專利名稱：懸浮細胞脂質體轉染用細胞培養板預處理方法
技術領域：
本發明涉及一種懸浮細胞脂質體轉染方法，尤其是一種操作方法簡單，可對懸浮細胞高效轉染外遠性基因(miR或SiRNA)的懸浮細胞脂質體轉染用細胞培養板預處理方法。
背景技術：
基因轉移技術對于現代生命科學有著十分重要的意義。通常的外源性基因包括microRNA (miR)轉染細胞的方法主要有磷酸韓沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂質體轉染法、逆轉錄病毒介導轉染法、電穿孔轉染法等。不同的轉染方法各有不同的優缺點，其中脂質體轉染法制備過程相對比較簡單，不需要特殊的儀器，并且具有毒性低、包裝容量大、研究周期短等優點而被廣泛應用。以質粒DNA轉染為例，現有脂質體轉染的操作步驟是
1.將細胞鋪于細胞培養板的培養孔內，用無抗生素培養基培養過夜； 2.將DNA質粒溶于50ul無血清的Opti— MEM I Reduced Serum Medium中，混合均
勻；
3.將適量Lipofectamine2000溶于50ul無血清的Opti — MEM I中，混合均勻，在室溫下孵育5分鐘；
4.將上述兩種混合物混合(總體積IOOul)均勻，在室溫下孵育25分鐘得復合物；
5.在細胞培養板(24孔板)的每個培養孔中加入IOOul的復合物以及適量培養基,十字法混合均勻；
6.細胞在37°CC02培養箱中培養18 48個小時。由于脂質體轉染是基于電荷吸引的原理，先形成脂質體-DNA或RNA復合物，散布在細胞周圍，然后通過細胞的內吞作用，將目的基因導入細胞內，因此，脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會比懸浮細胞高出很多倍，脂質體轉染時懸浮細胞的轉染效率要明顯低于貼壁細胞。目前，為了提高懸浮細胞脂質體轉染率，通常采用對細胞培養板預處理的方法，即先將轉染用的細胞培養板用纖連蛋白(fibronectin)包被，然后在細胞培養板中加入懸浮細胞，隨后離心約一小時使細胞處于“貼壁”狀態。即使如此，其轉染率最高也很難達到要求，分析其原因如下
I.纖連蛋白是與細胞粘附有關的分子，其是細胞外基質的重要成分，也是⑶44和整合素家族某些成員的配體之一，是整合素a 5 P I在人體的特異配體。在白血病研究領域，有研究發現，整合素a 5 ^ I僅大量表達于慢性粒細胞白血病祖細胞上，但由于其功能存在缺陷而導致細胞異常增殖和黏附功能下降。因此，在白血病研究領域用纖連蛋白包被轉染用的細胞培養板，雖然可使懸浮細胞“貼壁”，但并沒能夠真正提高細胞的轉染效率；
2.離心不但操作復雜、費時費力，而且可使部分懸浮細胞損傷，直接影響轉染效率
發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作方法簡單，可對懸浮細胞高效轉染外源性基因UiR或siRNA)的懸浮細胞脂質體轉染用細胞培養板預處
理方法。本發明的技術解決方案是一種懸浮細胞脂質體轉染用細胞培養板預處理方法，其特征在于按如下步驟進行
a.將多聚賴氨酸用無菌三蒸水溶解至lmg/ml ；
b.將a步驟所得溶液均勻覆蓋在細胞培養板的培養孔表面；
c.靜置5分鐘后，棄溶液，用無菌三蒸水洗培養孔表面，晾干；
d.紫外線照射30分鐘。
本發明對細胞培養板預處理后，無需離心，既可使懸浮細胞“粘附”于細胞培養板上(類似懸浮細胞貼壁)，加大了脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會，有效提高了懸浮細胞的轉染效率(至少可達70%)，可對懸浮細胞高效轉染外源性基因(miR或siRNA)，操作簡單、省時省力。
圖I是本發明實施例I顯微鏡鏡下結果圖。圖2是本發明實施例I FCM檢測olig NC-FAM轉染NB4細胞的轉染效率示意圖。圖3是本發明實施例2 FCM檢測olig NC-FAM轉染U937細胞的轉染效率示意圖。
具體實施例方式實施例I :
a.將多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)用無菌三蒸水溶解至lmg/ml；
b.將a步驟所得溶液均勻覆蓋在細胞培養板的培養孔上，既可將a步驟所得溶液加入培養孔內，輕輕搖動使之完全覆蓋培養孔表面；
c.靜置5分鐘后，棄溶液，用無菌三蒸水洗培養孔表面，晾干，；
d.紫外線照射30分鐘。 使用前，先用少量培養液洗，加入需要轉染的NB4懸浮細胞，37度5%C02孵箱孵育，靜置2小時左右，NB4懸浮細胞即可實“貼壁”(粘附于細胞培養板似貼壁細胞)，然后按照lipo2000轉染貼壁細胞的方法進行轉染olig NC-FAM。轉染6h后換液一次；轉染后72h，顯微鏡觀察結果見圖1，圖中A熒光檢測結果，B白光對照結果。熒光顯微鏡下轉染olig NC-FAM的細胞可見熒光，而對照組細胞未見熒光；隨后，流式細胞儀測得轉染效率為72. 31%(見圖2)。圖2中左上、左下為olig NC轉染NB4細胞72小時的檢測結果；圖2中右上、右下為olig NC-FAM轉染NB4細胞72小時的檢測結果。實施例2:
a.將多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)用無菌三蒸水溶解至lmg/ml；
b.將a步驟所得溶液均勻覆蓋在細胞培養板的培養孔上，即將a步驟所得溶液加入培養孔內，輕輕搖動使之完全覆蓋培養孔表面；
c.靜置5分鐘后，棄溶液，用無菌三蒸水洗培養孔表面，晾干；d.紫外線照射30分鐘。轉染方法均同實施例1，所用細胞為U937懸浮細胞，轉染后，測得轉染效率為99.8% (見圖3)。圖3 中左上、左下為olig NC轉染U937細胞24小時的檢測結果；圖3中右上、右下為olig NC-FAM轉染U937細胞24小時的檢測結果。
權利要求
1.一種懸浮細胞脂質體轉染用細胞培養板預處理方法，其特征在于按如下步驟進行a.將多聚賴氨酸用無菌三蒸水溶解至lmg/ml；b.將a步驟所得溶液均勻覆蓋在細胞培養板的培養孔表面；c.靜置5分鐘后，棄溶液，用無菌三蒸水洗培養孔表面，晾干；d.紫外線照射30分鐘。
全文摘要
本發明公開一種懸浮細胞脂質體轉染用細胞培養板預處理方法，按如下步驟進行將多聚賴氨酸用無菌三蒸水溶解至1mg/ml；將a步驟所得溶液均勻覆蓋在細胞培養板的培養孔表面；靜置5分鐘后，棄溶液，用無菌三蒸水洗培養孔表面，晾干；紫外線照射30分鐘。本發明對細胞培養板預處理后，無需離心，既可使懸浮細胞“粘附”于細胞培養板上(類似懸浮細胞貼壁)，加大了脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會，有效提高了懸浮細胞的轉染效率(至少可達70%)，可對懸浮細胞高效轉染外源性基因(miR或siRNA)，操作簡單、省時省力。
文檔編號C12N15/88GK102719480SQ20121023362
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月8日 優先權日2012年7月8日
發明者李傳剛, 李墨林, 舒曉宏 申請人:大連醫科大學