專利名稱：微藻利用無機(jī)碳途徑的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微藻利用無機(jī)碳途徑的定量方法，屬于生態(tài)環(huán)境治理和海洋生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微藻(microalgae)包括所有生活在水中營浮游生活方式的微小植物，通常就指浮游藻類。微藻結(jié)構(gòu)簡單，其生理過程也相對簡單，有些種類是科學(xué)研究的模式植物，如萊茵衣藻、小球藻，很多種類還可以人工培養(yǎng)，這為我們的研究提供了便利。微藻對水體無機(jī)碳的利用有兩種方式，(I)利用大氣中的ニ氧化碳。CO2作為線性非極性分子，呈電中性，它可以自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞雙層脂膜，進(jìn)入細(xì)胞中的CO2為微藻細(xì)胞的光合作用所利用；(2)利用溶液中碳酸氫根離子。碳酸氫根離子既可以直接轉(zhuǎn)運也可間接轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中為微藻細(xì)胞 所利用。碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運指的是經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)膜表面載體蛋白或陰離子交換蛋白， 直接把碳酸氫根離子轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)經(jīng)碳酸酐酶轉(zhuǎn)化為CO2或直接以碳酸氫根離子的形式由葉綠體膜蛋白主動運輸?shù)饺~綠體內(nèi)，經(jīng)碳酸酐酶轉(zhuǎn)化成CO2供核酮糖-1，5 ニ磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)固定；碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運是指依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運。碳酸酐酶(EC 4. 2. I. I)是ー種含鋅的金屬酶，催化CO2與HCO3-的可逆轉(zhuǎn)化C02+H20 H++HCCV。碳酸酐酶分為質(zhì)膜內(nèi)和質(zhì)膜外兩種。質(zhì)膜外碳酸酐酶(又稱胞外碳酸酐酶)通過金屬離子與細(xì)胞壁內(nèi)表面相連接，催化細(xì)胞擴(kuò)散層中碳酸氫根離子迅速水解成游離CO2,從而保證了細(xì)胞的CO2快速供應(yīng)。有些藻類只利用CO2 ;有些藻類不僅能利用CO2,還能或直接利用碳酸氫根離子，或通過胞外碳酸酐酶間接利用碳酸氫根離子，或者兩者兼而有之。但是現(xiàn)有技術(shù)無法定量微藻利用無機(jī)碳途徑。了解微藻利用方式和份額將有助于微藻生物技術(shù)的發(fā)展，同吋，為水華赤潮的治理提供科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種微藻利用無機(jī)碳途徑的識別方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)無法定量微藻利用無機(jī)碳途徑的不足。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案它包括以下步驟第一，選擇兩種S13C值差值大于8%。的碳酸氫鈉作為同位素標(biāo)記I和同位素標(biāo)記2分別添加到培養(yǎng)液中來培養(yǎng)待測微藻；同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ C1,同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ。2 ;同時測定未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳δ 13C值為δ C(l ；
第二，待測微藻同時在被考察的培養(yǎng)條件下和在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4天后，分別測定兩種同位素標(biāo)記的培養(yǎng)液培養(yǎng)的相對應(yīng)的各培養(yǎng)條件下的、被考察微藻的穩(wěn)定碳同位素組成S 13C的值δη、δΤ2、δτ1_ΑΖ和δΤ2_ΑΖ;
第三，通過方程& =計算出微藻各培養(yǎng)條件下利用添加的無機(jī)碳源的份額
OCl-OQfB;
第四，依據(jù)在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養(yǎng)條件下的待測微藻的穩(wěn)定碳同位素值ST1-AZ或δΤ2_ΑΖ，依據(jù)方程Sa=STi- fBDi，計算微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的δ 13C值為δ a ；
第五，依據(jù)在各培養(yǎng)條件下的待測微藻的穩(wěn)定碳同位素值δτ1和δΤ2;微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值Sa;微藻各培養(yǎng)條件下利用添加的無機(jī)碳源的份額も以及相應(yīng)的同位素標(biāo)記的碳酸氫鈉的W3C值δα與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳δ 13Cft 的差Di的信息，代入方程fb= 1000 ( δ Ti- δ a- fBDi)/9中，計算微藻利用碳酸氫根離子途徑的份額fb，i-fb為微藻利用ニ氧化碳途徑的份額；
本發(fā)明的優(yōu)點如下
自然界中碳元素有兩種穩(wěn)定同位素=12C和13C,它們的天然平均豐度分別為98. 89%和 I.11%。穩(wěn)定碳同位素組成通常用δ 13C (%。)表示，自然界中δ 13C的變化為-90%。、20%0。穩(wěn)定碳同位素的強(qiáng)烈分餾特征是識別微藻無機(jī)碳來源的基礎(chǔ)。質(zhì)量平衡原理以及同位素混合模型和化學(xué)計量學(xué)方法，是定量識別微藻無機(jī)碳來源的基礎(chǔ)。微藻兩種無機(jī)碳利用途徑造成的同位素分餾差異有明顯不同。利用大氣中的ニ氧化碳途徑可造成最大的同位素分餾(S a)。碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運和依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運途徑造成的同位素分餾比利用大氣中的ニ氧化碳途徑造成同位素分懼小9%。(PDB)0こ酰唑胺(acetazolamide,AZ)是含1，3, 4_噻ニ唑環(huán)的雜環(huán)磺酰胺類碳酸酐酶胞外酶抑制劑。利用碳酸酐酶胞外酶抑制劑能夠?qū)Ｒ坏匾种铺妓狒赴饷傅奶攸c，研究碳酸酐酶胞外酶活性被抑制下的微藻同位素變化，可以反向識別依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運途徑對無機(jī)碳利用的貢獻(xiàn)和份額。在依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子間接轉(zhuǎn)運途徑被抑制同時，碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運途徑也同時被抑制。高濃度碳酸氫鈉也對碳酸酐酶胞外酶有抑制作用，在高濃度碳酸氫鈉和IOmM AZ的作用下，依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運途徑和碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運途徑將同時被完全抑制。本發(fā)明采取如下的思路分別添加兩種δ 13C值差異懸殊的碳酸氫鈉同時培養(yǎng)待測微藻，測定藻體δ 13C值，利用兩端元的同位素混合模型獲取微藻利用來自于空氣的無機(jī)碳源和利用添加的無機(jī)碳源的份額，隨后分別添加兩種δ 13C值差異懸殊的、高濃度的碳酸氫鈉，在IOmM AZ的條件下培養(yǎng)待測微藻,測定藻體δ 13C值,獲取微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑造成的同位素分餾值(牝)，最后，根據(jù)上述信息，利用ニ端元的同位素混合模型，分別求出兩種途徑的份額。獲取無機(jī)碳源份額的原理
水體中總?cè)芙獾臒o機(jī)碳(DIC)存在四種形式co2、hco3_、h2co3和CO廣，并且它們存在著如下的化學(xué)平衡C02+H20 — H2CO3 — HC03_+H+ — C032_+2H+。無論是來源于空氣的無機(jī)碳還是添加的無機(jī)碳都有兩種無機(jī)碳——CO2和HCO3-供微藻利用。因此，可以利用兩端元的同位素混合模型獲取微藻利用來自于空氣的無機(jī)碳源和利用添加的無機(jī)碳源的份額。兩端元的同位素混合模型可以表示為
5 Ti= 5 Ai- fBi 5 Ai +fBi δ Bi (i=l，2,3，------) (I)這里δπ為微藻的S13C值，δΜ為假定為微藻完全利用空氣的無機(jī)碳源時藻體的S13C值，S Bi為假定為微藻完全利用添加的無機(jī)碳源時藻體的S13C值，fBi為該考察微藻利用添加的無機(jī)碳源所占的份額。很顯然，只知道δπ很難求出fBi，因此，本發(fā)明采用具有較大差異的S13C值碳酸氫鈉分別同時培養(yǎng)微藻，以穩(wěn)定碳同位素雙標(biāo)記來識別微藻利用添加的無機(jī)碳源的份額。對于同位素標(biāo)記I (i=l)來說，方程(I)表示如下式
3 τι- δ A1_ fB1 δ A1 +fB1 δ B1 (2)
這里Sn為用第一種已知S13C值的碳酸氫鈉培養(yǎng)的微藻藻體的S13C值，δΑ1為假定為微藻完全利用空氣的無機(jī)碳源時藻體的S 13C值，δΒ1為假定為微藻完全利用添加的無機(jī)碳源時藻體的δ 13C值，fB1為該考察微藻利用添加的無機(jī)為碳源所占的份額。
3 T2- 3 A2 _ fB2 δ A2 +fB2 δ B2( 3 )
這里St2為用第一種已知S13C值的碳酸氫鈉培養(yǎng)的微藻藻體的S13C值，δΑ2為假定為微藻完全利用空氣的無機(jī)碳源時藻體的S 13C值，δΒ2為假定為微藻完全利用添加的無機(jī)碳源時藻體的δ 13C值，fB2為該考察微藻利用添加的無機(jī)碳源所占的份額。(2)和(3)兩個方程中 δ Α1= δ A2，fB=fBi= fB1= fB2，聯(lián)立求解
c δτ -δχ2,、
fB = -———(4)
OEl- OE2
(4)式中δΒ1-δΒ2_可以換算成同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的S13C值與同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C2的差，則
P δτι-δτ2.ΓΛ
tB =--( 5 )
Oci - OC2
因此，可以通過測定同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的S13C值Sci與同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的S13C值，同時測定用對應(yīng)的標(biāo)記的碳酸氫鈉培養(yǎng)的微藻的S13C值，即測定出δτ1和δ Τ2值，依(5)式計算出該考察微藻利用添加的無機(jī)碳源所占的份額。獲取微藻無機(jī)碳利用途徑份額的原理
無論是來源于空氣的無機(jī)碳還是添加的無機(jī)碳都有兩種無機(jī)碳一CO2和hco3_供微藻利用。因此，可以利用兩端元的同位素混合模型來獲取微藻兩種利用無機(jī)碳途徑的份額信
O兩端元的同位素混合模型可以表示為
5Ti=(l-fB) [(l-fb) 5a+fb(5a +9%0)]+fB [(l-fb) 5bi+fb(5bi +9%。)] (i=l，2) (6)這里δ 為微藻的S13C值，Sa為微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值，Sbi假定為微藻利用添加的無機(jī)碳源、完全進(jìn)行ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值，fb為該考察微藻利用碳酸氫根離子途徑所占的份額。在這里，Sbi-Sa可以換算成同位素標(biāo)記的碳酸氫鈉的S13C值δα(或同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的S 13C值δ C1或同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C2)與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳S 13C值δω的差Di。因此，(6)式可簡化成
fb= 1000 (δΤ -δ3- ^)/9 (i=l,2) (7)微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值，也即Sa賦值原理
在高濃度碳酸氫鈉和IOmM AZ的作用下，(7)式fb=0 也即 δ Ti- δ a- fBDj =0，
5 a=5 Ti- fBDi (i=l，2)(8)
綜合利用上述原理，可以快速定量微藻利用無機(jī)碳途徑；在完全相同的實驗條件下開展培養(yǎng)實驗，獲取微藻利用無機(jī)碳途徑份額的數(shù)據(jù)可靠，這是現(xiàn)有技術(shù)都無法做到的。
具體實施例方式
具體實施例方式第一步驟，測定不同廠家生產(chǎn)的碳酸氫鈉，選擇兩種S13C值差值大于8 %。的碳酸氫鈉作為同位素標(biāo)記I和同位素標(biāo)記2分別加到培養(yǎng)液中。同位素標(biāo)記的碳酸氫鈉的δ 13C值記為δ α,其中同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ C1,同位素標(biāo) 記2的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ。2。同位素標(biāo)記的碳酸氫鈉的δ 13C值δ c與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳S 13C值δ co的差為Di,其中D1為同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C1與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳δ 13C值δ co的差，D2為同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C2與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳s 13C值δω的差。第二步驟，同時用兩種同位素標(biāo)記碳酸氫鈉的培養(yǎng)液分別同時在被考察的培養(yǎng)條件下和在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)被考察的微藻，4天后，同時分別測定兩種同位素標(biāo)記的培養(yǎng)液培養(yǎng)的相對應(yīng)的各培養(yǎng)條件下的、被考察微藻的穩(wěn)定碳同位素
組成 S 13C 的值 δ Τ1、δ Τ2、δ Τ1_ΑΖ 和 δ Τ2_ΑΖ ；。第三步驟，將同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的S13C值作為δα，由同位素標(biāo)記I培養(yǎng)的、各培養(yǎng)條件下的、被考察微藻的S13C值作為δτ1，同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的S13C值作為δ ca，由同位素標(biāo)記2培養(yǎng)的、相對應(yīng)的培養(yǎng)條件下的、被考察微藻的S13C值作為δ Τ2，
帶入& =，計算出各個培養(yǎng)條件下被考察微藻利用添加的無機(jī)碳源的份額fB，微藻
OCl- OC2
利用空氣的無機(jī)碳源份額為i-fB。第四步驟，依據(jù)在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的被考察微藻的穩(wěn)定碳同位素值S Ti ( S X1-AZ或S T2-AZ ) ^依據(jù)方程:K= &計算微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值sa。第五步驟，依據(jù)在各培養(yǎng)條件下的待測微藻的穩(wěn)定碳同位素值δ ，其中在同位素標(biāo)記I碳酸氫鈉培養(yǎng)下的待測微藻的穩(wěn)定碳同位素值S T1，在同位素標(biāo)記2碳酸氫鈉培養(yǎng)下的待測微藻的穩(wěn)定碳同位素值S T2;微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的W3C值δ a、微藻各培養(yǎng)條件下利用添加的無機(jī)碳源的份額fB以及相應(yīng)的同位素標(biāo)記的碳酸氫鈉的δ 13C值δ α (同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C1或同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的S13C值δ。2)與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳S13C值Scxi的差Di的信息，代入方程fb= 1000 ( δ Ti- δ a- fBDi)/9中，計算微藻利用碳酸氫根離子途徑的份額fb，i-fb為微藻利用ニ氧化碳途徑的份額。本發(fā)明的實施效果如下
培養(yǎng)材料為衣藻和小球藻。基本培養(yǎng)液采用SE培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)條件為光周期L/D 12h/12h ，溫度25°C;光照強(qiáng)度為IOOMm0InT2s-SpH值8. O或8. 2 (用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié))。其它培養(yǎng)條件如表1，其中添加的碳酸氫鈉的S 13C分別為-26. 3%o (PDB) ( δ C1)和-16. 5%0(PDB) ( 5C2),16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養(yǎng)條件是必需的。未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳S 13C值為-11.8%。(PDB)。待培養(yǎng)4天后，分別測定各培養(yǎng)條件和各實驗的微藻S 13C值。用本發(fā)明方法，得出衣藻和小球藻各個培養(yǎng)條件下利用添加的無機(jī)碳源的份額fB以及利用空氣的無機(jī)碳源份額l_fB，如表2。隨后，利用本發(fā)明，得出衣藻和小球藻各個培養(yǎng)條件下利用碳酸氫根離子途徑和利用ニ氧化碳途徑的份額，如表3。
表I衣藻和小球藻各培養(yǎng)實驗的培養(yǎng)條件
權(quán)利要求
1.一種微藻利用無機(jī)碳途徑的定量方法，其特征包含以下步驟 第一，選擇兩種S13C值差值大于8 %。的碳酸氫鈉作為同位素標(biāo)記I和同位素標(biāo)記2分別添加到培養(yǎng)液中來培養(yǎng)待測微藻；同位素標(biāo)記I的碳酸氫鈉的S 13C值為δα，同位素標(biāo)記2的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ。2 ;同時測定未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養(yǎng)液中無機(jī)碳S 13C值為Sai; 第二，待測微藻同時在被考察的培養(yǎng)條件下和在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4天后，分別測定兩種同位素標(biāo)記的培養(yǎng)液培養(yǎng)的相對應(yīng)的各培養(yǎng)條件下的、被考察微藻的穩(wěn)定碳同位素組成S 13C的值δτ1、δΤ2、δτ1_ΑΖ和δΤ2_ΑΖ; 第三，通過方程
全文摘要
本發(fā)明公開一種微藻利用無機(jī)碳途徑的定量方法。現(xiàn)有技術(shù)無法定量微藻利用無機(jī)碳途徑。解決方法為分別添加兩種δ13C值差值大于8‰的碳酸氫鈉作為同位素標(biāo)記1和同位素標(biāo)記2到培養(yǎng)液中來培養(yǎng)待測微藻；待測微藻同時在上述條件下和在16mM碳酸氫鈉和10mMAZ的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4天后，測得δ13C值，計算出微藻各培養(yǎng)條件下利用添加的無機(jī)碳源的份額fB和完全利用大氣中的二氧化碳途徑時藻體的δ13C值δa，然后根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算得到微藻利用無機(jī)碳的兩種途徑的份額。本發(fā)明可以快速定量微藻利用無機(jī)碳途徑；在完全相同的實驗條件下開展培養(yǎng)實驗，獲取微藻利用無機(jī)碳途徑份額的數(shù)據(jù)可靠，這是現(xiàn)有技術(shù)都無法做到的。
文檔編號C12Q1/06GK102827916SQ20121034844
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者吳沿友, 李海濤, 劉叢強(qiáng), 王寶利, 梁小兵, 徐瑩, 謝騰祥 申請人:中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所