一種八聚核苷酸結合蛋白表達基因的用途及其相關藥物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及人八聚核苷酸結合蛋白表達基因的用途及其相關藥物。本發明公開了人八聚核苷酸結合蛋白表達基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途，并且進一步構建了針對人八聚核苷酸結合蛋白表達基因的小分子干擾RNA、基因干擾核酸構建體、基因干擾慢病毒，公開了他們的用途。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人八聚核苷酸結合蛋白的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中八聚核苷酸結合蛋白的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】—種八聚核苷酸結合蛋白表達基因的用途及其相關藥物
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地涉及人八聚核苷酸結合蛋白表達基因的用途及其相關藥物。
【背景技術】
[0002]RNA干擾(RNA interference, RNAi)即用核苷酸組成的短的雙鏈RNA(dsRNA)進行轉錄后基因沉默。它可高效、特異地阻斷體內特定基因的表達，導致其降解，從而引起生物體內特異基因的沉默，使細胞表現出某種基因表型的缺失，是近年來新興的一種常用的研究基因功能、尋找疾病治療方法的實驗室技術。研究表明，長度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉錄和轉錄后水平特異性的引起RNAi (Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to 23 nucleotide intervals.Cell 2000; 101:25-33.)?腫瘤患者雖經化療、放療和綜合治療，但五年生存率仍很低，如能對腫瘤發病和進展有關的基因進行干預，將能為腫瘤的治療開辟新途徑。近年來，RNAi已成為腫瘤的基因治療的有效策略。利用RNAi技術可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細胞周期相關基因、抗凋亡相關基因等的表達來抑制腫瘤進程(Uprichard, Susan LThe therape utic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.)。
[0003]Nono (non-POU domain containing，octamer-binding)是一種功能復雜的核蛋白(Yaron ST, Dov Z.PSF and p54nrb/Nono mut1-functional nuclear proteins.FEBSLetters.2002;531:109-114.)，它參與細胞核內 RNA 的加工(Zhang Z，Carmichael GG.Thefate of dsRNA in the nucleus: a p54nrb_containing complex mediates the nuclearretention of promiscuously A-to-1edited RNAs.Cell.2001;106(4):465-75.)、基因的轉錄調控(Mathur M, Tucker PW, Samuels HH.PSF is a novel corepressor thatmediates its effect through Sin3A and the DNA binding domain of nuclear hormonereceptors.Mol Cell Biol.2001; 21 (7): 2298-311.)、DNA 重組配對(Straub T，KnudsenBR，and Boege F.PSF/p54nrb Stimulates “Jumping” of DNA Topoisomerase I betweenSeparate DNA Helices.Biochemistry.2000; 39 (25): 7552-8.)等各種核反應的過程。作為一種核酸結合蛋白，Nono具有DNA/RNA雙重結合能力，常以單體或異二聚體的形式與其他核因子結合發揮作用，或者形成DNA/RNA-核因子復合體參與細胞核內發生的各種反應(Yang YSj Hanke JHj Carayannopoulos L,and et al.NonOj a non-POU-domain-containing，octamer—binding protein, is the mammalian homolog of Drosophila nonAdiss.MolCell Biol.1993;13(9):5593 - 5603.) o目前，對Nono生物學功能的研究還不全面，關于Nono在腫瘤發生中的調節作用尚不明確。
[0004]Nono與p54mb具有高度同源性，他們在氨基酸組成上只相差幾個氨基酸，并且表達譜范圍廣，在大多數組織和細胞中都有表達(Yang YSj Hanke JHj CarayannopoulosL, and et al.NonOj a non-POU-domain—containing，octamer-binding protein, is themammalian homolog of Drosophila nonAdiss.Mol Cell Biol.1993;13 (9):5593 -5603.)。已有研究表明，p54mb在人黑色素瘤細胞中表達明顯上調，敲除該基因后，可有效抑制黑色素瘤細胞生長活性、增殖能力并阻滯細胞分裂，表明p54mb在腫瘤形成過程中起至Ij一定的作用(Schiffner S，Zimara N，Schmid R, et al.p54mb is a new regulator ofprogression of malignant melanoma.Carcinogenesis.2011; 32 (8):1176-1182.X 在腎乳頭狀細胞瘤中，PSF和p54mb/N0n0分別與位于X染色體上的TFE3基因發生易位，而染色體易位可能導致原癌基因被激活，與多種腫瘤的發生密切相關(Clark J，Lu YJ, SidharSK, et al.Fusion of splicing factor genes PSF and NonO(p54nrb)to the TFE3 genein papillary renal cell carcinoma.0ncogene.1997; 15 (18): 2233-2239.)。同時在前列腺組織中，也檢測到p54mb表達異常上調(Ishiguro H，Uemura H，Fujinami K，et al.55kDaNUCLEAR MATRIX PROTEIN(nmt55)mRNA IS EXPRESSED IN HUMAN PROSTATE CANCER TISSUEAND IS ASSOCIATED WITH THE ANDROGEN RECEPTOR.1nt.J.Cancer.2003;105:26-32.)。以上研究提示P54mb與多種腫瘤的發生發展密切相關，Nono作為p54mb的高度同源蛋白，我們推測其可能也參與了惡性腫瘤的發生和發展。
[0005]為了深入研究N0N0在腫瘤發生中的調節功能，本發明選取胃癌、肺癌和膠質瘤細胞模型，以RNAi為手段研究N0N0在胃癌、肺癌和膠質瘤發生和發展中的作用。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于公開與人八聚核苷酸結合蛋白表達基因相關的治療方法及藥物，以RNA干擾(RNAi)為手段研究八聚核苷酸結合蛋白表達基因在腫瘤細胞的存活和凋亡過程中的作用。
[0007]本發明所述八聚核苷酸結合蛋白表達基因為N0N0(non_P0U domain containing,octamer-binding)基因。
[0008]本發明第一方面，`以RNA干擾為手段，研究了 N0N0基因在腫瘤發生和發展中的作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括:向腫瘤細胞施用一種能夠特異性抑制N0N0基因的轉錄或翻譯，或能夠特異性抑制八聚核苷酸結合蛋白的表達或活性的分子，以此來抑制腫瘤細胞的生長、增殖、分化和/或存活。
[0009]所述腫瘤細胞選自其生長與八聚核苷酸結合蛋白的表達或活性相關的腫瘤細胞。較優的，所述腫瘤細胞選自胃癌、肺癌和膠質瘤之任一。
[0010]所述抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量為足夠降低N0N0基因的轉錄或翻譯，或者足夠降低N0N0蛋白的表達或活性的劑量。進一步的，所述N0N0基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0011]所述分子可選自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0012]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內切酶III制備的小干擾RNA CesiRNA)或者短發夾RNA (shRNA)。
[0013]所述雙鏈RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有N0N0基因的啟動子序列或N0N0基因的信息序列。
[0014]進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA( siRNA)。所述小干擾RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與NONO基因中15-27個連續的核苷酸序列基本相同。所述小分子干擾RNA能特異性結合靶序列所編碼的mRNA片段，并特異性沉默人NONO基因的表達。
[0015]進一步的，所述小干擾RNA的第一鏈序列與NONO基因中的靶序列基本相同。較優的，所述NONO基因中的靶序列含有 SEQ ID NO: 1-7中之任一序列。
[0016]所述NONO基因中的靶序列即為所述小分子干擾RNA特異性沉默NONO基因表達時，與所述的小分子干擾RNA互補結合的mRNA片段所對應的NONO基因中的片段。
[0017]較佳的，所述NONO基因來源于人。
[0018]本發明第一方面還公開了一種分離的人NONO基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0019]進一步的，所述腫瘤選自胃癌、肺癌或膠質瘤。
[0020]所述將分離的NONO基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內容:其一，將NONO基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將NONO基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。
[0021]所述將NONO基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將NONO基因作為RNA干擾作用的靶標，來研制針對腫瘤細胞的藥物或制劑，從而能降低腫瘤細胞內NONO基因的表達水平。
[0022]所述將NONO基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將NONO基因作為作用對象，對藥物或制劑進行篩選，以找到可以抑制或促進人NONO基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發明所述的NONO基因小分子干擾RNA (siRNA)即是以人NONO基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將NONO基因及其蛋白作為作用對象。
[0023]所述將NONO基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將NONO基因表達產物作為一項腫瘤診斷指標應用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0024]所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制NONO基因的轉錄或翻譯，或能夠特異性抑制NONO蛋白的表達或活性的分子，從而降低腫瘤細胞中NONO基因的表達水平，達到抑制腫瘤細胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0025]所述通過分離的NONO基因制備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0026]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內切酶III制備的小干擾RNA (esiRNA)或者短發夾RNA (shRNA)。
[0027]所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人NONO基因的轉錄或翻譯，或者足夠降低人NONO蛋白的表達或活性的劑量。以使人NONO基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95% 或 99%。
[0028]采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人NONO基因的表達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人NONO基因表達水平的物質給藥于患者。
[0029]本發明第二方面公開了一種降低腫瘤細胞中NONO基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含:
[0030]a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與NONO基因雜交的核苷酸序列；或者
[0031]b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與NONO基因雜交的核苷酸序列。 [0032]進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與NONO基因中15-27個連續的核苷酸序列基本相同。較佳的，所述第一鏈的序列與NONO基因中19-23個連續的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一鏈的序列與NONO基因中19、20或者21個連續的核苷酸序列基本相同。
[0033]更進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與NONO基因中的靶序列基本相同。
[0034]進一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與NONO基因中15-27個連續的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經加工后可成為小干擾RNA (siRNA)進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內源NONO基因表達的作用。
[0035]更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與NONO基因中的靶序列基本相同。
[0036]所述雙鏈RNA的第一鏈或所述shRNA的正義鏈片段與NONO基因中的靶序列基本相同，所述NONO基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默NONO基因表達時，被所述siRNA識別并沉默的mRNA片段所對應的NONO基因中的片段。
[0037]較佳的，所述NONO基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-7之任一序列。
[0038]進一步的，所述NONO基因來源于人。
[0039]所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0040]進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。更進一步的，所述小干擾RNA第一鏈的序列如 SEQ ID NO:19 所示，具體為 5’ -GCAGGCGAAGUCUUCAUUCAU-3’。
[0041]SEQ ID NO:19所示的siRNA為以SEQ ID NO:1所示的序列為RNA干擾靶序列設計的、針對人NONO基因的小干擾RNA的一條鏈，另一條鏈即第二鏈的序列與第一鏈序列互補，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細胞中內源NONO基因表達的作用。
[0042]進一步的，所述shRNA的莖環結構的序列可選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0043]更進一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 20所示，具體為:5’ -GCAGGCGAAGUCUUCAUUCAUUUCAAGAGAAUGAAUGAAGACUUCGCCUGC-3，。
[0044]shRNA經酶切加工后可成為siRNA，進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內源性人NONO基因表達的作用。
[0045]編碼本發明所述shRNA的基因片段的干擾慢病毒載體含有SEQ ID NO: 1-7中之任一序列及其互補序列。[0046]本發明第三方面，公開了一種NONO基因干擾核酸構建體，含有編碼本發明所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA。
[0047]所述的人NONO基因干擾核酸構建體可以是將編碼前述人NONO基因shRNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進一步的，所述NONO基因干擾核酸構建體為NONO基因干擾慢病毒載體。
[0048]本發明的NONO基因干擾慢病毒載體是將編碼前述NONO基因shRNA的DNA片段克隆入已知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述NONO基因干擾慢病毒載體經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細胞，進而轉錄出本發明所述shRNA，通過酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用于特異性沉默NONO基因的表達。
[0049]進一步的，所述NONO基因干擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤細胞中可被檢測的標記物的核苷酸序列；較優的，所述可被檢測的標記物如綠色熒光蛋白(GFP)0
[0050]進一步的，所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、 pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635, pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0051]本發明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構建的人N0N0基因干擾慢病毒載體,命名為 pGCSIL-GFP-N0 N0-siRNA。
[0052]本發明分離的核酸分子可用于制備預防或治療腫瘤的藥物，所述腫瘤為胃癌、肺癌或膠質瘤。
[0053]本發明的N0N0基因siRNA可用于抑制腫瘤細胞的增殖，進一步地可以用作治療腫瘤的藥物或制劑。N0N0基因干擾慢病毒載體則可用于制備所述N0N0基因siRNA。當用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳動物。具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
[0054]本發明第四方面，公開了一種N0N0基因干擾慢病毒，由前述N0N0基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細胞并產生針對N0N0基因的小分子干擾RNA，從而抑制胃癌、肺癌或膠質瘤腫瘤細胞的增殖。該N0N0基因干擾慢病毒可用于制備預防或治療腫瘤的藥物。
[0055]本發明第五方面，公開了一種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質含有前述的分尚的核酸分子，N0N0基因干擾核酸構建體，和/或N0N0基因干擾慢病毒。
[0056]進一步的，所述藥物組合物含有I~99被％所述雙鏈RNA、shRNA、N0N0基因干擾核酸構建體或N0N0基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0057]在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括:濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
[0058]本發明還公開了所述藥物組合物在制備治療胃癌、肺癌和膠質瘤之任一的腫瘤治療藥物中的應用。
[0059]該藥物組合物的應用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預防或治療對象體內腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對象中。
[0060]所述藥物組合物用于預防或治療對象體內腫瘤時，需要將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對象中。采用該方法，所述腫瘤的生長、增殖、復發和/或轉移被抑制。進一步的，所述腫瘤的生長、增殖、復發和/或轉移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
[0061]本發明第六方面，公開了一種用于降低腫瘤細胞中的NONO基因表達的試劑盒，所述試劑盒包括:存在于容器中的所述分離的核酸分子，NONO基因干擾核酸構建體，和/或所述的NONO基因干擾慢病毒。
[0062]綜上所述，本發明設計了針對人NONO基因的7個RNAi靶點序列，構建相應的NONORNAi載體，其中編碼序列SEQ ID NO:1的RNAi載體pGCSIL-GFP-N0N0_siRNA能夠顯著下調NONO基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCS I L-GFP-NONO-si RNA能夠靶向地將針對NONO基因的RNAi序列高效導入人胃癌SGC7901細胞、肺癌H1299細胞和膠質瘤U87細胞，降低NONO基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖能力。 因此慢病毒介導的NONO基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術治療方式。
[0063]本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人NONO基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中NONO基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]圖1:pGCSIL_GFP 質粒 DNA 圖譜
[0065]圖2 =NONO-RNAi慢病毒侵染人胃癌SGC7901細胞、肺癌H1299細胞和膠質瘤U87細胞5天后，NONO mRNA的表達水平顯著降低
[0066]圖3 =NONO-RNAi慢病毒侵染人胃癌SGC7901細胞5天后，引起細胞增殖抑制
[0067]圖4 =NONO-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞5天后，引起細胞增殖抑制
[0068]圖5 =NONO-RNAi慢病毒侵染人膠質瘤U87細胞5天后，引起細胞增殖抑制
【具體實施方式】
[0069]本發明涉及了一組針對人NONO基因的小分子干擾RNA (siRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人NONO mRNA編碼區序列作為siRNA的靶位點，根據靶位點中連續的10-30 (優選15-27，更優選19-23)個堿基序列設計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構建表達上述siRNA的核酸構建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內源NONO基因的表達。
[0070]發明人發現，采用RNAi方法下調人NONO基因的表達后可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，這一研究成果表明NONO基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發明人進一步合成和測試了多種針對NONO基因的siRNA，篩選出了可有效抑制NONO的表達進而抑制人胃癌SGC7901細胞、肺癌H1299細胞和膠質瘤U87細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎上完成了本發明。
[0071]本發明提供了一系列干擾人NONO基因的小干擾RNA (siRNA)序列，構建了可特異性沉默NONO基因表達的慢病毒。本發明研究發現，針對人NONO基因設計的小干擾RNA及RNAi慢病毒，穩定并特異地下調NONO基因的表達，并有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發明表明NONO基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過RNAi方式沉默NONO基因的表達，可作為抑制腫瘤發展的有效手段。
[0072]本發明的設計思路為:
[0073]本發明通過如下方法來篩選獲得一種人NONO基因RNAi慢病毒:從Genbank中調取人NONO基因序列；預測siRNA位點；合成針對NONO基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構建表達NONO基因siRNA序列的RNAi質粒；將RNAi質粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(Packing Mix,Sigma-aldrich公司)共轉染人胚腎細胞293T，產生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默NONO基因的慢病毒。
[0074]基于上述方法，本發明提供了 7個干擾NONO基因的有效靶點(具體如SEQ IDNO: 1-7所示)，構建了特異干擾人NONO基因的慢病毒。
[0075]同時本發明還公開一種人NONO基因RNAi慢病毒(NONO-RNAi)及其制備與應用。
[0076]本研究發現，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低NONO基因在腫瘤細胞中的表達后，可以有效抑制腫瘤細胞的`增殖。本研究表明，NONO基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發生和發展中具有重要的生物學功能，NONO基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導的NONO基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0077]下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京:科學出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。
[0078]實施例1針對人NONO基因RNAi慢病毒的制備
[0079]1.篩選針對人NONO基因的有效的siRNA靶點
[0080]從Genbank調取ΝΟΝΟ (NM_007363)基因信息；利用上海吉凱基因化學技術有限公司的設計軟件Genechem設計針對NONO基因的有效的siRNA靶點。在NONO基因的編碼序列(CDS)區域內，每隔一個堿基起始獲得21個堿基的序列，表1列出了其中7條針對NONO基因的有效siRNA靶點序列。
[0081]表1靶向于人NONO基因的siRNA靶點序列
[0082]
SEQ ID NO TargetSeq起始位點
"IGCAGGCGAAGTCTTCATTCAT 469
【權利要求】
1.一種分離的人NONO基因在制備或篩選腫瘤治療藥物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自胃癌、肺癌或膠質瘤。
3.一種降低腫瘤細胞中NONO基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含: a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與NONO基因雜交的核苷酸序列；或者 b)shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與NONO基因雜交的核苷酸序列。
4.如權利要求3所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與NONO基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與NONO基因中的靶序列基本相同。
5.如權利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述NONO基因的靶序列含有SEQ ID NO: 1-7 中任一序列。
6.如權利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為小干擾RNA，該小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO:19所示。
7.如權利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO:20所示。
8.—種NONO基因干擾核酸構建體，含有編碼權利要求3-7任一權利要求所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段`，能表達所述shRNA。
9.如權利要求8所述NONO基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述NONO基因干擾核酸構建體為干擾慢病毒載體。
10.如權利要求9所述NONO基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，所述慢病毒載體選自:pLK0.1-pur。、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.1-puro-CMV-TagRFP, pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP,pLK0.l-puro-UbC-TagFP635> pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG-3xLac0> pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T_DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
11.一種N0N0基因干擾慢病毒，由權利要求9-10任一權利要求所述干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
12.一種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質含有權利要求3-7任一權利要求所述的分離的核酸分子，權利要求8-10任一權利要求所述N0N0基因干擾核酸構建體，和/或權利要求11所述的N0N0基因干擾慢病毒。
13.權利要求12所述藥物組合物在制備治療胃癌、肺癌或膠質瘤的腫瘤治療藥物中的應用。
14.一種用于降低腫瘤細胞中N0N0基因表達的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:存在于容器中的，權利要求3-7任一權利要求所述的分離的核酸分子，權利要求8-10任一權利要求所述NONO基因干擾核酸構建體，和/或權利要求11所述的NONO基因干擾慢病毒。
【文檔編號】C12N15/113GK103667430SQ201210349845
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】朱向瑩, 孫琴, 高博, 楊敏, 金楊晟, 瞿紅花, 曹躍瓊 申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司