專利名稱：一種堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法
技術領域：
本發明涉及燃料乙醇的制備工藝，具體涉及一種堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法。
背景技術：
隨著全球資源、能源、環境問題的突出和全球氣候變暖趨勢的加強，尋找清潔、可再生能源成為人類的必由之路，其中燃料乙醇憑借獨特的優勢成為首選。由于糧食乙醇的發展受到土地、農業生產、糧食供給和社會經濟等各方面的制約，利用豐富的木材、禾草等植物纖維原料，尤其是廉價的農林廢棄物經生物轉化制取燃料乙醇，即纖維素乙醇，成為解決能源和環境問題的有效途徑之一，是當前世界各國研究和開發的熱點。
作為人均石油資源相對匱乏的發展中國家，我國對纖維素乙醇的需要更為迫切。我國汽油年消耗量已超過6000萬噸，按照10%的添加配額需要燃料乙醇600萬噸以上，而現有產能僅100余萬噸，市場缺口較大；根據《可再生能源中長期發展規劃》，至2020年我國可再生能源開發量在能源供應結構中的比重將提高到15%左右，其中燃料乙醇的年需要量達到2000萬噸，且新增產能主要來源于纖維素乙醇。由此可見，我國纖維素乙醇的市場需求巨大，發展纖維素乙醇產業十分緊迫。與此同時，我國具有豐富的植物纖維原料，其中僅農作物秸桿的年產量就達7億噸，并且產地相對集中，易于收集和運輸。利用廉價的農林廢棄物制取燃料乙醇，不僅可以變廢為寶，代替糧食生產清潔燃料，為解決農村秸桿焚燒所造成的環境污染提供一條新的途徑，更為重要的是能夠構建出一條基于農林廢棄物高值生物利用的新型產業鏈，為優化我國能源結構、發展農村經濟、提高農民收入和促進經濟的可持續發展提供技術支撐。因此，研究開發基于植物纖維原料，尤其是廉價農作物秸桿原料的纖維素乙醇生產技術具有重大的理論指導和現實意義。天然植物纖維原料中，可利用的糖類物質主要是纖維素和半纖維素，它們和木質素之間相互粘合形成緊密的交聯結構，必須經過適當的預處理和酶水解后它們可被轉化成可發酵性的包括己糖和戊糖在內的單糖，單糖再經酵母發酵即可生成乙醇。原料預處理、纖維素酶水解和水解糖液的高效乙醇發酵是制備纖維素乙醇的三個關鍵工藝步驟。植物纖維原料的預處理方法主要有物理法、化學法、生物法及聯合法，其中化學法是目前最接近產業化的預處理方法。化學法是利用酸、堿、有機溶液或其它試劑對植物纖維原料進行處理，以除去部分半纖維素和木質素，進而破壞纖維素的結晶結構以增加纖維素的孔隙度及比表面積，提高纖維素酶的可及度和酶解得率。現有的酸、堿和有機溶劑等預處理工藝仍然未能擺脫高化學品消耗和高能耗的弊端，廢水處理的壓力大。植物纖維原料中纖維素和半纖維素經預處理和酶水解后可轉變成以葡萄糖和戊糖為主的單糖類。戊糖是植物纖維原料第二大糖類物質，尤其是在農作物秸桿中木聚糖占可利用糖類的25 30%，所產乙醇可占原料總糖所產乙醇的25%左右，因此木糖的高效乙醇發酵是提高植物纖維原料利用效率、降低纖維素乙醇生產成本的關鍵環節之一。自然界能夠發酵葡萄糖產乙醇的微生物菌種較多，其中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)對高濃度糖和乙醇的耐受能力強，工業生產技術十分成熟，但由于它們缺乏戊糖的相關代謝途徑，所以不能直接利用戊糖。與之相比，僅有少數幾個天然菌種能夠發酵戊糖產乙醇，如休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)和畢赤樹干酵母(Pichia stipitis)等,但是這些菌種發酵戊糖都需要精確的限制性供氧措施，并且對戊糖的利用受葡萄糖的強烈抑制，對高糖、抑制物和乙醇的耐受能力也較差，因而在工業化生產中的調控難度大，乙醇產率低，生產成本高，還難以投入大規模商業化發酵。目前研究較多的混合糖液發酵技術主要包括以下幾種
I、己糖戍糖共發酵。具體過程為預處理的植物纖維原料在底物濃度5-15% (w/v)下進行酶水解，水解結束后固液分離，上清糖液直接或濃縮到一定糖濃度，同時利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤樹干酵母(Pichia stipitis)或單獨利用樹干畢赤酵母進行發酵制取乙醇。該法的理由是去除了酶解殘渣洗滌和戊糖發酵之前的乙醇蒸餾過程，降低了工藝的復雜性。但該法存在以下缺點(1)釀酒酵母能耐受70-110g/L的乙醇，而樹干畢赤酵母只能耐受30-35g/L的乙醇。乙醇耐受性的不一致大大限制了酵母能利用的總糖濃。(2)樹干畢赤酵母總是先利用葡萄糖，再利用木糖，葡萄糖利用速率和乙醇得率 低于釀酒酵母，利用木糖的速率和乙醇得率則更低。(3)樹干畢赤酵母不能完全利用木糖，在殘余木糖濃度為10g/L左右開始利用乙醇。2、此外，還可以利用基因工程對釀酒酵母進行基因改造，使之能同時發酵己糖和戊糖，然而基因工程菌對植物纖維原料酶解液的發酵效果不穩定，并受抑制物抑制作用明顯。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法，通過綠液預處理植物纖維原料，在低底物濃度下進行高效水解，水解結束固液分離后清液濃縮到較高糖濃度進行己糖戊糖順序發酵的工藝，以期實現用已有的成熟工藝和設備回收化學藥品、熱能，又減少了對環境的污染，低底物濃度酶水解和順序發酵保證了酶解和己糖、戊糖發酵的高效進行，減少原料成本，實現了乙醇的清潔生產。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法，先用綠液對風干植物纖維原料進行堿處理；然后在底物w/v濃度為5-15%下，用纖維素酶批式水解48-72h ;水解結束后水解物固液分離，將獲得的清液濃縮至糖液中葡萄糖濃度100-200g/L，濃縮糖液由釀酒酵母將己糖轉化為乙醇，蒸餾制取乙醇的醪液再由樹干畢赤酵母將戊糖轉化為乙醇。具體步驟如下
(1)用綠液對風干植物纖維原料進行堿處理，堿用量8%，處理溫度140°C，保溫時間lh，硫化度40%，經處理的植物纖維原料用水洗滌；
(2)將綠液預處理的植物纖維原料與纖維素酶混合，加入水，pH緩沖液、酸或堿，混合至底物w/v濃度5-15%，控制pH值在4. 0-6. O,反應體系中纖維素酶用量為8_15FPIU/g綠液預處理植物纖維原料，于45-55 °C條件下酶解反應48-72h ；
(3)酶水解反應結束后將水解物離心固液分離，清液經減壓蒸發濃縮至糖液中葡萄糖濃度為100-200g/L，濃縮糖液中添加適量營養鹽后，用釀酒酵母于28-35°C條件下厭氧發酵12-48h，將己糖轉化為乙醇，減壓蒸餾制取乙醇；再用樹干畢赤酵母于28-35°C條件下限制性供氧發酵醪液24-80h，將戊糖轉化為乙醇。所述的纖維素酶是以木霉、曲霉或細菌產生的能降解纖維素成葡萄糖的纖維素酶的一種或多種酶的復合物。所述的底物w/v濃度優選為5%。預處理指以提高纖維質原料中纖維素對纖維素酶的可及度所采用的物理、化學、生物或以上幾種方法聯合應用的方法。綠液，指由硫酸鹽法制漿堿回收系統中回收的熔融物溶解在水中所成的藥液。主要成分是碳酸鈉和硫化鈉，可用石灰苛化，回收氫氧化鈉。因成分中有少量的氫氧化鐵，呈綠色，故稱為綠液。相對于其它的預處理方法，用綠液預處理的方法，尤其是用制漿過程回收的綠液來預處理植物纖維原料具有以下的優點(1)預處理采用的基本工藝及設備在造 紙工業上均已成熟應用，可降低投資和運行風險。(2)預處理產生的廢液經蒸發濃縮后可與酶解殘渣一起燃燒回收熱能和堿，整個預處理過程沒有廢液排放，沒有污染。(3)相對緩和的條件不僅可減少預處理過程中聚糖的溶出，同時可以回避堿回收過程中的苛化工段，無白泥的二次污染。(4)綠液預處理對原料的要求比較低，農作物秸桿包括葉、髓等可全桿利用，提高了原料的利用率。有益效果與現有技術相比，本發明突出的優點包括(1)直接利用綠液為堿源，并在較低的堿用量(8%)下進行預處理，減少了對化學藥品用量的要求，并保證了較高的聚糖回收率，同時也高效利用了制漿廢液，降低制備乙醇成本。(2)在低酶用量下(8-15FPIU/g處理后絕干原料)進行酶水解，得到了較高的酶解得率，降低了酶的成本。(3)順序發酵兼顧了高濃度己糖發酵(100-200g/L葡萄糖)和戊糖發酵(30-100g/L木糖)，清液濃縮后的高濃度己糖發酵在工業規模上無需攪拌，其獲得的高乙醇濃度的醪液可降低后續乙醇蒸餾的蒸汽消耗，并且己糖發酵的高乙醇得率保證了高的噸植物纖維原料的乙醇產量；后續的戊糖發酵進一步提高了乙醇產量，降低了原料成本。(4)堿性預處理植物纖維原料制取乙醇各關鍵技術點(預處理、酶解和己糖發酵、戊糖發酵)的高效進行保證了高的噸植物纖維原料的乙醇產量，降低了噸乙醇的原料成本，使得整個堿性預處理植物纖維原料制取乙醇的工藝更經濟可行，更適應工業化和環保的需要。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。以下實施例中，葡萄糖濃度、木糖濃度、纖維二糖濃度以及乙醇濃度均采用高效液相色譜法(HPLC)測定。色譜條件如下色譜儀:Agillentll(K)高效液相色譜儀；色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H ;流動相0. 005mol/L 硫酸,流速0. 6mL/min ;柱溫55°C ;檢測器示差折光檢測器；進樣量10 μ L。外標法測定。實施例I玉米秸桿的預處理
玉米稻桿粉碎至2-5cm,用堿量8% (w/w),硫化度40%,固液比為1:6 (w/v),在60°C下空轉O. 5h后，將溫度升高至140°C，保溫lh。綠液預處理的玉米秸桿用水洗去殘余化學藥品，磨漿、擠干物料，作為后續酶水解的底物。分析底物的水分、纖維素含量，并計算總回收率和聚糖回收率。結果表明，IOOOg絕干玉米秸桿經綠液預處理、洗滌、擠干后水分含量76. 90%,葡聚糖含量55. 39% (干基)，木聚糖含量25. 43%，綠液預處理總回收率為63. 31%，葡聚糖回收率為91. 95%，木聚糖回收率為63. 42%，實現了聚糖的有效回收。實施例2底物濃度對玉米秸桿纖維素酶水解的影響
分別稱取實施例I的綠液預處理玉米秸桿5. 41、10. 82、16. 23,21. 65,27. 06,32. 47g
(絕干重分別為I. 25,2. 50,3. 75,5. 00,6. 25,7. 50g)于6個250mL三角瓶中，在每個三角
瓶中加入lmol/L檸檬酸緩沖液2. 5mL、按纖維素酶用量為13. 94FPIU/g綠液預處理玉米
秸桿(25FPIU/g葡聚糖，纖維素酶β-葡萄糖苷酶木聚糖酶=1:1. 15:6.61)分別在每
個三角瓶中加入相應的酶，在每個三角瓶中添加適量的蒸餾水使酶解體系中水分總體積
為50mL，用玻棒將反應體系充分混勻后蓋上蓋子，于150轉/分、50°C的恒溫搖床中酶解
48h。水解結束后，分別將水解物用離心機于4000轉/分條件下離心lOmin，取上清液測定
其中的葡萄糖濃度和纖維二糖濃度，并計算酶水解得率。其中，葡聚糖酶解得率(％)=(水
解液中葡萄糖濃度g/LXO. 9+水解液中纖維二糖濃度g/LXO. 95) X0. 05+ (底物絕干重
gXO. 5539) X 100% ;木聚糖酶解得率(％)=水解液中木糖濃度g/LX0. 88X0. 05+ (底物絕
干重gXO. 2543)X 100%。式中0. 9為葡萄糖與葡聚糖的轉換系數；0. 95為纖維二糖與葡
聚糖的轉換系數；0. 88為木糖和木聚糖的轉換系數；0. 05為水解糖液體積，L ；0. 5539為
原料中葡聚糖含量，% ;0. 2543為原料中木聚糖含量，% ；
表I底物濃度對玉米秸桿纖維素酶水解得率的影響
權利要求
1.一種堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法，具體步驟如下(1)用綠液對風干植物纖維原料進行堿處理，堿用量8%，處理溫度140°C，保溫時間lh，硫化度40%，經綠液預處理的植物纖維原料用水洗滌、磨漿、過濾；(2)將綠液預處理的植物纖維原料與纖維素酶混合，加入水，pH緩沖液、酸或堿，混合至底物w/v濃度5-15%，控制pH值在4. 0-6. O,反應體系中纖維素酶用量為8_15FPIU/g綠液預處理植物纖維原料，于45-55 °C條件下酶解反應48-72h ；(3)酶水解反應結束后將水解物離心固液分離，清液經減壓蒸發濃縮至糖液中葡萄糖濃度為100-200g/L，濃縮糖液中添加適量營養鹽后，用釀酒酵母于28-35°C條件下厭氧發酵12-48h，將己糖轉化為乙醇，減壓蒸餾出乙醇；再用樹干畢赤酵母于28-35°C條件下限制性供氧發酵醪液24-80h，將戊糖轉化為乙醇。
2.根據權利要求I所述的堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法，其特征在于所述的纖維素酶是以木霉、曲霉或細菌產生的能降解纖維素成葡萄糖的纖維素酶的一種或多種酶的復合物。
3.根據權利要求I所述的堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法，其特征在于所述的底物w/v濃度為5%。
全文摘要
本發明公開了一種堿性預處理植物纖維原料酶解發酵制取乙醇的方法，先用綠液對風干植物纖維原料進行堿處理；然后在底物w/v濃度為5-15%下，用纖維素酶批式水解48-72h；水解結束后水解物固液分離，將獲得的清液濃縮至糖液中葡萄糖濃度100-200g/L，濃縮糖液由釀酒酵母將己糖轉化為乙醇，蒸餾去除乙醇的醪液再由樹干畢赤酵母將戊糖轉化為乙醇。該法實現了用紙漿工藝已有的成熟工藝和設備回收化學藥品、熱能，減少了化學品的消耗和熱能的損失，降低對環境的污染，實現了乙醇的清潔生產；低底物濃度酶水解和順序發酵分別保證了酶解和己糖、戊糖發酵的高效進行，尤其將戊糖發酵的進行，提高了噸植物纖維原料的乙醇產量，降低了噸乙醇的原料成本。
文檔編號C12R1/865GK102827883SQ20121034023
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者勇強, 余世袁, 儲秋露, 楊德良, 黃陽, 徐勇, 朱均均, 李鑫 申請人:南京林業大學