，即可說明移植細胞經(jīng)脾臟遷移到受損傷肝臟中。假實驗組中未見熒光信號(i)，*代表血管腔，說明部分細胞附著在血管內(nèi)皮表面。(100倍)圖5是免疫組化檢測 圖；在移植細胞后60天，處死小鼠，取肝臟組織，固定，石蠟切片，免疫組化檢測。分為宮內(nèi)膜干細胞和誘導后肝細胞移植組(P.T.MenSCs組合P.T.&HLCs組)，i,，ii, v, vi, ix,和X為檢測人特異性線粒體(hMIT)的存在；iii，iv, vii, viii，和xi為檢測人肝細胞白蛋白(hALB)。i, iii為正常人肝臟組織切片，作為陽性對照；ii，iv為未行細胞移植組小鼠肝臟切片，作為陰性對照。V，vii, ix, xi顯示細胞存在于肝臟門靜脈血管周圍；vi, viii, x, xi顯示細胞整合入受體小鼠實質(zhì)內(nèi)部。棕褐色為陽性結(jié)果。(100倍)
具體實施例方式實施例1、經(jīng)血間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和擴增:招募10位不同年齡段的經(jīng)期婦女，在完全自愿的前提下捐獻月經(jīng)血樣品。經(jīng)抗生素處理24小時后，進行微生物檢測及傳染病病原體安全檢測。經(jīng)離心、去上清液，隨后接種，采用Chang氏通用培養(yǎng)基置于5%C02，95%飽和濕度的36 38°C (例如為37°C)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5-7天后換液去除未貼壁細胞，隨后每2 4天(例如為3天)換液一次。一旦細胞生長至80%匯合度，即采用胰酶/EDTA消化傳代。再利用流式細胞技術對經(jīng)血間充質(zhì)干細胞進行 CD117, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD29, HLA-DR 等分子表型鑒定。具體操作規(guī)程如下:一、宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)和擴增:招募10位不同年齡段的經(jīng)期婦女，在完全自愿的前提下捐獻月經(jīng)血樣品。具體操作規(guī)程如下:1、經(jīng)血樣品收集(細胞分離):將經(jīng)血采集管，月事杯放入經(jīng)血采集盒，送至經(jīng)血供者。采集管事先裝有20mlHBSS (Hank’s平衡鹽溶液)米集液,其中含有Vancomycin (萬古霉素)80 Pg/mL、Claforan(頭孢氨節(jié))250 Pg/mL、Amikacin (卡那霉素)100 Pg/mL、Gentamycin (慶大霉素)120 Pg/mL、Amphotericin B (兩性霉素B) 2.7 Kg/mL及400單位肝素鈉。以此作為含抗生素的殺菌液。即上述HBSS (Hank’s平衡鹽溶液)采集液的制備方法如下:在20ml的Hank’s平衡鹽溶液中添加以下成分至以下濃度:萬古霉素(Vancomycin) 80 M<g/mL、頭抱氛節(jié)(Claforan) 250 M<g/mL、卡那霉素(Amikacin) 100 M-g/mL、慶大霉素(Gentamycin) 120 Kg/mL、兩性霉素 B (Amphotericin B) 2.7Kg/mL 及 400 單位肝素鈉；然后再按照常規(guī)程序于高溫高壓下進行滅菌。供者在月經(jīng)開始的前幾天(第I至3天)，利用月事杯獲取經(jīng)血樣品。將每15 20ml的經(jīng)血(屬于同一個供者)放入上述I個采集管內(nèi)。在得到細胞捐贈者知會同意的情況下對細胞進行培養(yǎng)(此知會同意必需獲得制定評審委員會的批準)。在獲取樣品后送往處理實驗室之前必須將它們在低溫((T4°C)條件下進行保存(保存期一般為24到48小時)。I)保存24小時后，觀察經(jīng)血收集管中的樣品，如有沉淀，可將樣品經(jīng)由100micron過濾網(wǎng)過濾；2)準備離心前，仔細將樣品收集管的外周擦拭干凈；確保離心機上離心管的平衡；3)在840g、4.(TC的條件下離心樣品7分鐘；4)小心取出樣品收集管，勿擾亂細胞分層；5)將樣品收集管外周用酒精棉擦拭消毒后，移入生物安全柜進行下一步操作；6)去除上清液；小心吸液，不要擾亂細胞層，造成額外的細胞丟失。上述上清液可用于進行細菌檢測，即將該上清液按照常規(guī)的血培養(yǎng)法進行厭氧菌和需氧菌、真菌的檢測，并按照常規(guī)方法進行鑒定。若為陽性結(jié)果，則結(jié)束整個宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)和擴增。將上述HBSS (Hank’s平衡鹽溶液)采集液中被處理了 24小時后的經(jīng)血，按照常規(guī)方式進行微生物檢測及傳染病病原體安全檢測，一般對常見病毒如HIV、HBV, HCV, CMV和梅毒病原體進行檢測。若為陽性結(jié)果，則結(jié)束整個宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)和擴增。上述2種檢測目的是為了保證所得的宮內(nèi)膜干細胞(此處指未做誘導處理的用于移植治療的宮內(nèi)膜干細胞)的使用安全性。2、原代培養(yǎng):培養(yǎng)基配制-Chang氏通用培養(yǎng)基的成分如下:1)650 mL MEM alpha 培養(yǎng)基2)180 mL Chang 氏 B 液(基礎培養(yǎng)基)(18 % v/v)3) 20 mL Chang 氏 C 液(2 % v/v)4)10 mL青霉素/鏈霉素雙抗(10,000 U/mL芐青霉素鈉，10，000 gg/mL鏈霉素；即每ml青霉素/鏈霉素雙抗溶液中含有10，000 U的芐青霉素鈉和10，000 μg的鏈霉素)5) 10 mL 的 L-谷氨酰胺 200 mM (IOOx)6)150 mL 的胎牛血清(15 % v/v)Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下:在無菌條件下，在無菌容器中加入65OmL MEM-alpha 培養(yǎng)基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、180mL Chang B 基液(IrvineScientific 公司)、20mL Chang C 基液(Irvine Scientific 公司)、10 mL 青霉素 / 鏈霉素雙抗(10,000 U/mL芐青霉素鈉，10， 000 Pg/mL鏈霉素)，10 mL的濃度為200 mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine, Invitrogen 公司)、150 mL 的胎牛血清(ES-FBS, Invitrogen 公司)；充分混勻，按照常規(guī)方式高壓蒸汽滅菌后放入(T4°C冰箱保存待用。I)取7mLChang氏通用培養(yǎng)基，加入到已去除上清的經(jīng)血樣品(即步驟I的所得物)中，輕柔吹打混勻；得細胞懸液；2)取一個T-25培養(yǎng)瓶，將步驟I)所得的全部細胞懸液移取到該培養(yǎng)瓶中；3)放入5%C02、95%飽和濕度、37°C的培養(yǎng)箱(例如為孵箱)中培養(yǎng)；4)培養(yǎng)5-7天，全量換液(即換7mLChang氏通用培養(yǎng)基)。在生物安全柜中，先將培養(yǎng)瓶直立5分鐘，待未貼壁的細胞大部分隨培養(yǎng)基滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管將培養(yǎng)基去除。5)取3 mLChang氏通用培養(yǎng)基，慢慢在培養(yǎng)瓶側(cè)壁滴入。慢慢將培養(yǎng)瓶放平，輕柔地搖晃，潤洗細胞層，然后將培養(yǎng)瓶直立5分鐘，用移液管將培養(yǎng)基去除。6)取7 mL Chang氏通用培養(yǎng)基，慢慢在培養(yǎng)瓶側(cè)壁滴入。7)鏡下觀察，有散落的貼壁細胞。8)放入5%C02、95%飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，等干細胞細胞貼壁后，去除未貼壁的細胞，一般每隔2 4天換液一次繼續(xù)培養(yǎng)。一周后觀察 ，細胞生長，有成團細胞增殖(集落形成為間充質(zhì)干細胞特性之一)，此時細胞生長至80%匯合度。3、細胞傳代培養(yǎng)1)去除上述原代培養(yǎng)步驟的8)所得物中的培養(yǎng)液；2)用無鈣鎂離子的PBS洗滌液進行洗滌；上述無鈣鎂離子的PBS洗滌液的配制如下:
NaCl8.0Og
KCl0.2g
Na2HPO4 H2O1.56g
KH2PO40.2
雙蒸水定容至I L;于高壓蒸汽滅菌(常規(guī)程序)后放入4°C冰箱保存待用。3)加入Iml胰酶，37°C孵育(5%C02，95%飽和濕度)5分鐘；4)加入4ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；5)輕柔吹打，使貼壁細胞脫落并成單細胞狀態(tài)；6)按1:4的比率傳代:在4ml的細胞懸液中取Iml至一新的T-25培養(yǎng)瓶中，再加入3ml的Chang氏通用培養(yǎng)基,混勻；7)放入37 °C的CO2孵箱(5%C02，95%飽和濕度)內(nèi)培養(yǎng)；8)每3-4天傳代細胞一次(即從步驟I)開始至步驟7)為止，每3-4天傳代一次)，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率。4、經(jīng)血間充質(zhì)干細胞的分子表型鑒定及活力檢測:
一、流式細胞術檢測細胞表面抗原I)細胞傳至第3代時收集細胞，胰蛋白酶一 EDTA消化液(0.25%)消化細胞，制成細胞懸液，細胞濃度為I X IO6個/ml ；2)分別取所需數(shù)量的0.5ml EP管，分別加入小鼠抗人單克隆抗體(⑶117，⑶34，CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD29, HLA-DR 及同型對照)20 μ I ；3)、管內(nèi)分別加入細胞樣本(上述步驟I)所得)50 μ 1，避光4°C孵育30 min ；4)、300g 離心 5 分鐘；5)、棄上清，加入1% (質(zhì)量濃度)人血清的PBS 1ml，充分混勻，300g離心5分鐘；6)、棄上清，加入PBS調(diào)整樣本量至100 μ 1，上流式細胞儀進行分析；所得結(jié)果為:CD44，CD73,CD90, CD105 和 CD29 為陽性，CD117，CD34，CD45 和HLA-DR為陰性；從而確定所獲得的細胞符合間充質(zhì)干細胞的一般表型標準(即，確定所得為宮內(nèi)膜干細胞)。二、培養(yǎng)細胞活力測定——四唑鹽(MTT)比色法I)、將宮內(nèi)膜干細胞傳代培養(yǎng)至第3代，0.25%胰蛋白酶-EDTA (即，胰蛋白酶一EDTA消化液，0.25 % )消化細胞，用增殖培養(yǎng)基重懸細胞，取100 μ L單細胞懸液(I X IO3個/ml)接種于96孔板。在37°C、5% C02、95%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，每天作為一個時間點并分別設置6個復孔。

所述增殖培養(yǎng)基為:即為上述的Chang氏通用培養(yǎng)基。2)、將2mg/ml的MTT液60 μ L加入含有600 μ L增殖培養(yǎng)基的無菌管中，吹打混勻，取110 μ L所得的混合液加入待測孔中，輕輕震蕩孔板使溶液混勻；繼續(xù)于37°C、5% CO2,95%飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4小時；3)、吸出孔內(nèi)含MTT的培養(yǎng)液后，加入DMSO (100 μ L/孔)，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；4)、酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長490nm)。記錄結(jié)果。根據(jù)OD值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。并可以時間為橫軸，細胞增殖程度為縱軸，繪制細胞生長曲線。具體如圖1 (C)所示。根據(jù)該結(jié)果，我們得知:宮內(nèi)膜干細胞在體外傳代培養(yǎng)生長曲線呈典型的“S”形，細胞在接種后24小時內(nèi)可以達到倍增，隨后進入對數(shù)生長期，繼而進入平臺期。宮內(nèi)膜干細胞體外培養(yǎng)符合一般細胞的生長規(guī)律，未見有無限增殖的現(xiàn)象出現(xiàn)。實施例2、體外誘導分化及檢測:具體操作規(guī)程如下:1、體外定向誘導宮內(nèi)膜干細胞分化為肝臟細胞I)取培養(yǎng)第三代的生長狀況良好的細胞，表現(xiàn)為生長旺盛、胞體大、胞核清晰、胞漿豐富、顯微鏡下折光性強的細胞，以胰蛋白酶一 EDTA消化液(0.25%)消化，顯微鏡下見細胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含10% (體積濃度)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打后離心，獲得細胞沉淀，PBS (無鈣鎂離子的PBS洗滌液)洗2遍(目的是為了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物質(zhì))。2)將上述經(jīng)PBS清洗后的細胞沉淀接種于6孔板中進行誘導培養(yǎng)，接種細胞密度為5X IO5/孔，每孔加Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2,95%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)選擇以下任意I個體系進行:體系1:待細胞生長密度到達80-90% (B卩，細胞達到80%_90%匯合度)時，向各孔中加入適當體積的5-氮胞苷，使5-氮胞苷達到終濃度為10 μ Μ，輕輕搖晃平板使5-氮胞苷與培養(yǎng)基完全混勻，24小時后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(包括Chang氏通用培養(yǎng)基和5-氮胞苷)，用PBS (無鈣鎂離子的PBS洗滌液)清洗細胞2次；然后更換成Iml的誘導培養(yǎng)基I (S卩，每孔加入Iml的誘導培養(yǎng)基I);然后置于5%C02，95%飽和濕度的37°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。隨后按步驟4)執(zhí)行操作。誘導培養(yǎng)基I的制備方法為:在Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基中加入0.02ml的FBS(胎牛血清)、40ng的HGF (人肝細胞生長因子)，20ng的EGF (人表皮生長因子)，加入DEX(地塞米松)使?jié)舛葹?0nM，加入0.0lml的ITS premix (胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復合物，該ITS premix為:10mg/L胰島素，5.5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ug/L亞硒酸)。體系2:待細胞完全貼壁后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(即為Chang氏通用培養(yǎng)基)，更換成Iml的誘導培養(yǎng)基II (即，每孔加入Iml的誘導培養(yǎng)基II);然后置于5%C02，95%飽和濕度的37°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。隨后按步驟4)執(zhí)行操作。誘導培養(yǎng)基II的制備方法為:在Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基中加入0.02ml的FBS(胎牛血清)、20ng的HGF(人肝細胞生長因子)、IOng的FGF_4(人成纖維細胞生長因子-4)、IOng的OSM (重組人致瘤素M), 40ng的DEX (地塞米松),加入0.0lml的ITS premix (胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復合物，該ITS premix為:10mg/L胰島素，5.5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ug/L亞硒酸)。4) 2-3天半量換液一次((即，用相應的誘導培養(yǎng)基I或者誘導培養(yǎng)基II進行半量換液))，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。誘導時間為21天，得較成熟具有肝臟細胞功能的肝臟細胞樣細胞。 2、設置對照組:相對于上文中的“體外定向誘導經(jīng)血干細胞分化為肝臟細胞”作如下改動，其余同“體外定向誘導經(jīng)血干細胞分化為肝臟細胞”的步驟I) 步驟4)。取消體系I的“誘導培養(yǎng)基I”中的“40ng的HGF (人肝細胞生長因子)和20ng的EGF (人表皮生長因子)”的使用；作為體系I的對照組；取消體系2的“誘導培養(yǎng)基II ”中的“20ng的HGF (人肝細胞生長因子)、IOng的FGF-4 (人成纖維細胞生長因子_4)、IOng的OSM (重組人致瘤素M)”的使用；作為體系2的對照組；結(jié)果為:2個對照組的細胞形態(tài)均未發(fā)生變化。3、體外分化的肝臟細胞鑒定下面以按照體系I所得的較成熟具有肝臟細胞功能的肝臟細胞樣細胞以及體系I的對照組為例，進行下述鑒定:I)、經(jīng)血間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察細胞在誘導后定期鏡下觀察其形態(tài)、胞漿顆粒及細微結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖所示。2)、免疫組化鑒定收集對照組(上述步驟2所得的體系I的對照組)和誘導組(上述步驟I所得的體系I)誘導后第21天的細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定，加入3%H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別加入待測的一抗(AFP，ALB)，4°C過夜，加入生物素標記的二抗(羊抗兔IgG)，37°C孵育45 min, DAB顯色(鏡下控制顯色時間)，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。實驗中用0.1M PBS代替一抗作陰性對照。細胞在免疫組化染色后鏡下隨機數(shù)取非重疊10個視野計算陽性細胞的比例，根據(jù)染色強度進行分級。陽性標準為鏡下胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。結(jié)果如圖2 (A)所示；根據(jù)該結(jié)果我們能得出以下結(jié)論:宮內(nèi)膜干細胞在條件培養(yǎng)基作用下細胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，由原來的長梭形逐漸發(fā)展為多角或者圓形的上皮樣細胞形態(tài)，至第21天呈現(xiàn)“鋪路石”樣形態(tài)。3)、RT-PCR檢測肝臟細胞特異性蛋白mRNA (AFP, ALB等)的表達取未經(jīng)誘導的第2代細胞和誘導后第10天和20天的細胞，計數(shù)約I X IO6個，Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄并進行體外擴增。PCR所需引物見下表:表1、RT-PCR引物序列及片段擴增長度
權(quán)利要求
1.利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法，其特征是包括以下步驟: 1)、宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)和擴增: 將經(jīng)血經(jīng)含抗生素的殺菌液的殺菌處理后，離心，去上清液；然后加入Chang氏通用培養(yǎng)基置于4 6%C02、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 培養(yǎng)5 7天后換液去除未貼壁細胞；一旦細胞生長至7515%匯合度時，即采用胰酶消化傳代； 2)、體外誘導分化: A、將上述步驟I)所得的第2 4代生長狀況良好的細胞以胰酶消化，當顯微鏡下見細胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含體積濃度擴11%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心，所得的細胞沉淀用PBS清洗； B、將上述步驟A所得的經(jīng)PBS清洗后的細胞沉淀接種于6孔板中進行誘導培養(yǎng)，接種細胞密度為4.8X IO5 5.2X IO5/孔，每孔加Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基；在36 38°C、4 6%C02、94 96%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； C、選擇以下任意I個體系進行: 體系1:待細胞生長密度到達80-90%時，向各孔中加入5-氮胞苷混勻，使5-氮胞苷達到終濃度為擴11 μ M ; 5-氮胞苷處理細胞22 26小時后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次；更換成Iml的誘導培養(yǎng)基I ;然后置于36 38 、Γ6%0)2、9Γ96%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隨后進行下述步驟D ; 誘導培養(yǎng)基I的制備方法為:在Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基中加入0.018 0.022ml的FBS (胎牛血清)、 39 41ng的HGF (人肝細胞生長因子)、19 21ng的EGF (人表皮生長因子)，加入DEX (地塞米松)使?jié)舛葹?9 51nM，加入0.008 0.012ml的ITS premix ； 體系2:待細胞完全貼壁后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換成Iml的誘導培養(yǎng)基II ;然后置于5%C02，95%飽和濕度的37 °C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；隨后進行下述步驟D ; 誘導培養(yǎng)基II的制備方法為:在Iml的Chang氏通用培養(yǎng)基中加入0.018 0.022ml的FBS、19 21ng的HGF (人肝細胞生長因子)、擴Ilng的FGF-4 (人成纖維細胞生長因子_4)、9 Ilng的OSM (重組人致瘤素M)、39 41ng的DEX (地塞米松)，加入0.008 0.012ml的ITSpremix (胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復合物)； D、2-3天半量換液一次，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)；誘導時間為2(Γ22天，得具有肝臟細胞功能的肝臟細胞樣細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法，其特征是所述步驟I)依次為: ①、經(jīng)血收集: 在采集管內(nèi)設置20ml的Hank’s平衡鹽溶液，并添加以下成分至以下濃度:萬古霉素60^100 Pg/mL、頭孢氨芐 150 350 Pg/mL、卡那霉素 5(Tl50 Pg/mL、慶大霉素8(Tl60 Pg/mL、兩性霉素B 2^^g/mL及30(Γ500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液； 將15 20ml的經(jīng)血放入上述采集管內(nèi)，于4°C的低溫下保存24 48小時；然后離心，去上清液； ②、原代培養(yǎng): A)、取6 10ml的Chang氏通用培養(yǎng)基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養(yǎng)瓶中置于4飛%0)2、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后全量換液；再將上述培養(yǎng)瓶直立3、分鐘,從而使未貼壁的細胞滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基； C)、在步驟B)所得的培養(yǎng)瓶中加入2 4mL的Chang氏通用培養(yǎng)基進行潤洗，然后用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基； D)、在步驟C)所得的培養(yǎng)瓶中加入6 10mL的Chang氏通用培養(yǎng)基，置于4飛%0)2、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)； 所述Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下:在無菌條件下，在無菌容器中加入650mLMEM-alpha 培養(yǎng)基、16(T200mL 的 Chang B 基液、10 30mL 的 Chang C 基液、5 15 mL 青霉素/鏈霉素雙抗(10,000 ~1^芐青霉素鈉，10，000 Pg/mL鏈霉素)，5 15 mL的濃度為200mM的L-谷氨酰胺、13(Tl70 mL的胎牛血清；充分混勻，高壓蒸汽滅菌后放入4°C冰箱保存待用； ③、細胞傳代培養(yǎng): 一旦步驟②原代培養(yǎng)的細胞生長至7515%匯合度時，即采用胰酶消化傳代；具體如下: A)、一旦步驟②原代培養(yǎng)的細胞生長至7515%匯合度時，去除培養(yǎng)液，然后用無鈣鎂離子的PBS進行洗滌； B)、加入I 2ml胰酶，置于4 6%C02、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中孵育4 6分鐘； C)、加入4飛ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活； D)、輕柔吹打，使貼壁細胞脫落并成單細胞狀態(tài)； E)、按1:4的比率傳代； F)、在每Iml的細胞懸液中加入2 4ml的Chang氏通用培養(yǎng)基；然后置于4 6%C02、94^96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用宮內(nèi)膜干細胞誘導分化肝臟細胞的方法，包括以下步驟 1)宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)和擴增；2)體外誘導分化A、將上述步驟1)所得的第2~4代生長狀況良好的細胞以胰酶消化，當顯微鏡下見細胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含體積濃度9~11%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心，所得的細胞沉淀用PBS清洗；B、將上述步驟A所得的經(jīng)PBS清洗后的細胞沉淀接種于6孔板中進行誘導培養(yǎng)； C、選擇采用誘導培養(yǎng)基I的體系1或者采用誘導培養(yǎng)基Ⅱ的體系2進行誘導培養(yǎng)；D、2-3天半量換液一次，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)；誘導時間為20~22天，得具有肝臟細胞功能的肝臟細胞樣細胞。
文檔編號C12N5/074GK103173407SQ20121023373
公開日2013年6月26日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者項春生 申請人:杭州易文賽生物技術有限公司