專利名稱：一株膠霉菌素生產菌株及應用該菌株生產膠霉菌素的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，提供了一株高產膠霉菌素的微生物菌株，特別涉及一株綠色木霉及利用該菌株生產膠霉菌素的方法。
背景技術：
膠霉菌素是環縮二氨酸(Diketopiperazines)類物質中第一個被鑒定出來的物質。Weidling and Emerson (1936)首次將這種物質從 Trichoderma Iignorum 中分出來,后來Weidling將這·種物質定義為膠霉菌素,又稱膠霉毒素(gliotoxin)。1958年由Bell等人鑒定出膠霉菌素的結構。Jacobus D M等在1979年研究了膠霉菌素的代謝途徑，且發現先由肽合成酶(gliP)催化絲氨酸與苯丙氨酸生成環狀產物，接下來經過硫氧還蛋白還原酶(gliT)的硫化和氧化作用，最終經鄰-甲基轉移酶(gliM)和甲基轉移酶(gliN)的甲基化形成膠霉菌素，但是國內外一直沒有找到誘導膠霉菌素高產的方法，嚴重阻礙了膠霉菌素的研究。膠霉菌素可以抑制機體的免疫應答，包括巨噬細胞吞噬和殺菌活性，T細胞增殖等，在發現之初，主要用于癌癥的治療。近年來浙江大學發現膠霉菌素對水稻紋枯病具有明顯的殺滅作用，經該課題組深入研究，發現膠霉菌素對土傳病害具有明顯的滅殺、抑制作用，首次將膠霉菌素應用于土傳病害的防治。專利CN97193552. I 公開了一株利用 Dichotomomyces cejpii FERM BP-5738。菌株生產乙酰膠霉毒素的方法以及乙酰膠霉毒素的取代方法，但報道的乙酰膠霉毒素的收率僅為 lOppm。專利 CN97193552. I 報道的菌株 Dichotomomyces cejpii FERM BP-5738 很具有代表性，一直沒有找到膠霉菌素的高產菌株，膠霉菌素培養的誘導方法也很少報道。從文獻報道來看，膠霉菌素收率依然較低、生產成本偏高嚴重限制了其大規模應用。在對膠霉菌素理化性質研究方面，文獻報道膠霉菌素具有熱不穩定性，不利于制劑加工。因此，長期以來，對膠霉菌素的開發僅限于實驗室中。

發明內容
本發明針對上述技術存在的不足,提供一種利用綠色木霉(Trichoderma viride)通過液體發酵生產膠霉菌素的方法，利用該方法生產的膠霉菌素為胞內代謝產物，且收率較現有文獻報道提高了數倍，所采用的菌株代碼為JBSH-002，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo. 5611 ;該菌株可應用于生產膠霉菌素，該方法發酵所得膠霉菌素收率可達O. 5mg/mL以上。本發明提供的具體技術方案是首先獲得了一株新的綠色木霉(Trichoderma viride)菌株,該菌株的保藏號為CGMCC No. 5611，其具體獲得方法如下(I)全國各菌種保藏中心的木霉以及浙江、山東、云南、陜西部分地區采集的天然綠色木霉(Trichoderma viride)菌株作為起始菌種建立菌種庫；
(2)以ro培養基為基礎培養基，各菌株分別培養10天，檢測膠霉菌素含量，根據能否檢測到膠霉菌素進行一級篩分，篩選了 29個菌株，然后根據膠霉菌素產生量篩選其中的2株產量最高的菌株作為馴化菌株；(3)對2株待選菌進行比較深入的生理生化特性、遺傳穩定性、抑菌性能等研究，最終篩選出一株抑菌能力強、易于培養并具有穩定的傳代特性的菌株，將其初步命名為JBSH-02 ；(4)以該菌株為出發菌株，采用常規誘變方法，如UV，DMS，麗S，NTG等，結合低能離子注入法，反復多次誘變，復篩，最終獲得了高產菌株JBSH-002 ；發明人對該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心進行了生物保藏，保藏編號為CGMCC No. 5611，經檢測其為存活狀態。
上述高產膠霉菌素的菌株，其在PDA平板培養基上的形態特征如下菌絲纖細無色，具分隔，多分枝。分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，對生或互生，一般有2-3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多為球形，孢壁具小疣突，綠色。在PDA培養基上菌落初為白絮狀，后為暗綠色。發明人同時對其進行了 16S rDNA測序，其基因序列如Seq ID No:l所示，該序列為菌株JBSH-002的16S rDNA的全序列。所測得的16S rDNA序列進行BLSTN比對，比對結果顯示，菌株JBSH-002的16SrDNA的核苷酸序列與木霉屬(Trichoderma sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，與其中明確標記為綠色木霉(Trichoderma viride)的5株菌株有100%的同源性，因而進一步確定本發明所提供的菌株為一株綠色木霉(Trichoderma viride)菌株。本發明的另一個目的是，提供利用綠色木霉(Trichoderma viride)菌株JBSH-002生產膠霉菌素的方法。本發明所獲得的菌株，可以應用于日常的生產當中，特別是可以應用于膠霉菌素的生產，具體步驟主要包括綠色木霉菌菌絲體的發酵制備以及膠霉菌素的提取分離和純化步驟，其中在綠色木霉菌菌絲體的發酵制備中應用膠霉菌素產生和積累誘導工序，所述的膠霉菌素產生和積累誘導工序具體步驟如下A.誘導因子篩選從膠霉菌素的前體、生長因子、酶系的調控方面篩選誘導因子，誘導因子選自含特定金屬離子的鹽或綠色木霉生長因子或膠霉菌素前體；B.誘導因子使用方法金屬離子和綠色木霉生長因子添加入培養基中用于調控菌絲體細胞內酶系；在培養過程中通過補加、流加的方式補充膠霉菌素的前體；C.發酵控制首先要用普通碳源使菌體生長，進入生產期后再陸續補加惰性碳源，通過不斷補料把菌體維持在半饑餓狀態，從而加速膠霉菌素的合成。其中所述的特定金屬離子選自含鈣離子或鎂離子或銅離子或鋅離子或鈷離子或鑰離子中的一種或幾種鹽的混合物；綠色木霉生長因子選自生物素或葉酸；膠霉菌素前體選自絲氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸或蘇氨酸或谷胱甘肽中的一種或幾種混合物；所述的惰性碳源，即緩效碳源，選自甘油、乙酸乙酯、豆油、乳糖中的一種或幾種的混合物；所述的普通碳源，包括速效碳源，為本領域常用碳源，如葡萄糖、蔗糖、淀粉等。之所以選擇上述的物質作為誘導因子，主要是由于膠霉菌素是一種環縮二氨酸類物質，它的前體物質主要是絲氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸以及含二硫鍵物質，發明人經過研究后發現針對本發明所述的菌株而言，要使其產生膠霉菌素，誘導調控的方法主要通過三種方式1、補充前體，如絲氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷胱甘肽等，從而在氨基酸來源上直接給予菌體補充；2、補充生物生長必須的營養因子，如生物素、葉酸等；3、補充菌體中各種酶系的輔酶離子，主要選擇自特定金屬離子，一般可以采用其可溶性金屬鹽的形式，發明人發現通過上述三種方式的誘導，結合對于發酵過程的參數條件控制，可以實現膠霉菌素產量的提聞。具體的生產步驟如下
(I)綠色木霉菌菌絲體的發酵制備A.菌種活化；B.液體種子制備；C.發酵菌種活化后，經液體發酵擴繁種子液，再利用液體深層發酵方法生產得到綠色木霉菌絲體；其中發酵過程具體為將液體種子以2_10v/v%的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48-96h，補加O. 5-lw/v%的惰性碳源以及O. 05-0. 2w/v%的前體，然后每隔48h，補充O. 5-lw/v%的惰性碳源，總共培養120-240h ；(2)膠霉菌素的提取分離和純化A.干燥粉碎將上述發酵的菌絲體經固液分離后，菌絲體進行低溫干燥、粉碎，得到綠色木霉菌絲粉；B.有機溶劑提取綠色木霉菌絲粉加入5-20 (w/w)倍質量的有機溶劑提取，提取溫度0_80°C，提取時間O. 5-2h，提取次數1-4次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品。C.膠霉菌素的純化 將膠霉菌素粗品用5-20倍的結晶溶劑復溶，冷卻到10°C以下結晶，重復2-6次，得到膠霉菌素純品。其中所述提取過程所用的有機溶劑為乙酸乙酯、乙醇、丙酮、苯、甲苯中的一種或幾種的混合物；所述純化過程所用的結晶溶劑為甲醇、乙醇、丙酮其中的一種或幾種的混合物，結晶過程的溫度控制為_50°C -I(TC。更為具體的過程如下(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C _25°C)活化 4h-8h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌液體培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，振蕩培養24-48h制備得到種子液；(3)發酵、誘導過程在發酵培養基中添加占培養基總重量O. 01-0. 05%的含特定金屬離子的鹽，如鈣離子或鎂離子或銅離子或鋅離子或鈷離子或鑰離子中的一種或幾種的混合物，及占培養基總重量O. 005-0. 02%的生長因子，如生物素或葉酸或其混合物，將液體種子以2-10% (v/v)的接種量在無菌條件下接到已滅菌的發酵培養基中，26°C培養48-96h，補加O. 5-l%(w/v)的惰性碳源，如甘油或乙酸乙酯或豆油或乳糖中的一種或幾種的混合物，以及O. 05-0. 2% (w/v)的前體，如絲氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸或蘇氨酸或谷胱甘肽中的一種或幾種的混合物，然后每隔48h，補充O. 5-1% (w/v)的惰性碳源，總共培養120-240h即可獲得綠色木霉菌絲。更具體的，可以取制備好的液體種子以5%_10% (v/v)的接種量接種于滅菌的發酵培養基中，液體發酵制備即可獲得綠色木霉菌絲；(4)干燥粉碎將發酵完成的菌絲經固液分離后，菌絲體在低于60°C的溫度下烘干，粉碎后過80目篩，得到膠霉菌素菌絲粉；(5)膠霉菌素的提取綠色木霉菌絲粉加入5-20 (w/w)倍質量的有機溶劑提取，提取溫度10-80°C，提取時間O. 5-2h，提取次數1-3次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品；
·
(6)膠霉菌素的純化將膠霉菌素粗品用5-20倍的結晶溶劑復溶，冷卻到_50-10°C結晶，重復2_4次，得到膠霉菌素樣品。其中菌株產膠霉菌素條件的確定，其方法如下(I)采用單因子試驗和正交試驗，通過改變溫度、初始pH值、接種量、裝料量和培養時間，確定液體種子最佳培養條件和液體發酵最佳培養條件；(2)采用單因子試驗和正交試驗，通過改變培養的碳氮源和無機鹽組成確定該菌株液體種子最佳培養基組成和液體發酵的最佳培養基組成。經過上述單因子試驗和正交試驗所獲得菌株、液體種子培養基組成及發酵條件如下液體種子培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2% 4%，酵母浸粉O. 2% 1%，硫酸鎂 O. 02-0. 1%，磷酸二氫鉀 O. 01-0. 05%,加水至 IOOOmL ；液體種子培養條件接種量為每個三角瓶接種I只菌株斜面培養物，PH值自然，培養溫度24°C 28°C，搖床轉速75r/min-200r/min，培養時間為24 48h ；經過上述單因子試驗和正交試驗所獲得菌株液體發酵培養基組成和發酵條件如下液體培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2% 4%，酵母浸粉O. 2% 1%，玉米粉1-4% ;土豆汁 1-4% ;硫酸鎂 O. 02-0. 1%，磷酸二氫鉀 O. 01-0. 05%，硫酸鋅 O. 001-0. 005%,加水至 IOOOmL ；液體發酵條件接種量為5%-10%(v/w)，pH值自然，培養溫度24°C 28°C，搖床轉速 75r/min-200r/min，培養時間為 120 240h ；干燥粉碎將發酵完成的發酵液經固液分離后，將菌絲體在低于60°C的溫度下烘干，粉碎后過80目篩，得到用于膠霉菌素提取的菌絲粉；膠霉菌素的提取綠色木霉菌絲粉中加入5-20 (w/w)倍質量的有機溶劑提取，提取溫度10-80°C，提取時間O. 5-2h，提取次數1-4次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品；膠霉菌素的純化
將膠霉菌素粗品用5-20倍的結晶溶劑復溶，冷卻到-50°C _10°C結晶，重復2_4次，得到膠霉菌素純品；經過上述提取和純化過程所得膠霉菌素產品外觀為白色或淺黃色結晶或粉末，可溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二甲亞砜，不溶于水以及石油醚。經硅膠薄層層析，證明為膠霉菌素(如附圖I所示)，用HPLC方法檢測，色譜峰為單一對稱峰，含量為91. 32%(如附圖2和3所示)。經LC-MS液質聯用分析(如附圖4所示)，分子量為327。該膠霉菌素在pH7_12范圍內穩定，100°C處理20min，殺菌活性不變。利用上述綠色木霉菌株液體發酵產生的膠霉菌素屬于胞內代謝產物，提取過程用到的有機溶劑相對較少，且膠霉菌素收率達到發酵液總量的O. 05% (w/v)以上。利用本發明所獲菌株生產膠霉菌素具有以下優點
I、利用該菌株發酵制備膠霉菌素發酵水平達到O. 05%以上，為現有文獻報道的10倍以上；2、該菌株的代謝產物膠霉菌素主要為胞內產物，可以通過有機溶劑提取干燥菌絲粉，得到膠霉菌素，大大減少有機溶劑的使用量，減輕環境壓力，同時也降低生產成本；3、該菌株為綠色木霉，其孢子可以作為微生物菌劑使用，菌絲體可以作為微生物菌肥的載體，也可以作為提取甾醇、甲殼素的原料；提取后的藥奏渣可以作為菌肥使用，整個生產過程沒有固體廢棄物產生，大大提高了木霉發酵液的綜合利用及其附加值，增加了生產的收益。綜上所述，本發明提供了一株膠霉菌素高產菌株及利用該菌株進行液體發酵制備膠霉菌素的方法，該菌株可應用于生產膠霉菌素，該方法發酵所得膠霉菌素收率可達O. 5mg/mL 以上。保藏信息保藏時間2011年12月16日保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心保藏編號CGMCCNo. 5611保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所分類命名綠色木霉(Trichodermaviride)


圖I為本發明所獲得的膠霉菌素薄層層析結果示意圖；圖中I為標準品，2為本發明所獲得的膠霉菌素；圖2為膠霉菌素標準品的液相色譜譜圖；圖3為本發明所獲得的膠霉菌素樣品的液相色譜譜圖；圖2為標準品譜圖，基本無雜峰，說明純度高；圖3為本發明所得樣品，有雜峰，說明純度低，但兩個圖的主峰出峰位置(保留時間)是一致的，說明二者是同一物質，即所得樣品為I父霉囷素；圖4為本發明所獲得的膠霉菌素樣品的質譜圖。
具體實施方式
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍，下述實施例中所采用的菌種均為保藏號為CGMCCNo. 5611的菌種。實施例I(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C -25°C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管 斜面菌種制成菌體懸浮液，無菌條件下沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，PH值自然，培養溫度24°C V，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成(w/w)為按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 2%，硫酸鎂O. 05%，磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發酵、調控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到發酵培養基中，攪拌轉速175r/min, 26°C培養48h,補加發酵液總體積lw/v%的乳糖及O. 05w/v%的苯丙氨酸,然后每隔48h，補充O. 5w/v%的乳糖，總共培養240h ；發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖4%，酵母浸粉1%，玉米粉4% ;土豆汁1% ;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121 °C,O. 15Mpa 滅菌 20min ；(4)干燥粉碎取IOOOmL發酵液，經4000r/min離心10分鐘后，將菌絲體50°C的條件下真空干燥，粉碎并過80目篩，即得綠木霉菌絲粉22g ；(5)膠霉菌素的提取取綠色木霉菌絲粉20g加入200mL 95%的酒精提取，提取溫度60°C，提取時間O. 5h，提取次數2次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品2. 36g ；(6)膠霉菌素的純化將膠霉菌素粗品用5倍質量的乙酸乙酯溶劑復溶，冷卻到-10°c以下結晶，如此重復2次，得到膠霉菌素樣品I. 04g,經HPLC法檢測，含量達到95. 11%。實施例2(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C -25°C)活化 6h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，pH值自然，培養溫度24°C V，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成(w/w)為按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸鎂O. 05%，磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ；(3)發酵、調控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到2L發酵培養基中，26°C培養72h,補加發酵液總體積lw/v%的甘油及O. 05w/v%的苯丙氨酸、絲氨酸混合物,然后每隔48h補充O. 5w/v%的甘油，總共培養168h ；發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖4%，酵母浸粉1%，玉米粉4% ;土豆汁1% ;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 01%,硫酸銅O. 005%,葉酸O. 005%,加水至10OOmT,;滅菌條件為 121。。，O. 15Mpa 滅菌 20min ；
(4)干燥粉碎取2000mL發酵液經4000r/min離心10分鐘后，將菌絲體60°C的條件下真空干燥，粉碎并過80目篩，即得綠木霉菌絲粉46. Sg ；(5)膠霉菌素的提取綠色木霉菌絲粉45g加入450mL丙酮提取，提取溫度40°C，提取時間lh，提取次數2次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品4. 68g ；(6)膠霉菌素的純化將膠霉菌素粗品用5倍的乙酸乙酯溶劑復溶，冷卻到-10°C以下結晶，如此重復2次，得到膠霉菌素樣品3. 04g,經HPLC法檢測，含量達到85. 36%。實施例3(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C -25°C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，pH值自然，培養溫度24°C V，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；·種子培養基組成(w/w)為按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸鎂O. 05%，磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ；(3)發酵、調控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到IL發酵培養基中，26°C培養72h，補加發酵液總體積lw/v%的乙酸乙酯及O. lw/v%的苯丙氨酸、絲氨酸混合物，然后每隔48h補充O. 5w/v%的乙酸乙酯,總共培養168h ；發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉1%，玉米粉2% ;土豆汁1% ;碳酸鈣O. 1%，硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,硫酸銅O. 002%,加水至IOOOmL,生物素 O. 005%,加水至 IOOOmL ；(4)干燥粉碎取IOOOmL發酵液經4000r/min離心10分鐘后，將菌絲體60°C的條件下真空干燥，粉碎并過80目篩，即得綠木霉菌絲粉22. Sg ；(5) I父霉菌素的提取取綠色木霉菌絲粉22. 8g,加入149ml乙酸乙酷提取，提取溫度60°C，提取時間30minh，提取次數2次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品
3.32g ；(6)膠霉菌素的純化將膠霉菌素粗品用5倍的乙醇溶劑復溶，冷卻到-20°C以下結晶，如此重復3次，得到膠霉菌素樣品I. 97g，經HPLC法檢測，含量達到90. 13%。實施例4(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C -25°C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，pH值自然，培養溫度24°C V，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成(w/w)為按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉0.4%，硫酸鎂
O.05%，磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ；(3)發酵、調控過程將液體種子以5% (v/v)的接種量接到發酵培養基中，25°C培養48h，補加發酵液總體積lw/v%的豆油及O. lw/v%的苯丙氨酸、蘇氨酸混合物，然后每隔48h補充Iw/v%的豆油，總共培養240h ；發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 4%，玉米粉2% ;土豆汁1% ;氯化鈣O. 002%,硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,硫酸銅O. 001%,生物素
O.01%,加水至 7000mL ；(4)干燥粉碎發酵液8000mL經4000r/min離心10分鐘后，將菌絲體60°C的條件下真空干燥，粉碎并過80目篩，即得綠木霉菌絲粉218g ；(5) I父霉菌素的提取取綠色木霉菌絲粉218g,加入2180ml乙酸乙酷提取，提取溫度微沸，提取時間60minh，提取次數2次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品23. 26g ；
(6)膠霉菌素的純化將膠霉菌素粗品用5倍的乙醇溶劑復溶，冷卻到-20°C以下結晶，如此重復3次，得到膠霉菌素樣品12. Ig,經HPLC法檢測，含量達到87. 62%。實施例5(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C -25°C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，pH值自然，培養溫度24°C V，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成(w/w)為按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸鎂
O.025%，磷酸二氫鉀O. 05%,加水至IOOOmL ；(3)發酵、調控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到發酵培養基中，25°C培養48h，補加發酵液總體積1% (w/v)的豆油及O. l%(w/v)的酪氨酸、蘇氨酸混合物，然后每隔48h補充發酵液總體積1% (w/v)的豆油，總共培養240h。發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 4%，玉米粉2% ;土豆汁1% ;氯化鈣O. 1%，硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,鑰酸鈉O. 001%,氯化鈷
O.001%,生物素 O. 01%,加水至 7000mL ；(4)干燥粉碎發酵液7000nL經4000rpm離心IOmin后，將菌絲體60°C的條件下真空干燥，粉碎并過80目篩，即得綠木霉菌絲粉228g。(5)|父霉囷素的提取取綠色木霉囷絲粉228g,加入1140mL乙酸乙酷提取，提取溫度60°C，在200r/min攪拌的條件下，提取時間30min，重復2次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品21. 26g。(6)膠霉菌素的純化將膠霉菌素粗品用5倍的乙醇溶劑復溶，冷卻到-20°C以下結晶，如此重復3次，得到膠霉菌素樣品9. 2g，經HPLC法檢測，含量達到91. 62%。
權利要求
1.一株膠霉菌素生產菌株，其保藏號為CGMCC No. 5611。
2.根據權利要求I所述的菌株，其特征在于該菌株為綠色木霉，該菌株的16S核糖體DNA即16S rDNA的基因序列如Seq ID No: I所示。
3.一種利用權利要求I所述菌株生產膠霉菌素的方法，其特征在于主要包括綠色木霉菌菌絲體的發酵制備以及膠霉菌素的提取分離和純化步驟，在綠色木霉菌菌絲體的發酵制備過程中應用膠霉菌素產生和積累誘導技術， 所述的發酵過程膠霉菌素產生和積累誘導技術，具體步驟如下 A.誘導因子篩選 從膠霉菌素的前體、生長因子、酶系的調控方面篩選誘導因子，誘導因子選自含特定金屬離子的鹽或綠色木霉生長因子或膠霉菌素前體； B.誘導因子使用方法 金屬離子和綠色木霉生長因子添加入培養基中用于調控菌絲體細胞內酶系；在培養過程中通過補加、流加的方式補充膠霉菌素的前體； C.發酵控制 首先要用普通碳源使菌體生長，進入生產期后再陸續補加惰性碳源，通過不斷補料把菌體維持在半饑餓狀態，從而加速膠霉菌素的合成。
4.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于所述誘導因子中的特定金屬離子選自含鈣離子或鎂離子或銅離子或鋅離子或鈷離子或鑰離子中的一種或幾種鹽的混合物；綠色木霉生長因子選自生物素或葉酸；膠霉菌素前體選自絲氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸或蘇氨酸或谷胱甘肽中的一種或幾種的混合物；所述的惰性碳源選自甘油、乙酸乙酯、豆油、乳糖中的一種或幾種的混合物。
5.根據權利要求3或4所述制備方法，其特征在于具體步驟如下 (1)綠色木霉菌菌絲體的發酵制備 A.菌種活化； B.液體種子制備； C.發酵菌種活化后，經液體發酵擴繁種子液，再利用液體深層發酵方法生產得到綠色木霉菌絲體； 其中發酵過程具體為將液體種子以2-1(^八％的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48-96h，補加O. 5-lw/v%的惰性碳源以及O. 05-0. 2w/v%的前體，然后每隔48h，補充O. 5-lw/v%的惰性碳源，總共培養120-240h ； (2)膠霉菌素的提取分離和純化 A.干燥粉碎將上述發酵的菌絲體經固液分離后，菌絲體進行低溫干燥、粉碎，得到綠色木霉菌絲粉； B.有機溶劑提取 綠色木霉菌絲粉加入5-20倍質量的有機溶劑提取，提取溫度0-80°C，提取時間O. 5-2h，提取次數1-4次，合并提取液，經濃縮后，得到膠霉菌素粗品； C.膠霉菌素的純化 將膠霉菌素粗品用5-20倍質量的結晶溶劑復溶，冷卻到10°C以下結晶，重復2-6次，得到膠霉菌素純品。
6.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于所述的綠色木霉菌菌絲體的發酵制備具體步驟為將保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下活化4h-8h ;在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，培養溫度24-26°C，搖床轉速200r/min，培養時間為24_48h，制備液體種子；培養開始前，液體發酵培養基中添加占培養基總重量O. 01-0. 05%的含特定金屬離子的鹽，以及占培養基總重量O. 005-0. 02%的生長因子，并將液體種子以2-10v/v%的接種量在無菌操作的條件下接到發酵培養基中，26°C培養48-96h后，補加O. 5-lw/v%的惰性碳源以及O. 05-0. 2w/v%的前體，然后每隔48h，補充O. 5- lw/v%的惰性碳源，總共培養120-240h ； 其中所述的菌種的保藏號為CGMCC No. 5611。
7.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于所述提取過程的有機溶劑為乙酸乙酯、乙醇、丙酮、苯、甲苯中的一種或幾種的混合物。
8.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于所述純化過程的結晶溶劑為甲醇、乙醇、丙酮其中的一種或幾種的混合物。
9.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于結晶過程溫度控制為-50-10°C。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域，提供了一株膠霉菌素(Gliotoxin)高產菌株及利用該菌株進行液體發酵制備膠霉菌素的方法。本發明所涉及的膠霉菌素生產菌株為絲狀真菌，經16SrDNA鑒定為一株綠色木霉(Trichodermaviride)，菌株代碼為JBSH-002，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.5611。該菌株可應用于生產膠霉菌素，該方法發酵所得膠霉菌素收率可達500mg/L以上。
文檔編號C12P17/18GK102839130SQ20121030389
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者楊傳倫, 馬韻升, 史慶苓, 徐澤平, 張心青, 王建平, 周炳, 秦森 申請人:黃河三角洲京博化工研究院有限公司, 山東京博控股股份有限公司