專利名稱：一種利用高粱粉發酵生產檸檬酸的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵領域，具體地說，涉及一種利用高粱粉發酵生產檸檬酸的方法。
背景技術：
天然檸檬酸在自然界中分布很廣。在植物如檸檬、柑橘、菠蘿等果實和動物的骨骼、肌肉、血液中都含有檸檬酸。1784年C.W.舍勒首先從柑橘中提取檸檬酸。他是通過在水果榨汁中加入石灰乳以形成檸檬酸鈣沉淀的方法制取檸檬酸的。發酵法制取檸檬酸始于19世紀末。1893年C.韋默爾發現青霉(屬)菌能積累檸檬酸。1913年B.扎霍斯基報道黑曲霉能生成檸檬酸。1923年美國菲澤公司建造了世界上第一家以黑曲霉淺盤發酵法生產檸檬酸的工廠。隨后比利時、英國、德國、蘇聯等相繼研究成功發酵法生產檸檬酸。1952 年美國邁爾斯試驗室采用深層發酵法大規模生產檸檬酸。此后，深層發酵法逐漸建立起來。深層發酵周期短，產率高，節省勞動力，占地面積小，便于實現儀表控制和連續化，現已成為檸檬酸生產的主要方法。中國最早使用發酵法制取檸檬酸的報道為1942年湯騰漢等。1966年后，天津市工業微生物研究所、上海市工業微生物研究所相繼開展用黑曲霉進行薯干粉原料深層發酵檸檬酸的試驗研究，并獲得成功，從而確定了國內通過微生物發酵生產檸檬酸的主要工藝路線。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用高粱粉發酵生產檸檬酸的新方法。為了實現本發明目的，本發明的一種利用高粱粉發酵生產檸檬酸的方法，發酵所采用的微生物為黑曲霉(Aspergillus niger)，發酵培養基的主要原料為液化高粱粉。前述方法中，發酵培養基中還添加了液化玉米粉，且液化高粱粉和玉米粉的重量比為 19-16 1-4。前述方法中，發酵培養基中還添加了氮源。所述氮源為無機氮源，如硫酸銨和/或尿素等。前述方法中，發酵培養基中的高粱粉和玉米粉預先經過液化。液化時添加α-淀粉酶。前述方法中，發酵使用的菌株優選為黑曲霉(Aspergillus niger)FYCA2358。現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2012年8月21日，保藏號CGMCCNO. 6465。發酵條件為溫度35 38°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為(O. I O. 8) 1，轉速200 400rpm，發酵50 65小時。前述方法中，發酵培養基中的主要原料高粱粉為高粱經過粉碎后過80目篩。
本發明的目的還可以采用以下的技術措施來進一步實現。包括步驟I)高粱原料預處理高粱先經過粉碎，粉碎后過80目篩。高粱粉加水調漿，按種子罐15 20%的粉漿比、發酵罐25 35%的粉漿比進行配制。2)種子培養將含15 20%的粉漿比的高粱粉液化液作為種子培養基接入黑曲霉孢子，進行種子培養，培養成黑曲霉液體種子。3)發酵培養將培養好的黑曲霉液體種子接入含25 35%的粉漿比的高粱粉液化液的發酵培養基中進行培養。本發明檸檬酸發酵生產菌株可以為黑曲霉FYCA2358或其它黑曲霉菌株。其中，步驟I)中，所述粉漿比是指在100克水中含有的高粱粉的重量(克)。步驟2)中，種子培養基的組成為高粱粉按15 20%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按15 20%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為1-2 4-3。加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入種子罐中滅菌后接種培養。種子培養條件為37°C下通風培養24 30小時。步驟3)中，發酵培養基的組成為高粱粉按25 35%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按25 35%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為19-16 1_4。加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入發酵罐進行發酵。在發酵培養基中可以添加適量的無機氮源，例如硫酸銨、尿素等。所述發酵溫度為35 38°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為(O. I O. 8) 1，攪拌轉速為200 400rpm，培養50 65小時，pH值自然。可發酵性還原糖基本耗完后放罐。通過對培養基的優化發現，檬酸發酵的種子培養基以玉米粉培養基為優選，但在實際發酵中發現如果種子培養基只有玉米粉，進入發酵罐后在以高粱粉為主要原料的培養基中適應期比較長，從而延長發酵周期。因此在種子培養基中以玉米粉為主，適量添加高粱粉，菌球生長速度快，適應力增加，縮短了發酵周期。在檸檬酸的發酵培養基中同樣添加了適量的玉米粉，其主要作用是調節發酵過程中適宜的碳氮源比例，提高了糖酸代謝速度，有效縮短發酵周期。經過實驗發現，利用高粱為原料發酵生產檸檬酸，發酵結束時醪液中檸檬酸酸度可以達到12 15%，糖酸轉化率大于90%。本發明方法是以黑曲霉為生產菌株接入以高粱粉為主要碳源的液體發酵培養基中進行檸檬酸的發酵生產，在發酵罐中進行通風培養，發酵液經過提取后可獲得無水檸檬酸或一水檸檬酸結晶。采用本發明方法生產檸檬酸，成本低、產率高、質量穩定、生產周期短，是非糧生產檸檬酸的一條重要替代途徑，尤其在南美等國家非常適用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中涉及到的百分號“％”，是指質量百分比；但溶液的百分比，除另有規定外，是指IOOml溶液中含有溶質的克數。以下實施例中使用的黑曲霉(Aspergillus niger)FYCA2358，保藏號為CGMCCNo. 6465。
實施例I將檸檬酸生產菌種黑曲霉FYCA2358孢子接入滅菌后的種子培養基中。種子培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按15%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按15%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為I : 4，加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入種子罐中滅菌。種子培養條件為37°C下通風培養28小時。待液體種子培養結束后,接入滅菌后的發酵培養基培養。發酵培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按25%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按25%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為4 I。加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入500L發酵罐滅菌后進行發酵。在發酵培養基中添加O. 1%硫酸銨的無機氮源。所述發酵溫度為36°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為O. 2 1，攪拌轉速為400rpm,培養65小時，pH值自然。可發酵性還原糖基本耗完后放罐。發酵結束時發酵醪液中檸檬酸酸度為12. 5%，糖酸轉化率92%。實施例2 將檸檬酸生產菌種黑曲霉FYCA2358孢子接入滅菌后的種子培養基中。種子培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按15%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按15%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為3 7。加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入種子罐中滅菌。種子培養條件為37°C下通風培養28小時。待液體種子培養結束后,接入滅菌后的發酵培養基培養。發酵培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按25%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按25%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為4 I。加入α -淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入500L發酵罐滅菌后進行發酵。在發酵培養基中添加O. 1%硫酸銨的無機氮源。所述發酵溫度為36°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為O. 4 1，攪拌轉速為400rpm，培養67小時，pH值自然。可發酵性還原糖基本耗完后放罐。發酵結束時發酵醪液中檸檬酸酸度為12.4%，糖酸轉化率92.5%。實施例3將檸檬酸生產菌種黑曲霉FYCA2358孢子在無菌狀態下接入滅菌后的種子培養基中。種子培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按15%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按15%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為I : 4，加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入種子罐中滅菌。種子培養條件為37°C下通風培養28小時。待液體種子培養結束后,接入滅菌后的發酵培養基培養。發酵培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按25%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按25%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為9 I。加入α -淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入500L發酵罐滅菌后進行發酵。在發酵培養基中添加1%硫酸銨的無機氮源。所述發酵溫度為36°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為O. 6 1，攪拌轉速為400rpm,培養61小時，pH值自然。可發酵性還原糖基本耗完后放罐。發酵結束時發酵醪液中檸檬酸酸度為14. I%，糖酸轉化率92. 5%。實施例4將檸檬酸生產菌種黑曲霉FYCA2358孢子在無菌狀態下接入滅菌后的種子培養基中。種子培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按15%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按15%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為I : 4，加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入種子罐中滅菌。種子培養條件為37°C下通風培養28小時。待液體種子培養結束后,接入滅菌后的發酵培養基培養。發酵培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按25%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按25%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為4 I。加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入60m3發酵罐滅菌后進行發酵。在發酵培養基中添加0.1%硫酸銨的無機氮源。所述發酵溫度為36°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為0.8 1，攪拌轉速為400rpm,培養65小時，pH值自然。可發酵性還原糖基本耗完后放罐。
發酵結束時發酵醪液中檸檬酸酸度為14. 5%，糖酸轉化率93%。實施例5將檸檬酸生產菌種黑曲霉FYCA2358孢子在無菌狀態下接種滅菌后的種子培養基中。種子培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按15%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按15%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為I : 9。加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入種子罐中滅菌。種子培養條件為37°C下通風培養28小時。待液體種子培養結束后,接入滅菌后的發酵培養基培養。發酵培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按25%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按25%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為4 I。加入α -淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入500L發酵罐滅菌后進行發酵。在發酵培養基中添加1%硫酸銨的無機氮源。所述發酵溫度為36°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為O. 5 1，攪拌轉速為300rpm,培養69小時，pH值自然。可發酵性還原糖基本耗完后放罐。發酵結束時發酵醪液中檸檬酸酸度為12.5%，糖酸轉化率92%。實施例6將檸檬酸生產菌種黑曲霉FYCA2358孢子在無菌狀態下接種滅菌后的種子培養基中。種子培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按15%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按15%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為I : 4，加入α-淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入種子罐中滅菌。種子培養條件為37°C下通風培養28小時。待液體種子培養結束后,接入滅菌后的發酵培養基培養。發酵培養基的配制為高粱粉(過80目篩)按25%的粉漿比用自來水配制，玉米粉按25%的粉漿比用自來水配制。其中高粱粉與玉米粉的重量比為4 I。加入α -淀粉酶進行液化(完全液化的標準為碘液測試不變藍)后，進入60m3發酵罐滅菌后進行發酵。在發酵培養基中添加0.1%硫酸銨的無機氮源。所述發酵溫度為36°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為0.6 1，攪拌轉速為300rpm，培養72小時，pH值自然。可發酵性還原糖基本耗完后放罐。發酵結束時發酵醪液中檸檬酸酸度為15. I%，糖酸轉化率92. 7%。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種利用高粱粉發酵生產檸檬酸的方法，發酵所采用的微生物為黑曲霉(Aspergillus niger),其特征在于，以液化高粱粉作為發酵培養基的主要原料。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，發酵培養基中還添加了液化玉米粉。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，發酵培養基中還添加了氮源。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮源為無機氮源。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述無機氮源為硫酸銨和/或尿素。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，用α-淀粉酶進行液化。
7.根據權利要求2-6任一項所述的方法，其特征在于，發酵培養基中液化高粱粉和玉米粉的重量比為19-16 1-4。
8.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，發酵菌株為黑曲霉(Aspergillus niger)FYCA2358，保藏號為 CGMCC No. 6465。
9.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，發酵條件為溫度35 38°C，通入空氣與發酵醪液的體積比為(O. I O. 8) 1，轉速200 400rpm，發酵50 65小時。
10.黑曲霉(Aspergillusniger)FYCA2358，其保藏號為 CGMCCNo. 6465。
全文摘要
本發明提供了一種利用高粱粉發酵生產檸檬酸的方法，以黑曲霉為生產菌株，將其接入以高粱粉為主要碳源的液體發酵培養基中進行檸檬酸的發酵生產，在發酵罐中進行通風培養，發酵液經過提取后可獲得無水檸檬酸或一水檸檬酸結晶。采用本發明方法生產檸檬酸，成本低、產率高、質量穩定、生產周期短，是非糧生產檸檬酸的一條重要替代途徑，尤其在南美等國家非常適用。
文檔編號C12P7/48GK102864185SQ201210347960
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者李榮杰 申請人:安徽豐原發酵技術工程研究有限公司