專(zhuān)利名稱(chēng)：C型鈉肽在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及C型鈉肽在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在家畜繁殖上，廣泛采用非激素刺激卵巢來(lái)源卵母細(xì)胞體外成熟后生產(chǎn)動(dòng)物胚胎，因此體外卵母細(xì)胞成熟是一個(gè)重要的平臺(tái)技術(shù)用于育種、克隆及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)。
目前，優(yōu)質(zhì)種牛數(shù)量少、繁育速度慢、生產(chǎn)性能落后是制約我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。牛的體細(xì)胞克隆胚胎(NTEs)以及體外受精胚胎(IVFEs)的細(xì)胞數(shù)，均明顯低于體內(nèi)胚胎，這反映了牛的體外培養(yǎng)體系還不理想。牛體外受精(in vitroFertilization, IVF)胚胎質(zhì)量是影響胚胎移植妊娠率和移植后后代犢牛成活率的重要因素。近年來(lái)關(guān)于牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(IVM)方面取得了較大進(jìn)展。專(zhuān)利CN102140435A、CN 101591637A、CN 100432219C公開(kāi)了提高牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法或新的培養(yǎng)液。但均是用于促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞體外生長(zhǎng)成熟。這對(duì)于卵母細(xì)胞從卵泡轉(zhuǎn)到培養(yǎng)液中后，在胞質(zhì)未完全成熟的情況下提前恢復(fù)減數(shù)分裂，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。為了提高卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力，許多學(xué)者模擬體內(nèi)環(huán)境開(kāi)發(fā)了卵母細(xì)胞體外兩段成熟培養(yǎng)方法，即通過(guò)體外使用減數(shù)分裂抑制劑暫時(shí)可逆的阻止卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，同時(shí)促進(jìn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)胞質(zhì)成熟，然后移出減數(shù)分裂抑制環(huán)境，進(jìn)行體外成熟。這種方法目的延長(zhǎng)顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞通過(guò)間隙連接進(jìn)行物質(zhì)和信息交流的時(shí)間，促進(jìn)卵母細(xì)胞積累豐富的mRNA和蛋白質(zhì)。但是，這些研究結(jié)果顯示通過(guò)使用減數(shù)分裂抑制劑并沒(méi)有提高牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力，甚至產(chǎn)生了不利的影響(Gilchrist RB, et al.Comparison of oocyte factors and transforming growthfactor-beta in the regulation of DNA synthesis in bovine granulosa cells. MolCell Endocrinol, 2003, 201:87 - 95. Lonergan P, et al. Bovine blastocyst productionin vitro after inhibition of oocyte meiotic resumption for 24h. J ReprodFertil, 1997，109:355 - 365.)。C型鈉肽(CNP, C-type natriuretic peptide, C型鈉尿肽，C_型利鈉肽)為鈉肽家族成員，一般認(rèn)為以自分泌和旁分泌的方式調(diào)控動(dòng)物心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及繁殖性能。功能性C型鈉肽由22個(gè)氨基酸組成，是生理活性物質(zhì)，相對(duì)于化學(xué)合成的減數(shù)分裂抑制劑危害性應(yīng)較小，用于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的建立可能具有一定的作用。《Granulosa Cell Ligand NPPC and Its Receptor NPR2 Maintain MeioticArrest in Mouse Oocytes’》(Science, 2010)文中提出一種模型來(lái)解釋小鼠卵母細(xì)胞保持減數(shù)分裂的機(jī)制。通過(guò)NPPC (C型利鈉肽前體)和NPR2 (由卵丘細(xì)胞表達(dá)的一種鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶)突變體小鼠來(lái)驗(yàn)證NPPC和NPR2在保持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯的作用，突變體小鼠出現(xiàn)了促性腺激素非依賴(lài)性的減數(shù)分裂的恢復(fù)。但上述只是一種機(jī)制研究，對(duì)于CNP能否抑制牛等家畜卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，并用于體外受精、胚胎生產(chǎn)尚不確定，目前尚無(wú)此方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液。本發(fā)明另一目的是提供一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法。本發(fā)明再一目的是提供C型鈉肽在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟中的應(yīng)用及C型鈉肽在制備用于促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟藥物/減數(shù)分裂抑制劑藥物中的應(yīng)用。所述牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中含有C型鈉 肽。優(yōu)選地，所述體外成熟培養(yǎng)液每IOOOmL組成為C 型鈉肽 200nM。TCM199 補(bǔ)足至 1000mL。牛卵母細(xì)胞采集后在添加CNP的組織培養(yǎng)液內(nèi)前成熟處理6h，然后在成熟液內(nèi)成熟24-28h，成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，然后進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)。具體地，包括以下步驟I)采集牛卵母細(xì)胞；2)將牛卵母細(xì)胞在所述牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)；3)牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)。其中，步驟I)中所述牛卵母細(xì)胞為卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。其中，步驟2)中所述培養(yǎng)時(shí)間為6h ;所述培養(yǎng)液為T(mén)CM199培養(yǎng)液。其中，步驟3)中所述培養(yǎng)的培養(yǎng)液為添加FSH 10 μ g/ml, LHl μ g/ml, E2I μ g/ml,EGF lOng/ml, 10%FBS 的 TCM199 培養(yǎng)液；培養(yǎng)時(shí)間為 24_28h。其中，成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞還用于體外受精或體外胚胎生產(chǎn)。本發(fā)明的有益效果I)本發(fā)明首次采用兩段體外成熟培養(yǎng)法，應(yīng)用CNP前成熟處理牛卵母細(xì)胞，促進(jìn)核成熟和胞質(zhì)成熟同步，提高了體外發(fā)育能力，能夠成為新型的減數(shù)分裂抑制劑藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。2)本發(fā)明充分利用屠宰場(chǎng)卵巢卵母細(xì)胞資源，加速良種選育及擴(kuò)繁技術(shù)體系，大幅度提高育種效率和技術(shù)水平。3)本發(fā)明CNP為生物活性的肽類(lèi)物質(zhì)，對(duì)卵母細(xì)胞的毒害作用小。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)用卵巢采自河北省大廠(chǎng)縣屠宰場(chǎng)，C型鈉肽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)施例I卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)(I)卵母細(xì)胞采集使用含有抽卵液(TCM199+l%PVA+200uM IBMX+1%雙抗)的IOml注射器從屠宰場(chǎng)獲取的牛卵巢表面抽取直徑3-8mm卵泡。將吸取卵母細(xì)胞后的吸卵液放入IOOmL國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下挑選出A級(jí)(胞質(zhì)均勻3層及以上緊密卵丘顆粒細(xì)胞包裹)和B級(jí)(胞質(zhì)均勻少于3層緊密卵丘顆粒細(xì)胞包裹或部分裸露)卵母細(xì)胞用于體外前成熟培養(yǎng)。(2)卵母細(xì)胞前成熟處理將挑選出的A、B級(jí)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes,COCs)在洗卵液(TCM199+l%PVA+200uM IBMX+1%雙抗)中清洗3次，含有CNP的前成熟液(添加200nM濃度CNP的TCM199培養(yǎng)液)清洗2次，然后放入預(yù)先在C O2培養(yǎng)箱中平衡2h的前成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)(四孔板培養(yǎng)，500 μ I體積成熟液，50枚左右卵母)，培養(yǎng)條件為含5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為6h。前成熟后一部分卵母細(xì)胞脫去顆粒細(xì)胞，然后DAPI染色在顯微鏡下觀察CNP對(duì)牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制情況(未添加CNP的前成熟液培養(yǎng)的卵母細(xì)胞為對(duì)照)，觀察卵母細(xì)胞維持在生發(fā)泡(GV)階段的數(shù)目，前成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行下一步成熟培養(yǎng)用于檢測(cè)發(fā)育能力。結(jié)果見(jiàn)表I。表IC型鈉肽前處理后對(duì)體外牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響
處理卵母細(xì)胞數(shù) GV數(shù)(%)GVBD數(shù)(%)
Control9151(56 + 2.6°) 40(44 + 2.6°)
CNP(200nM) 9479(81. 5 + 2. Ib) 18(21. 3 + 2. Ib)注同列不同字母表示差異顯著(P〈0. 01)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CNP處理6h后抑制了牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，卵母細(xì)胞維持在生發(fā)泡(GV)階段的比例顯著高于與對(duì)照(P〈0. 05)。(3)卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)前成熟處理后的牛卵母細(xì)胞在成熟液中(添加FSH 10 μ g/ml, LH lyg/ml,E21 μ g/ml，EGF 10ng/ml, 10%FBS的TCM199培養(yǎng)液)進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)培養(yǎng)時(shí)間處理分別為24h、26h和28h，同時(shí)沒(méi)有經(jīng)過(guò)前成熟處理的卵母細(xì)胞設(shè)定為對(duì)照，設(shè)定3個(gè)培養(yǎng)時(shí)間處理分別為24h、26h和28h。實(shí)施例2體外受精與體外胚胎生產(chǎn)(I)體外受精采用培養(yǎng)皿微滴法，首先將成熟的卵母細(xì)胞在受精液(B0液+IOmM咖啡因+3mg/mlBSA)中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中(放入量為每50 μ I受精液，15枚卵母細(xì)胞)，未添加CNP的前成熟液培養(yǎng)的卵母細(xì)胞為對(duì)照；然后采用上浮法處理冷凍精液，精子在洗精液(Β0液+20ug/ml 肝素鈉+6mg/ml BSA)上浮 20_30min，之后取上清 600-800 μ I 放入 I. 5ml離心管離心(1500轉(zhuǎn)，離心5min) 2次，離心后除去上清加入洗精液最終體積為250 μ 1，取50 μ I處理后的精液加入已放入卵母細(xì)胞的受精液中，精子終濃度為I X IO6精子/ml，培養(yǎng)條件為5%C02的空氣，溫度39 °C，飽和濕度，受精時(shí)間為8h。(2)體外胚胎生產(chǎn)受精后的合子在前期發(fā)育液(CRl液+6mg/ml BSA, 2ml)洗滌3次后采用四孔板兩步法培養(yǎng)首先在500 μ I前期發(fā)育液(50枚左右合子)培養(yǎng)2d，計(jì)數(shù)卵裂胚胎后移入500 μ I后期發(fā)育液(CRl液+10%FBS)培養(yǎng)5d，間隔2d半量換液，培養(yǎng)條件為5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，胚胎發(fā)育第7天計(jì)數(shù)囊胚數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。表2C型鈉肽前處理后對(duì)體外牛卵母細(xì)胞受精后胚胎卵裂率的影響
權(quán)利要求
1.一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液,其特征在于，以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中含有C型鈉肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，其特征在于，所述體外成熟培養(yǎng)液每IOOOmL組成為 C型鈉肽200nM， TCM199 補(bǔ)足至 1000mL。
3.一種利用權(quán)利要求I或2所述牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液促進(jìn)牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)方法，包括以下步驟 1)采集牛卵母細(xì)胞； 2)將牛卵母細(xì)胞在所述牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)； 3)牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述牛卵母細(xì)胞為卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述培養(yǎng)的時(shí)間為6h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述培養(yǎng)的培養(yǎng)液為含有FSH10 μ g/ml, LH I μ g/ml, E2I μ g/ml, EGFlOng/ml, 10%FBS 的 TCM199 培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述培養(yǎng)的時(shí)間為24-28h。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞還用于體外受精或體外胚胎生產(chǎn)。
9.C型鈉肽在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用。
10.C型鈉肽在制備用于促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟藥物/減數(shù)分裂抑制劑藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及C型鈉肽在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中含有C型鈉肽。本發(fā)明通過(guò)CNP體外抑制牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，前成熟處理后促進(jìn)了卵母細(xì)胞核成熟和胞質(zhì)成熟同步，提高了體外發(fā)育能力，能夠成為新型的減數(shù)分裂抑制劑藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，加速良種選育及擴(kuò)繁技術(shù)體系。本發(fā)明CNP作為生物活性的肽類(lèi)物質(zhì)，對(duì)卵母細(xì)胞的毒害作用小于化學(xué)合成的減數(shù)分裂抑制物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N5/073GK102899286SQ20121034828
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者田見(jiàn)暉, 賈振偉, 張家新, 安磊, 吳中紅 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)