Ehbp1基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種EHBP1基因突變檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對C177T位點的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，針對C164T位點的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，針對C158A位點的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，和/或針對G76A位點的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達100％，能實現(xiàn)多個突變位點的野生型和突變型單獨和并行檢測。
【專利說明】EHBP1基因突變檢測特異性引物和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種EHBPl基因突變檢測特異性引物和液相芯片。【背景技術(shù)】
[0002]EHBPl基因稱Ε?域結(jié)合蛋白I,英文名稱為Ε? domain binding proteinl,位于2號染色體2pl5上，62900985到63273621堿基對之間。EHBPl基因包含一個假定的肌動蛋白結(jié)合調(diào)寧蛋白同源結(jié)構(gòu)域，在一個完整的細胞上，該基因的高表達能夠介導(dǎo)大量肌動蛋白的重組。EHBPl基因編碼EPS15同源域蛋白，編碼的蛋白在內(nèi)吞作用白細胞聚集上發(fā)揮著作用，有研究表明，EHBPl基因的單核苷酸多態(tài)性與前列腺癌發(fā)生有關(guān)，EHBPl基因的缺陷可以導(dǎo)致機體對前列腺癌的遺傳類型12 (HPC12)的易感性，而大多數(shù)的前列腺癌是由前列腺導(dǎo)管腺癌發(fā)展而來的。
[0003]目前，EHBPl基因突變檢測方法主要有=Illumina光纖微珠芯片技術(shù)、SNPlexGenotyping System技術(shù)和突光定量PCR技術(shù),雖然Illumina光纖微珠芯片技術(shù)是高靈敏度和精確性的高通量檢測系統(tǒng)，但是自動化程度低，手工操作比較多，難以滿足實際應(yīng)用的需要,SNPlexTMSystem技術(shù)對SNP序列特異性要求較高，不能隨意地分析所選擇的單核苷酸多態(tài)性位點，難以應(yīng)用于臨床檢測診斷，而且該方法操作比較復(fù)雜，不能滿足實際應(yīng)用的需要。熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高、特異性強、自動化程度高的特點，但存在樣品易污染、假陽性率高的缺點，且每次只能檢測一種突變類型，同樣不能滿足實際應(yīng)用的需要。
[0004]本發(fā)明目標(biāo)檢測的EHBPI基因突變位點，如表所示:
[0005]
序號|EHBP1基因位點突變的內(nèi)容[Wl~
1SEQ ID N0.41的第177位核苷酸，發(fā)生C — T突變 C177T
2SEQ ID N0.42的第164位核苷酸，發(fā)生C — T突變 C164T
3SEQ ID N0.43的第158位核苷酸，發(fā)生C — A突變 C158A
6SEQ ID N0.44的第76位核苷酸，發(fā)生G — A突變 G76A~
[0006]SEQ ID N0.41 突變位點:C177T
[0007]CTACGAGCACACACACCACACTTAGCTGATTTTTGAAAATATTTTTGTGGAGATGGGGGTCTCACTACGTTGCCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGGCTTCAAGCAACCCTCCCATCACAGACTCCCAAAGTGGTGGGATTATAGGCATGAGCCACTGCCTCTGGACTCACTGGCAT Q CCATATAGCACATATTATGTTGTAGGCACTTTGCTAGACTCTAAAGTGATAAACAGACACTTATGGTAATGTTTTTGTTGTCGCTTTTTGAGACAGGGTCTTGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCACAATCTCAGCTTACTGCAGCCTCAACCTCCTAAACTCAAGCAATTCTCCCACCTCAGCCTCC
[0008]SEQ ID N0.42 突變位點:C164T[0009]AGTCTTTGCTTTGGCAGTCTGGGAGGGATCTTCACATGGGAAGAGTCACTTGAGTTAGATCTCAAGTGAGATATAACTTGAGTTAGGTCAGCCAATCCCCCAGTCCTCCAGGGGTACCCCCACACCTGGCAGGGCTCCTGTTCCACACTGAGGTCCTTATTC0CCAAGGGACCTTGATAATCCTCAGGGGTTCTGCCACCATCGGGCAGCCCATGGGCCGGGGGGGTGAAGCACATGGGCTCAAGTTCCAGTCCTGGCTGACACCTAACTCATGGGGTAACCTTGGGCAAACTACCTAAATCCTTTGTGTCTGTTTCCTCCTCT
[0010]SEQ ID N0.43 突變位點:C158A
[0011 ] GCATTCTCTGGACTCTTACAAGGACACTAATCCATTAATAAGGAGTCTAGCCTCATGACCTCATCTAAGCCTAATTACTTTCCAAAAACTATCTCCTAGTACCATCTCATTAAGGGTTAGGGTTTCAACTTACGAATTTTAGGG
ggacacaagcatcQagttcataacaaatatcttttcttgagtgtatttgatatctgtctgtcctctttggtgaaat
GTCTGTCAGTGCCTTTTGCCCATTTTCTAATTAAGTTATTTGCTATTGCATTATTATTGATTTCCTACAAGTTAACT TTAATCTCTCTAGTTTTGGTTCCTGACTGAAGTTTATTTTGTCCTGGAGGAGGAACATTTGGCAATGTCTATATATG
CCTTCAGTTGTCACACGAG
[0012]SEQ ID N0.44 突變位點:G76A
[0013]TCCCTCAACATCTGTCCCTTTCTGAAAAAGTACATCCTTAGGCTTGATTTTTGGCTTCCTAAGTAAATGCTTACT@TGAGCATTAATATTAATAACAATAGTTTACATTTATTGAAGACTTCCCATCTACTATGTAAACCATTTGGAAGAAGAAAACAATAAAGAAAAAAGATTGACTGGGTGCGGTGGCTCACGCCTGTAATACCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGTGGATCACAAGGTCAGGAGTTCAAGAC
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014]本發(fā)明的目的之一是提供EHBPl基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨或并行檢測EHBPl基因四種常見基因型C177T、C164T、C158A和G76A的野生型和突變型。
[0015]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0016]一種EHBPl基因突變檢測液相芯片，包括有:
[0017](A).針對EHBPl基因不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對C177T位點的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，針對C164T位點的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 C158A 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和/或針對G76A位點的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16 ;所述tag序列選自SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.8 ；
[0018](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對；
[0019]( C).用于擴增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。
[0020]在其中一些實施例中，所述擴增引物是:針對C177T位點的SEQ ID N0.25及SEQID N0.26，針對 C164T 位點的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28，針對 C158A 位點的 SEQ IDN0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或針對 G76A 位點的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
[0021]在其中一些實施例中，所述ASPE引物為:針對C177T位點的由SEQ ID N0.1和SEQID N0.9組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10組成的序列，針對C164T位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12組成的序列，針對C158A位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQID N0.14組成的序列，和/或針對G76A位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16組成的序列。
[0022] 本發(fā)明的另一目的是提供用于EHBPl基因突變檢測的特異性引物。
[0023]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0024]用于EHBPl基因突變檢測的特異性引物，所述特異性引物序列為:針對C177T位點的 SEQID N0.9 及 SEQ ID N0.10，針對 C164T 位點的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 C158A 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或針對 G76A 位點的 SEQ ID N0.15 及SEQ ID N0.16。
[0025]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0026]1.本發(fā)明所提供的EHBPl基因突變檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達100%，且檢測所需要的時間遠遠低于常用的測序技術(shù)，特別符合實際應(yīng)用需要。所制備的EHBPl基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個突變位點的并行檢測。
[0027]2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計經(jīng)驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變位點，準確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測的PCR擴增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。
[0028]3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，4種突變位點檢測可通過一步PCR即可完成4條含有突變位點的目標(biāo)序列的擴增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。
[0029]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準確可靠。
【具體實施方式】
[0030]實施例1EHBPl基因突變檢測液相芯片，主要包括有:
[0031]一、ASPE 引物
[0032]針對EHBPl基因四種常見基因型C177T、C164T、C158A和G76A的野生型和突變型，分別設(shè)計特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0033]表1EHBPl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
【權(quán)利要求】
1.一種EHBPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對EHBPl基因不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對C177T位點的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，針對C164T位點的SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 C158A 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或針對 G76A 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQID N0.8 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用于擴增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EHBPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物是:針對C177T 位點的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26，針對 C164T 位點的 SEQ ID N0.27 及 SEQID N0.28，針對 C158A 位點的 SEQ ID N0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或針對 G76A 位點的 SEQID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EHBPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為:針對C177T位點的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.9組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10組成的序列，針對C164T位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12組成的序列，針對C158A位點的由SEQ ID N0.5和SEQID N0.13組成的序列及 由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14組成的序列，和/或針對G76A位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EHBPl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10 個 T。
5.用于EHBPl基因突變檢測的特異性引物，其特征是，所述特異性引物序列為:針對C177T 位點的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，針對 C164T 位點的 SEQ ID N0.11 及 SEQ IDN0.12，針對 C158A 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或針對 G76A 位點的 SEQ IDN0.15 及 SEQ ID N0.16。
【文檔編號】C12N15/11GK103571931SQ201210259510
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月18日
【發(fā)明者】許嘉森, 吳詩揚 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司