專利名稱：梅久蘭鏈霉菌zw-1菌株及其發酵液的抑菌用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種來自海洋的鏈霉菌菌株的用途，特別是梅久蘭鏈霉菌ZW-I菌株及其發酵液的抑菌用途。
背景技術：
生物防治已經成為植物病害防治的重要手段。但目前用于生物防治的微生物菌株多數來自于陸地，而多年來對陸地微生物的篩選，導致篩選到產生新型抗病機制的微生物的幾率越來越低，因而越來越多的人們把目光投向了海洋，希望從海洋環境中極具多祥性的微生物中開發出新型抗病原菌活性物質，用于植物病害的生物防治。近幾年以來，從海洋中尋找微生物新種和具有特殊功能的生理活性物質成為國內外的研究熱點，海洋微生物已經成為農用抗生素的新資源。·海洋放線菌是海洋微生物中ー類特殊的、具有重要經濟價值的微生物，據不完全統計，近年來50%以上新發現的海洋微生物活性物質是由海洋放線菌這個龐大的分類群產生的，許多放線菌的次生代謝產物具有醫藥和植物保護方面的用途，已廣泛用作抗細菌、抗真菌和抗腫瘤藥物。目前關于海洋放線菌活性物質的研究已經引起人們的重視，從海洋環境中分離得到了多種產生新活性物質的海洋放線菌，并對得到菌株的發酵條件、生物活性以及活性物質的分離鑒定進行了研究，取得了一定的成果，海洋放線菌對植物病原真菌的抗菌作用研究已有報道，但有關梅久蘭鏈霉菌iStreptomyces對植物病原真菌抗菌活性的研究目前尚未見報道。目前隨著人們生活水平的提高和對食品安全的重視，一些高毒農藥逐步限制使用，防治植物病害需要開發大量無毒的微生物農藥，優良微生物菌株的篩選是生物農藥研發的基礎，而現有的微生物菌株遠不能滿足微生物農藥開發的需求，分離篩選新型抗菌微生物菌株對于微生物農藥的開發具有重要意義。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供ー種梅久蘭鏈霉菌ZW-I菌株的新的抑菌用途。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種梅久蘭鏈霉菌ZW-I (.Streptomyces medioIani strain zw_l)及其發酵液的抑菌用途,所抑的菌為小麥雪腐錸刀菌a / irah)、小麥赤霉病菌greunirwaruni)
落葉病菌油菜菌核病菌{Sclerotinia、菠菜早
疫病菌 iAltorimria solani )、玉米圓斑病菌{Helminthosporium ca/ふ9/ )、西瓜枯萎病M (Fusarium oxysporum f. sp./ i Fe應ノ或者棉花枯_病菌、/7W1Sari應 oxysporum f. sp.vasmfectum)
本發明所涉及的生物材料“梅久蘭鏈霉菌ZW-1 CStreptomyces mediolani strainzw-1)”菌株已于2011年12月5日在Genebank公開(登錄號為JQ309924. 1，網址為http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/JQ309924. I。該菌株為公知公用材料，在該專利申請日期起二十年內，公眾如果需要，淮海工學院海洋學院實驗室可對外提供。本發明中所述的梅久蘭鏈霉菌ZW-I是通過以下方法分離得到
(1)分離純化從連云港海域的連島、高公島采集海水、海泥、近海土樣、海洋動、植物樣品，25°C，180r/min富集振蕩培養5d ;采用稀釋平板分離法分離放線菌，三區劃線純化后轉接到高氏一號斜面培養基上；
(2)菌株的篩選采用平板對峙法，取直徑5_植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周對稱位置，距離平皿邊緣15_處劃線接種分離到的海洋放線菌不同菌株，25°C倒置恒溫培養，觀察真菌菌絲生長情況，5d后測量抑菌帶寬度，每個菌株為一處理，以不接放線菌對照，重復3次；選取一株對所述的8種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于8_、發酵液的抑菌帶寬度高于5mm的菌株，記為ZW-I菌株；
(3)菌株的鑒定采用插片法，將ZW-I菌株劃線接種到高氏一號培養基平板上，將滅 菌的蓋玻片以45°角插入劃線接種部位的培養基內，28°C條件下分別于培養4、6、8d取出蓋玻片，觀察菌絲及孢子絲形態特征；同時進行生理生化試驗，并進行16S rDNA測序分析；根據形態學和生理生化試驗結果初步認為菌株ZW-I屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，ZW-I菌株最接近于mediolani，二考飽16SrDNA序列相似性為99 %, Zff-I菌株為梅久蘭鏈霉菌mediolani')。本發明中所述的梅久蘭鏈霉菌ZW-I是發明人從連云港海域采集海水海泥、海洋動植物樣品，分離純化具有抗真菌作用的海洋放線菌，并對優良菌株的抗菌作用和種類鑒定進行系統研究，旨在為海洋放線菌用于植物病害的生物防治提供優良菌株和理論依據。下面對本發明進行更為詳細的說明。I材料和方法
I.I供試植物病原真菌
小麥雪腐鐮刀菌 iFusarium小麥赤霉病菌{Fusarium gramirwarum)、Μ^Μ·
葉病菌(Wternaria. alternaia)、油菜菌核病菌{Sclerotinia sclerotiorum)、菠菜早疫病菌 iAltorimria solani )、玉米圓斑病菌{Helminthosporium carAo/w )、西瓜枯萎病菌{Fusarium oxysporum f. sp. niveum)或者棉花枯萎病菌應 oxysporum f. sp.vasinfectum)由中國農科院植物保護研究所土傳病害實驗室提供，由淮海工學院海洋學院實驗室保存。I. 2 培養基
植物病原真菌活化及抑菌試驗培養基PDA培養基。樣品的富集和放線菌分離培養基海水高氏一號液體培養基。淀粉培養基可溶性淀粉2g、酵母粉O. 5g、蛋白胨O. 5g、瓊脂2g，海水100ml。I. 3海洋放線菌的分離與純化
從連云港海域的連島、高公島等地采集海水、海泥、近海土樣、海洋動、植物樣品，25°C,180r/min富集振蕩培養5d。采用稀釋平板分離法分離放線菌，三區劃線純化后轉接到高氏一號斜面培養基上。1.4海洋放線菌對植物病原真菌菌絲生長的抑制作用
采用平板對峙法。取直徑5mm植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周對稱位置，距離平皿邊緣15_處劃線接種分離到的海洋放線菌不同菌株，25°C倒置恒溫培養，觀察真菌菌絲生長情況，5d后測量抑菌帶寬度。以不接放線菌對照，3次重復。1.5放線菌無菌發酵液對真菌的抑制作用
無菌發酵液的制備有抑菌活性的放線菌不同菌株培養5d，用5ml無菌水洗下菌苔，搖勻制成菌懸液，取3ml菌懸液接種到裝有60ml高氏一號培養液的250ml三角瓶中，25°C, 180r/min振蕩培養5d,培養液于4°C, 5000r/min條件下離心IOmin,上清液用孔徑為
0.22um的細菌過濾器過濾，即得到不同海洋放線菌菌株的無菌發酵液。無菌發酵液對真菌的抑制作用用打孔器打取直徑為5mm真菌菌苔并倒扣接在PDA平板中央，距皿邊緣15mm處，四周對稱放置直徑為5mm的牛津杯，每個牛津杯內加入250 u I放線菌不同菌株的無菌發酵液，以等量的高氏I號液體培養基為對照，25°C恒溫培養4d，測定抑菌帶寬度，每處理重復3次。1.6無菌發酵液對菠菜早疫病菌分生孢子萌發的抑制作用
用5mL無菌水洗下培養5 d的菠菜早疫病菌的菌落，用4層無菌紗布過濾除去菌絲，濾液在室溫，4000 r/min下離心IOmin，沉淀即為分生孢子，用制備好的放線菌無菌發酵液配制孢子懸浮液，濃度為IO6個孢子/mL，取20 y L孢子懸浮液滴加在無菌載玻片上，置于鋪有濕潤濾紙的培養皿內，28 °C下恒溫保濕培養，分別于2，4，6，8，IOh觀察菠菜早疫病菌的孢子萌發和芽管伸長情況。I. 6抗菌海洋放線菌的種類鑒定
1.6. I形態學觀察
采用插片法。具有較強抑菌作用的海洋放線菌劃線接種到高氏一號培養基平板上，將滅菌的蓋玻片以45°角插入劃線接種部位的培養基內，28°C條件下分別于培養4、6、8d取出蓋玻片，觀察放線菌菌絲及孢子絲形態特征。1.6. 2生理生化試驗
使用生化鑒定管，對分離得到的抑菌活性強的放線菌菌株，按照文獻的方法測定生理生化特性。I. 6. 3放線菌16SrDNA序列分析
放線菌基因組DNA的提取采用CTAB裂解法[17]。 擴增引物為細菌通用引物，正向引物為 27f :5 ' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3 '，反向引物為 1492R 5' -ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT -3'，由上海生エ生物技術有限公司合成。PCR擴增條件為94°C預變性4min，94°C變性50s，52°C退火50s，72°C延伸lmin30s，循環數35，72°C延伸lOmin。PCR產物經I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化，送上海生エ生物工程技術有限公司測序，得到的16SrDNA序列輸入NCBI數據庫，應用BLAST與數據庫中已有的放線菌16S rDNA序列進行相似性比較分析，采用DNAStar與Mega軟件進行序列的比較及系統發育樹分析。2結果與分析
2.I抗菌海洋放線菌的分離篩選結果
從采集的17個樣品中分離得到22株海洋放線菌，有9個菌株對供試的植物病原真菌具有較強的抑菌活性。其中Zw-I菌株的抑制活性最強，該菌株對供試的8種植物病原真菌均具有較強的抑制作用，菌株的抑菌帶寬度均在8mm以上，結果見表I。表I Zw-I菌株及其發酵液對8種植物病原真菌的抗菌作用
權利要求
1.一種梅久蘭鏈霉菌 ZW-1 (Streptomyces mediolani strain zw_l)及其發酵液的抑菌用途，所抑的菌為小麥雪腐鐮刀菌(Fusarium nivale)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、斑點落葉病菌(Alternaria. alternata)、油菜菌核病菌(SclerotiniascIerotiorum)、菠菜早疫病菌(Alternaria soIani)、玉米圓斑病菌(Helminthosporiumcarbonum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)或者棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的梅久蘭鏈霉菌ZW-I是通過以下方法分離得到 (1)分離純化從連云港海域的連島、高公島采集海水、海泥、近海土樣、海洋動、植物樣品，25°C，180r/min富集振蕩培養5d ;采用稀釋平板分離法分離放線菌，三區劃線純化后轉接到高氏一號斜面培養基上； (2)菌株的篩選采用平板對峙法，取直徑5_植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周對稱位置，距離平皿邊緣15_處劃線接種分離到的海洋放線菌不同菌株，25°C倒置恒溫培養，觀察真菌菌絲生長情況，5d后測量抑菌帶寬度，每個菌株為一處理，以不接放線菌對照，重復3次；選取一株對所述的8種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于8_、發酵液的抑菌帶寬度高于5mm的菌株，記為ZW-I菌株； (3)菌株的鑒定采用插片法，將ZW-I菌株劃線接種到高氏一號培養基平板上，將滅菌的蓋玻片以45°角插入劃線接種部位的培養基內，28°C條件下分別于培養4、6、8d取出蓋玻片，觀察菌絲及孢子絲形態特征；同時進行生理生化試驗，并進行16S rDNA測序分析；根據形態學和生理生化試驗結果初步認為菌株ZW-I屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)；16SrDNA的同源性分析表明，ZW-1菌株最接近于Streptomyces mediolani, 二者的16SrDNA序列相似性為99 %, ZW-1菌株鑒定為梅久蘭鏈霉菌(Streptomyces mediolani)。
全文摘要
本發明是一種梅久蘭鏈霉菌ZW-1菌株及其發酵液的抑菌用途，所抑的菌為小麥雪腐鐮刀菌、小麥赤霉病菌、斑點落葉病菌、油菜菌核病菌、菠菜早疫病菌、玉米圓斑病菌、西瓜枯萎病菌或者棉花枯萎病菌。本發明梅久蘭鏈霉菌ZW-1及其發酵液可抑制植物病原真菌菌絲的生長，導致病原真菌菌絲細胞壁膨大，原生質體濃縮，并可抑制菠菜早疫病菌分生孢子的萌發和芽管的伸長，抑菌效果好，具有良好植物病害生物防治的開發應用前景。
文檔編號C12N1/02GK102835423SQ20121026899
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月1日 優先權日2012年8月1日
發明者馬桂珍, 暴增海, 王淑芳, 吳少杰, 付泓潤, 葛平華 申請人:淮海工學院