專利名稱：抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗技術領域，具體涉及一種抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑。
背景技術：
亮氨酸氨基肽酶(Leucineaminopeptidase, LAP, EC 3. 4. 11. I)是一種蛋白分解酶，能水解肽鏈N端并由亮氨酸與其他氨基酸形成肽鍵的酶，廣泛分布于肝、胰、腎等組織中。當人體肝、膽、胰等組織有病變時，均可出現血清LAP水平升高。測定血清亮氨酸氨基轉肽酶可作為肝病診斷的又一項指標，對淤膽性肝炎的鑒別診斷、肝道梗阻及胰腺癌的診斷有價值。LAP不像其他肝功的酶，只能檢測血液樣本，LAP還可以檢測尿液。在一些病例中可以檢測尿液中LAP的變化，而不必采血。其肝癌的檢出陽性率較ADA (腺苷脫氨酶)高， 比GGT (谷酰轉肽酶)反映肝臟疾病更加靈敏。LAP的檢測也可早期反映腎損害的性質和程度，并為臨床鑒別腎小球、腎小管損傷提供可能的幫助；其亦可作為妊娠合并ICP及孕婦和胎兒健康情況動態監測的一項有效指標。目前，LAP的檢測方法是樣本中的LAP經催化水解底物L-亮氨-P-硝基苯胺，生成亮氨酸和對硝基苯胺，反應系統在405nm處吸光度上升，通過檢測其上升的速率即可得出樣本中LAP的活性。而在日常工作中，為縮短樣本周轉時間和防止儀器樣品針被堵，不少醫院使用肝素鋰或肝素鈉抗凝管采集常規生化項目血樣本。由于肝素在LAP催化反應過程中起類似加速劑的作用，使得檢測結果假性增高，所以實驗室測定LAP濃度只能用血清，而肝癌肝硬化患者分離血清需要時間長，不能滿足臨床對檢驗結果的快速回報要求，這給實驗室及臨床工作帶來許多不便。

發明內容
本發明針對現有技術的上述不足，提供一種具有良好的抗肝素干擾性能和良好的穩定性，能完全滿足臨床檢驗要求的抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑。為了解決上述問題，本發明采用的技術方案為一種抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，該試劑由試劑I和試劑2組成，其中試劑I、試劑2中的各組分及組分濃度范圍為試劑I :緩沖液(ρΗ7·0-8. 5) 50-500 mmol/L抗干擾劑1-100 ml/L防腐劑O. 1-100 g/L ；試劑2:緩沖液(pH 3. 0-6. O) 50-500 mmol/'LL_亮氨酰-礦硝酰基苯胺 1-100 mmol/L穩定劑1-100 g/L
防腐劑O. 1-100 g/L ο本發明上述的試劑可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液體試劑，直接使用；上述試劑的配置均采用行業常規技術。其中所述緩沖液可以是磷酸緩沖液、三羥甲基氨基緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、N-2-羥乙基哌嗪一 N’ -2-乙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲氨基-2-羥基丙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸緩沖液、哌嗪-N，N-雙(2-羥基乙烷磺酸)緩沖液、3-嗎啉-2-羥基丙磺酸鈉緩沖液、3-(N-嗎啡啉)乙磺酸鈉緩沖液、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-2-羥基丙磺酸緩沖液、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-4-丁磺酸緩沖液、3-雙(2-羥乙基)氨基-2-羥基丙磺酸緩沖液、3-(環己胺)-2-羥基-I-丙磺酸緩沖液、4- (2-羥乙基)-I-哌嗪丙磺酸緩沖液、3-(環己胺)-1_丙磺酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸緩沖液，檸檬酸一檸檬酸三鈉緩沖液、咪唑緩沖液、醋酸一醋酸鈉緩沖液，2-嗎啉乙磺酸緩沖液中的一種或幾種。所述防腐劑選白山梨酸鉀、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉、疊氮鈉、proc I in系列防腐劑(如Proclin300)中的一種或幾種。
所述穩定劑選自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA(牛血清白蛋白)中的一種或者幾種。所述的抗干擾劑，優選非離子表面活性劑，為更優選地，所述非離子表面活性劑選白 TffEEN 系列(如 Tween2O)、SPAN 系列(如 Span-80)、TRITON 系列(如 TritonX-100)中的一種。本發明的突出實質性特點及顯著進步主要表現在(I)本發明的試劑為雙試劑，通過試劑I中的抗干擾劑先將樣本中的肝素干擾效應去除，再加入試劑2進行反應，因此本發明試劑具有良好的抗肝素干擾性能。(2)本發明的試劑通過加入選定的穩定劑，使得試劑具有良好的穩定性本發明試劑盒2-8°C避光保存至少穩定12個月，能完全滿足臨床檢驗要求。
具體實施例方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明作出許多修改，這樣的修改也落入本發明的范圍。下述試劑的配置方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。實施例I :試劑I :三羥甲基氨基緩沖液(pH 7.0) 50mmol/LTween 205ml/L疊氮鈉0· I g/L ；
試劑2 2-嗎啉乙磺酸緩沖液(pH 4· O) IOOmmoI/LL-売氛酸-p-硝酸基苯胺2mmol/L蔗糖5g/L疊氮鈉O. I g/L。試劑I和試劑2可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液體試齊U，直接使用；實施例2 試劑I :
N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸緩沖液(pH 8.0) IOOmmoI/LSpan-8010ml/L山梨酸鉀I g/L ；試劑2 醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3.0) IOOmmoI/LL-亮氨酰-p-硝酰基苯胺5mmol/LBSA2g/L疊氮鈉O. I g/L。試劑I和試劑2可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液體試齊U，直接使用；實施例3 試劑I :N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -4- 丁磺酸緩沖液(pH 8. 5) 500mmol/LTriton X-10020ml/LProclin300lg/L ；試劑2 咪唑緩沖液(pH6. 0) lOOmmol/LL_売氛酸-p-硝酸基苯胺 20mmol/L山梨醇5g/LProclin300 0. lg/L。試劑I和試劑2可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液體試齊U，直接使用；本發明試劑盒測定樣本中的LAP的測試條件如下溫度30-37°C ；比色杯光徑為I. 0cm。檢測主波長405nm。應用本發明LAP測定試劑盒測定樣本中LAP的方法如下樣品(校準管以校準品做樣品)加Rl混勻，30-37°C孵育3-5min后，立即加入R2混勻，30-37°C反應2min后，連續檢測3min，計算ΛΑ/min。其中樣本用量15μ 1，試劑I用量240 μ 1，試劑2用量60 μ I。本發明試劑盒測定樣本中LAP含量按以下公式進行計算
權利要求
1.一種抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，其特征在于該試劑由試劑I和試劑2組成，其中試劑I、試劑2中的各組分及組分濃度范圍為 試劑I : 緩沖液(pH 7. 0 8. 5) 50-500mmol/L 抗干擾劑l-100ml/L 防腐劑0. l-100g/L ； 試劑2 緩沖液(pH 3. 0-6.0) 50-500 mmol/L L-亮氨酰■硝酰基苯胺 1-100 mmol/L 穩定劑1-100 g/L 防腐劑0. 1-100 g/L。
2.根據權利要求I所述的抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，其特征在于所述的抗干擾劑為非離子表面活性剤。
3.根據權利要求2所述的抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，其特征在于所述的非離子表面活性劑為TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中的ー種。
4.根據權利要求I所述的抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，其特征在于所述緩沖液為磷酸緩沖液、三羥甲基氨基緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、N-2-羥こ基哌嗪-N’ -2-こ磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲氨基-2-羥基丙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基こ磺酸緩沖液、哌嗪-N，N-雙(2-羥基こ烷磺酸)緩沖液、3-嗎啉-2-羥基丙磺酸鈉緩沖液、3-(N-嗎啡啉)こ磺酸鈉緩沖液、4- (2-羥こ基)哌嗪-1-2-羥基丙磺酸緩沖液、N-(2-羥こ基)哌嗪-N’ -4- 丁磺酸緩沖液、3-雙(2-羥こ基)氨基-2-羥基丙磺酸緩沖液、3-(環己胺)-2-羥基-I-丙磺酸緩沖液、4-(2-羥こ基)-1-哌嗪丙磺酸緩沖液、3_(環己胺)-1_丙磺酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸緩沖液，檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液、咪唑緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液，2-嗎啉こ磺酸緩沖液中的ー種或幾種。
5.根據權利要求I所述的抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，其特征在于所述防腐劑為山梨酸鉀、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉、疊氮鈉、proclin系列防腐劑中的ー種或幾種。
6.根據權利要求I所述的抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，其特征在于所述穩定劑為聚こニ醇、丙三醇、丙ニ醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一種或者幾種。
全文摘要
本發明公開一種抗肝素干擾的亮氨酸氨基肽酶測定試劑，該試劑由試劑1和試劑2組成，其中試劑1、試劑2中的各組分及組分濃度范圍為試劑1緩沖液(pH 7.0~8.5)50-500mmol/L，抗干擾劑1-100ml/L，防腐劑0.1-100g/L；試劑2緩沖液(pH 3.0-6.0)50-500mmol/L，L-亮氨酰-p-硝酰基苯胺1-100mmol/L，穩定劑1-100g/L，防腐劑0.1-100g/L。本發明具有良好的抗肝素干擾性能和良好的穩定性，能完全滿足臨床檢驗要求的優點。
文檔編號C12Q1/37GK102864206SQ20121033511
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者鄒炳德, 鄒繼華, 沃燕波 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司