合成d-氨基酸的一種新方法
【專利摘要】本發明公開了一類新的來源于Symbiobacterium?thermophilum的meso-Diaminopimelate?dehydrogenase(STDAPDH)應用于D-氨基酸合成的方法，即將獲得的STDAPDH作為生物催化劑應用于合成D-氨基酸，尤其是D-丙氨酸的合成。該方法與現有的化學方法相比，具有操作簡單、反應條件溫和、對環境友好、高產率、高對映選擇性等優點，本方法有可能應用于D-氨基酸尤其是D-丙氨酸的工業合成。
【專利說明】合成D-氨基酸的一種新方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物催化領域，涉及一種利用生物催化劑D-氨基酸脫氫酶以α -酮酸為底物合成D-氨基酸方法。
【背景技術】
[0002]氨基酸廣泛存在于自然界中，除甘氨酸外，其他氨基酸有D-氨基酸和L-氨基酸兩種異構體，它們在生物體內發揮著不同的生理作用。D-氨基酸約占自然界已發現的400多種氨基酸及其類似物的10%左右，(蔣耀忠，劉桂蘭。D-苯丙氨酸的不對稱合成[J].氨基酸雜志，1988,2: 1-3)。隨著科學研究的深入和各種新藥的開發，人們對D-氨基酸的重要性也有了深入的認識，發現其在生命以及藥物制備中具有L-氨基酸所不能替代的地位，其在醫藥、農藥和食品等領域中的用途也正在被廣泛、迅速的挖掘，D-氨基酸的開發利用已經成為氨基酸產業的一個新熱點。
[0003]在各種D-氨基酸中，D-丙氨酸的應用更是廣泛。在食品添加劑領域，D-丙氨酸與L-天冬氨酸合成天丙二肽(商品名為阿力甜，alitame)，其甜度是蔗糖的2000倍，對熱、PH值穩定，可廣泛用于食品工業、日用化學工業做甜味劑，具有極好的市場前景(Ellis，J.ff.Journal of Chemical Education 1995, 72(8):671-675)。D-丙氨酸可作為殺菌劑精甲霜靈的合成原料之一(趙克健。中國化學藥品大全[M]，第二版。北京:新時代出版社，1999)。丙氨酸在醫藥領域的應用也極為廣泛。在新藥開發中主要應用于以下一些方面:可應用于合成鎮靜藥；孕婦藥，用于預測早產、分娩的診斷劑和治療劑；合成抗核苷藥物，對艾滋病抑制劑有協助作用；合成抗癌藥，用于臨床治療腫瘤和Alzheimer’s疾病；合成艾滋病抑制劑，作為HIV抗體；合成D0TA，用于癌癥的早期診斷；合成抗病毒抑制劑，用作HTLV和HIV病毒的抗體；合成抗真菌藥，在牙膏中摻少許，可預防牙周炎等牙齦疾病；合成哌嗪衍生物，可促使血小板 凝結；合成Tocainid及其衍生物，對心律失調有治療作用；合成酶抑制劑，用于心血管疾病和心臟充血不足的治療；合成四肽類藥，可預防血吸蟲病，將該藥物添加在肥阜中預防效果十分明顯(Meichsner C., Riess G., Kleim J., et al,[P].EP657166,1995 ；Robl J.A., Kronenthal D.R., Goderey J.D., Goderey J.D., et al,[P].EP629627-A2,1994 ；Thompson R.J., Bouwer H.G., Portnoy D.A., et al, [J].InfectImmun,1998,66(8):3552-3561 ；Theodore L.J., Reno J.M., Gustavson L.M., et al, [P].US2003099640-A1, 2003 ；CarceIIer E., Merlos M., Giral M., et al, [J].J.Med.Chem.,1993,36(20):2984-2997 ；Franchini C.，Noja F.C.，Corbo F.，etal, [J].Chirality,1993,5(3):135-142 ；Burnier J.P., Gadek T., Mcdowell R.et al, [P].W09217492-A1,1992 ；Dodge J.A., Hauser K.L., Heiman M.L.et al, [P].W09908699,1999.)。
[0004]合成D-氨基酸有外消旋體拆分法、化學合成法及生物法。目前，工業生產用的最多的還是外消旋體拆分法，但是外消旋體拆分的最高的產率也僅為50%，而近年來生物法，尤其是酶法轉化以其無污染、成本低、產物光學純度高的特點已經顯示出廣闊的市場前景。能夠合成D-氨基酸的酶有很多種，D-氨基酸脫氫酶(D-amino acid dehydrogenaseDAADH EC.1.4.99.1)就是其中一種。但是D-氨基酸脫氫酶在自然界中的存在并非像L-氨基酸脫氫酶一樣廣泛，且大多以膜蛋白的形式存在。在已知的D-氨基酸脫氫酶中，meso-Diaminopimelate dehydrogenase (meso- 二氛基庚二酸脫氧酶，me so-DAPDH,ECl.4.1.16)是賴氨酸合成途徑中的一個關鍵酶，該酶可逆催化天然產物meso-Diaminopimelate D-構型氨基的氧化脫氨。此外該酶在自然界中存在較為普遍。由于該反應是可逆反應，因此理論上來說以相應的酮酸為底物，可以高對映選擇性的合成D-氨基酸。但是目前文獻中報道的meso-DAPDH僅對其天然底物meso-DAP表現出較高的活性。2006年，Vedha-Peters等人通過對來源于谷氨酸棒桿菌的meso-DAPDH進行定向進化，將其對丙酮酸的活力提高了 13倍，盡管如此，其比活僅為0.12U/mg,且ee值僅為77 %.(Vedha-Peter, K.M., et al, [J] J.Am.Chem.Soc., 2006,128 (33):10923-10929.)
[0005]
【權利要求】
1.一種用生物催化劑合成光學純度> 98% D-氨基酸的方法，包括:α -酮酸或其衍生物與氨基化合物作為底物與溶劑、助溶劑構成的反應體系；加入生物催化劑和輔酶循環體系進行催化還原胺化反應，反應溫度20~60°C，反應pH值為6~11，反應時間4~72小時，制得光學純度> 98% D-氨基酸。
2.如權利要求1所述生物催化劑合成光學純度>98% D氨基酸的方法，其特征在于，所述的D-氨基酸是:D-丙氨酸或其他D-氨基酸。
3.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，生物催化劑為來源于Symbiobacterium thermophilum的meso-二氨基庚二酸脫氫酶或者是與其氨基酸序列相似度不低于80%酶。
4.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的底物為α-酮酸或其衍生物α-酮酸酯等，特別是α-丙酮酸或其衍生物α-丙酮酸酯等。
5.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法其特征在于，每升反應體系底物的用量為3g~900g。
6.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的溶劑為水或各種緩沖溶液，如:磷酸鹽緩沖體系、碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖體系、Tr1-HCl緩沖體系、硼酸鹽緩沖體系、檸檬酸鹽緩沖體系；根據底物不同，助溶劑為二甲基亞砜，N, N- 二甲基甲酰胺，二氧六環，甲醇，乙醇，正丙醇，異丙醇，乙腈，四氫呋喃，正己烷，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，吡啶，甲苯中的一種或多種。
7.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的生物催化劑包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH或NADP+)，來源于Symbiobacterium thermophilum 的 meso-Diaminopimelate dehydrogenase(STDAPDH),葡萄糖脫氫酶(GDH)，或者是兩種酶各自或者共同表達的基因工程菌。
8.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，每升反應體系中生物催化劑的用量為0.1g~100g。
9.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的反應溫度為20°C~60°C，最適反應溫度為37°C。
10.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的反應pH值為6~11，起始最適pH值為9.0。
11.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，其特征在于，所述的反應不僅適用于除了丙酮酸及其衍生物外，也適用于其他種類的a-酮酸或其衍生物，合成其他種類的氨基酸。
12.如權利要求1和2所述生物催化劑合成光學純度>98% D-氨基酸的方法，所述的反應中的氨基底物可以是銨鹽也可以是氨水。
13.本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的技術思想，均屬于本發明權利要 求所定義的范圍。
【文檔編號】C12P13/04GK103667380SQ201210334554
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月12日 優先權日:2012年9月12日
【發明者】朱敦明, 吳洽慶, 陳曦, 高秀珍, 劉衛東, 馮進輝 申請人:天津工業生物技術研究所