專利名稱：攜帶fl基因重組質粒的納米陽離子脂質體、制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種可高效攜帶FL基因重組質粒的新型納米陽離子脂質體、制備方法及應用。
背景技術：
結腸癌是極為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率與死亡率逐年上升，嚴重威脅著人類的健康。手術治療作為傳統的治療手段之一，雖可以切除腫瘤病灶，但無法徹底清除體內所有的癌細胞，而殘存的癌細胞則可以引起腫瘤的復發與轉移。放療、化療作為手術治療有力的輔助治療手段，對清除殘留癌細胞、防止腫瘤的復發與轉移大有裨益，但因其本身存在的嚴重的毒副作用及癌細胞對其可能存在的不敏感性或抗藥性，使其臨床應用受到了很大的限制。 近年來，隨著分子生物學的迅猛發展，腫瘤的基因治療給人類克服腫瘤的威脅帶來了希望，眾多學者對結腸癌的基因治療進行了大量研究，但至今，在基因治療方面尚受諸多因素影響，效果并不理想。目前，以逆轉錄病毒和腺病毒等作為基因載體盡管轉染效率很高，但制備復雜、具有免疫原性，存在嚴重安全隱患且不能在體內反復應用等弊端，并不能成為一種滿意的基因載體。而非病毒載體采用人工合成的非生物活性材料攜帶、運輸核酸物質進入細胞內，目前最常用的非病毒基因載體是陽離子脂質體等。陽離子脂質體雖具有低毒、低免疫反應、可修飾性強等優點，但轉染效率仍較低，靶向分布不理想，穩定性較差。因此，如何制備安全、無毒副作用的基因載體，如何高效、靶向將目的基因運送到機體的靶部位發揮效應，從而起到分子水平治療的效果，仍是基因治療中一個亟待解決的難題。FL是一種膜蛋白，可調節造血干P祖細胞的增殖與分化，并可與多種細胞因子協同，提高造血功能。FL可促進樹突狀細胞(DC)、自然殺傷細胞(NK)、細胞毒T淋巴細胞(CTL)的增殖、分化與成熟，發揮其生物學效應，從而表現出抗腫瘤免疫作用，可顯著抑制腫瘤的生長和轉移。納米粒(Nanoparticles, NP)是近年發展起來的一類非病毒類載體。納米粒是粒徑10-500nm之間的固狀膠態粒子，它可增強基因耐核酸酶的能力，同時起到控釋作用，延長其在體內的有效作用時間，納米粒子還具有無毒，無免疫原性和可生物降解等優點，因其良好的組織穿透能力，極易被細胞吸收，因此作為基因治療的載體有著獨特的優越性。納米陽離子脂質體粒為一種人工合成的載體材料，可運載質粒DNA、蛋白質、縮氨酸及低分子量的化合物，可在體內生物降解，其人體內的安全性、細胞毒性等研究已得到了普遍的認可。陽離子脂質體納米粒包裹或吸附的治療基因一般在24h內經歷首次突發釋放，其后進入緩慢釋放的階段長達一月之久，并保持所負載質粒的結構和功能的完整性，使質粒持久的釋放和表達。陽離子脂質體納米粒有較大的比表面積，可在其表面連接靶向分子或促進細胞轉運的因子，從而實現基因治療的主動靶向性，因其獨特的優越性而備受重視。因此，納米陽離子脂質體同時具有緩釋作用和基因介導的雙重功能，是一種有著良好發展前景的一類非病毒類載體。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一是提供一種能夠攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體，可以在腫瘤細胞中釋放出FL基因重組體并表達FL，從而發揮抗腫瘤的效應，具有高效低毒等優點；目的之二在于提供所述可攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體的制備方法，操作簡便易行；目的之三在于提供所述能夠攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體在抑制腫瘤生長方面的應用。攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體，其特征是，依據靜電吸附原理，由Lipofectamine2000和攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cl-FL構成；所述攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cI-FL為將FL基因克隆至含有綠色熒光蛋白報告基因的pEGFP-c I載體中制·得。所述二者的最優比為8:1 (8 μ 1/1 μ g),其中Lipofectamine 2000以體積計,攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cl-FL以質量計。為達到上述目的，本發明的可高效在體內外轉染基因的新型納米級陽離子脂質體是通過以下方法制備的，該方法包括以下步驟(I)基因的合成化學合成FL基因序列(SEQ-I )，全長510bp，共編碼169個氨基酸殘基，將合成的基因進行序列測定。(2)重組質粒puc57-FL的制備將FL基因克隆至puc57載體的Sal I和BamH I之間，并將克隆有FL基因的重組質粒pUC57-FL進行酶切驗證及序列測定。(3)重組質粒puc57-FL亞克隆至含有綠色熒光蛋白報告基因的pEGFP_cl載體構建重組質粒pEGFP-cl-FL :以Sal I和BamH I分別對重組質粒puc57_FL及pEGFP-cl載體進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別回收酶切產物；將puc57-FL (帶有FL的片段)的酶切產物連接到pEGFP-cl載體酶切產物中，然后轉化大腸桿菌感受態細胞，提取質粒，經Sal I和BamH I雙酶切鑒定正確后，并對陽性菌種提取的重組質粒pEGFP-cl-FL進行測序。由于在重組質粒中含有綠色熒光蛋白報告基因，非常方便后續實驗中基因表達的檢測。(4)攜帶重組質粒陽離子納米脂質體的制備及檢測依據靜電吸附原理制備陽離子載基因脂質體，取Lipofectamine 2000 (以體積計)加入無血清RPMI1640培養基；取步驟(3)構建的重組質粒pEGFP-cl-FL (以質量計)用無血清RPMI1640培養基稀釋后，將兩者混勻后，然后室溫下孵育20±5min，即得攜帶FL基因重組質粒的納米陽離子脂質體。用瓊脂糖凝膠阻滯分析定性考察Lipofectamine 2000與重組質粒pEGFP-cl-FL結合率,并選擇最優比。應用原子力電鏡測定制備的載基因陽離子納米脂質體的粒徑及zeta電位等參數。可將本發明的可高效在體內外轉染基因的新型納米級陽離子脂質體放入潔凈的玻璃瓶中，用氮氣充填試管，將制備的納米陽離子脂質體保存于試管中置于4°C避光保存。本發明人經過反復實驗探索,使Lipofectamine 2000與重組質粒pEGFP_cl_FL分別按不同的比例室溫孵育，經過瓊脂糖凝膠電泳定性考察Lipofectamine 2000與重組質粒pEGFP-cl-FL的結合率，選擇最優比為8:1。我們將制備的攜帶FL基因的陽離子納米脂質體成功轉染樹突狀細胞，實驗中發現裸重組質粒基本沒有表達熒光蛋白，說明其沒有進入細胞內，基因沒有表達，而陽離子納米脂質體成功將FL基因很好的運載至細胞內，使基因在樹突細胞內得到很好的表達，且隨著培養時間的增加，蛋白表達量有所增加，證明了陽離子納米脂質體作為基因載體具有巨大的優越性。我們將轉染陽性的樹突狀細胞移植入構建的結腸癌動物模型，通過流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率和通過MTT法檢測細胞死亡率可以看出，FL基因組腫瘤細胞凋亡率和死亡率顯著高于對照組，細胞的增殖指數明顯低于對照組。因此，本發明的可高效在體內外轉染基因的新型納米級陽離子脂質體具有制備方法簡單、低毒、低免疫原性、緩釋、高效靶向的特性，特別適合于作為體內外轉染和基因治療的基因載體，在腫瘤及其他領域的基因研究方面具有良好的應用前景。


圖IpEGFP-cl載體的啟動子和多克隆位點。
圖2合成的puc57_FLT3L的序列測定結果。圖3pEGFP-cl_FL重組質粒Sal I和BamH I雙酶切鑒定圖。圖4Lipofectamine 2000 與 pEGFP-cl-FL 的復合物電鏡照片。圖5不同比例的Lipofectamine 2000與pEGFP-cl-FL結合的凝膠電泳分析，(I 代表裸 DNA，2_8 分別是 Lipo/DNA ( μ l/μ g) % 1:1,2:1,3:1,5:1,8:1, 10:1和 15:1,可見 Lipofectamine 2000 與重組質粒 pEGFP-cl-F 最優比是 8:1, Lipofectamine2000使DNA完全壓縮而滯留在點樣孔中)。圖6Lipofectamine 2000/DNA復合物轉染樹突狀細胞后24、48、72h熒光顯微鏡結
果O圖7DC細胞移植動物模型后各組腫瘤體積的測量。(圖中4條線自上而下分別為對照組，TRAIL基因組，FL基因組，FL/TRAIL混合組。)圖8實時熒光定量PCR檢測FL基因表達柱形圖。(8個柱形圖自左向右分別代表I: FL 組；2: TRAIL 組；3: FL/TRAIL 混合組；4:對照組· 5: FL 組；6: TRAIL 組；7: FL/TRAIL 混合組；8:對照組.)圖9應用Western-blot法檢測FL蛋白的表達。
具體實施例方式一、基因的合成I、FLT3L卿FL)基因合成合成FLT3L基因序列，并將該基因克隆至puc57載體的Sal I和BamH I之間。FLT3L基因全長510bp，共編碼169個氨基酸殘基。FLT3L基因的合成由上海生工生物工程技術有限公司完成。2、合成基因的驗證分別將克隆有FLT3L基因的重組質粒pUC57_FLT3L進行酶切驗證，并進行序列測定，以檢測其核苷酸序列與設計的是否完全一致(測定結果如圖2所示)。序列測定有上海英俊公司完成。3、DNA 酶切(I)將清潔干燥并經滅菌的Eppendorf管編號，用微量移液槍分別加入上述步驟質粒3 μ L, IOXTaq Bufferl. 5 μ L,再加入重蒸水使總體積為9 μ L,將管內溶液混勻后加入Sal I和BamH I各0. 5 μ L，用手指輕彈管壁使溶液混勻。使用限制性內切酶時應盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。(2)混勻反應體系后，將Eppendorf管置于37°C水浴保溫2 3h，使酶切反應完全。(3)停止反應，置于冰箱中保存備用。4、DNA凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。該技術操作簡便快速，當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出I IOng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。凝膠電泳步驟如下 (I)取5 X TBE緩沖液20mL加水至200mL，配制成O. 5 X TBE稀釋緩沖液，待用。(2)膠液的制備稱取O. 25g瓊脂糖，置于IOOmL錐形瓶中，加入25mL O. 5 X TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為1%瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜，以減少水分蒸發。(3)膠板的制備將膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持lmmol/L的間隙。(4)向冷卻至5(T60°C的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5yg/mL。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內加入O. 5XTBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。(5)加樣取10 μ L酶解液與2 μ L6X載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。(6)電泳加完樣后立即接通電源?？刂齐妷盒∮?V/cm，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到凝膠2/3時，停止電泳。(7)觀察在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察。DNA存在處可以見到桔紅色熒光條帶。5、重組質粒puc57-FLT3L亞克隆至pEGFP-cl載體(pEGFP-cl載體的啟動子和多克隆位點如圖I所示)。①酶切取兩個500yL EP管，一個加入pEGFP-cl載體，一個加入puc57-FLT3L載體，然后分別加入水、酶Sal I和BamH I及其buffer,用量如下pucy/m 6μ[pliUFF-cl2 μΙ
Sal IlμLSal II
BamH IIuLBamH IIfiL
IOxT Buffer3 μ IOxT Buffer3 μ
ddH:0IOfxLddH;014 suL
總計20 μL總計20 μι37 °C水浴酶切過夜。②瓊脂糖凝膠電泳，回收將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否出現帶有FLT3L片段的帶Γ50(Λρ)和線狀pEGFP-cl vector的帶，如有，用DNA片段快速純化/回收試劑盒分別回收FLT3L片段和線狀pEGFP-cl vector?；厥詹襟E(I)在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率(注切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷)。(2)估計膠條的重量，加3倍體積的Buffer QG (即IOOmg的膠加入300 μ L的Buffer QG)；(3)50°C溫浴IOmin直至膠完全溶解，溶液應該是淡黃色，若為橙色或紫色時，則需要加10 μ L 3mol/LNaAc (pH5. 0)，混勻，則溶液會轉變為黃色；(4)加等體積的異丙醇，混勻；(5)將溶液轉移到收集管的離心柱內，12000r/min離心Imin ；(6)倒去收集管內的液體，并將離心柱重新放于收集管內；(7)加O. 5mL Buffer QG于離心柱內，12000r/min離心lmin,倒去收集管內的液體，并將離心柱重新放于收集管內；(8)加O. 75mL Buffer WB于離心柱內，12000r/min離心lmin,倒去收集管內的液
體，并將離心柱重新放于收集管內；(9)高速離心2min (13000 14000r/min)后,將離心柱轉移于另一干凈的I. 5mL離心管內；(10)加入50yL Buffer EB或者超純水于離心柱的濾膜中央，靜置I 3min，10000r/min離心lmin,則溶液中含有目的DNA片段；(11)將DNA片段溶液置于_20°C保存。③連接
反應體系pEGFP-cl 載體2 μΕ
FLT3L 片段8 ^tL
IOxiigationBuffe1.5 μ
Τ4 DNA Iigase1.5 pL
IOxBSAi.5‘uL
CldH2O0.5 M.L
總計15 μι將混合體系在16 °C連接過夜。·④制備感受態及轉化I)、大腸桿菌感受態細胞的制備(I)取1%大腸桿菌E. coli DH5a接種于含50mL LB培養基的試管中，37°C振蕩培養過夜(250r/min)。(2)往一個2L的燒瓶中加入400mL LB培養液，再加入4mL過夜培養物，于37°C振蕩培養(250r/min) 3h 至 OD600 約為 O. 3。(3)將培養液分裝到8個50mL預冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5 10min，然后于 4°C，1600g 離心 7min。(4)細胞沉淀用IOmL冰冷的CaCl2溶液重懸，于4°C，IlOOg離心5min。(5)細胞沉淀用IOmL冰冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30min，于4°C，IlOOg離心5min。(6)用2mL冰冷的CaCl2溶液重懸各管細胞，然后按每管100 μ L的量分裝于預冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于_70°C。2)、連接產物轉化大腸桿菌(I)取新制備的一管感受態細胞，冰上30min左右解凍。(2)將感受態細胞和4ng質粒DNA混勻，冰浴30min。(3)將Ep管置于42°C水浴中熱擊90sec，立即置于冰上3 4min。(4)在Ep管中加800 μ L LB培養基混勻，37°C培養Ih。(5)4000g離心lmin，取O. ImL涂在含適當濃度抗生素的LB平板上，平板在37°C下正向放置30min以吸收過多的液體，然后倒置培養過夜。⑤挑菌:AMP培養基上長出了菌落，挑選幾個較大的周圍沒有雜菌的白色菌落，用牙簽分別挑取，分別放入裝有3mL的培養液的小管中，小管中加入了 3 μ L的Kana溶液，將小管放到搖床上，37°C培養一個晚上。⑥質粒DNA的小量制備(堿裂解法小量制備質粒DNA)(I)取I. 5mL培養物入微量離心管中，用微量離心機于4°C以最大轉速離心30sec，將剩余的培養物貯存于4°C。(2)離心結束，盡可能吸干培養液。(3)將細菌沉淀重懸于100 μ L預冷的溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。(4)加200 μ L新鮮配制的溶液II，顛倒數次混勻(不要劇烈振蕩)，并將離心管放置于冰上2 3min，使細胞膜裂解(溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清)。
(5)加入150 μ L預冷的溶液III，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3 5min。溶液III為中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀。(6)用小離心機于4°C以最大轉速離心lOmin，將上清液轉移到另一潔凈離心管中。(7)加入等量體積的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混合有機相和水相，然后用小離心機于4°C以最大速度離心2min。(8)小心移出上清到一新的潔凈微量離心管中，加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2 5min沉淀核酸，4°C離心12000g離心5min，收集沉淀的核酸。 (9)加ImL 70%乙醇于沉淀中并將蓋緊的試管顛倒數次，用小離心機于4°C以最大轉速離心Imin。棄上清,將沉淀在室溫下晾干。(10)沉淀溶于 20 μ L TE (含 RNaseA20 μ g/mL), 37 °C 水浴 30min 以降解 RNA 分子，-20°C保存備用。⑦酶切取500μ L的EP管，加入重組質粒3μ L、10 X Buffer T 1.5yL，再加入重蒸水使總體積為9 μ L，將管內溶液混勻后加入Sal I和BamH I各O. 5 μ L，放到37°C下水浴3h以上；⑧瓊脂糖凝膠電泳，檢查將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在GIS凝膠成像系統中檢測是否出現約500bp的帶，若有則初步證明FLT3L片段克隆到pEGFP-cl載體上了，同時將FLT3L片段連入pEGFP-c I載體中的陽性菌種送上海的英俊生物公司測序。pEGFP-c I-FL重組質粒Sal I和BamH I雙酶切鑒定圖如圖3所示，可見清晰地切出與FL基因大小(約510bp)相符的片段并與DNAmarker相符。二、陽離子載基因納米脂質體的制備I、陽離子載基因納米脂質體的制備依據靜電吸附原理制備陽離子載基因脂質體。首先取一定量的Lipofectamine2000至I. 5mL的EP管中，加入定量的無血清RPMI1640培養基，放置5min ;取一定量的重組質粒pEGFP-cl-FL用無血清RPMI1640培養基稀釋后，將兩者混合(注混勻時不能用槍吹打，用手指輕輕彈EP管使其混勻)，室溫孵育20min, Lipofectamine2000/重組質粒pEGFP-cl-FL復合物即制得，其電鏡照片見圖4。2、瓊脂糖凝膠的制備及使用方法按照文獻方法制備瓊脂糖凝膠并做適當改進。稱取O. 16g瓊脂糖于錐形瓶中，力口入20mlI X TAE稀釋液(Tris堿、EDTA、冰醋酸)，加熱至瓊脂糖沸騰溶解，即為O. 8%的瓊脂糖凝膠液，待冷卻至50 65°C時加入2μ I Goldview，輕輕混勻(注意不要產生氣泡)，然后將瓊脂糖凝膠液倒入插有模板梳的水平槽內，待凝固完全后，輕輕拔出模板梳，將裝有凝膠的平板放入電泳槽內，將外槽注滿TAE稀釋液，高于膠面I 2mm。采用移液器量取Iy IIoadingbuffer,加入9 μ I樣品，混勻，輕輕打入加樣孔中(注意不要溢出)，選擇電壓90V,時間25min進行電泳。3、Lipofectamine 2000 與重組質粒 pEGFP_cl_FL 最優比的考察量取7等份Lipofectamine 2000,與適量重組質粒pEGFP-cl-FL溶液室溫孵育 20min,使 Lipofectamine 2000 (以 Lipofectamine 2000 的體積計)與重組質粒pEGFP-cl-FL (以質量計)分別按不同的比例孵育，用瓊脂糖凝膠阻滯分析定性考察了Lipofectamine 2000與重組質粒pEGFP-cl-FL結合率(如圖5所示)，并選擇最優比為8:1(8μ l/lyg)。三、樹突狀細胞的培養及體外轉染試驗I、樹突狀細胞的分離、培養及鑒定將環磷酰胺由小鼠尾靜脈注射，取脾臟組織，加Tris-NH4CU rmCM-CSF/rmIL-4、TNF-Y等因子培養。相差顯微鏡下觀察細胞形態特點，掃描電鏡及透射電鏡下觀察細胞表面及超微結構。應用流式細胞儀分析細胞表面標記。2、載基因納米陽離子脂質體體外轉染試驗采用樹突狀細胞系評價Lipofectamine2000/pEGFP-cl-FL復合物的細胞轉染能力。 首先取2μ1 Lipofectamine2000至I. 5mL的EP管中，加入98 μ I的無血清RPMI1640培養基，放置5min ;取一定量的pEGFP-cl-FL用無血清RPMI1640培養基稀釋至100 μ I后，將兩者混合室溫放置20min，制得Lipofectamine2000/pEGFP-cl-FL納米陽離子脂質體復合物。同法取一定量的早已構建好的PDsRedl-Cl-TRAIL質粒作為對照基因與Lipofectamine2000 混合制得 Lipofectamine2000/pDsRedl-Cl-TRAIL 納米陽離子脂質體復合物。轉染前24h，在12孔培養板上接種樹突狀細胞數為IXlO5個/孔，用含有rmGM-CSF/rmIL4條件的完全培養基進行常規培養。當細胞約達到70 80%融合時，用PBS沖洗細胞2次，將樹突狀細胞分為3組，第一組于每孔中加入Iml由不含血清的培養基稀釋Lipofectamine2000/pEGFP-cl_FL復合物，第二組于每孔中加入Iml由不含血清的培養基稀釋Lipofectamine2000/pDsRedl-Cl-TRAIL復合物，第三組以轉染裸質粒的細胞作為對照組。置于37° C，5%C02孵箱中培養4h，移去介質，用PBS沖洗細胞2次，加入含有lmlrmGM-CSF/rmIL4條件的培養基，24h_72h，使進入細胞內的基因得以表達，利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。結果如圖6所示，實驗發現裸質?；緵]有表達熒光蛋白，說明裸質粒沒有入細胞內，基因沒有表達，而陽離子納米脂質體成功將FL基因很好的運載至細胞內，使基因在樹突細胞內得到很好的表達，且隨著培養時間的增加，蛋白表達量有所增加，證明了陽離子納米脂質體作為基因載體具有巨大的優越性。3、MTT法檢測轉染后樹突狀細胞對LOVO細胞的毒性取對數生長期的結腸癌LOVO細胞，分別加入用RPMI 1640培養基稀釋至不同濃度的轉染陽性的樹突狀細胞，加入MTT、DMS0，在免疫酶標儀上測定吸光度(OD)值，計算LOVO細胞相對增殖率(RGR)。陰性對照為1640培養液，陽性對照為聚丙烯酰胺單體溶液。結果顯示FL組LOVO細胞死亡率明顯高于對照組，FL組和對照組之間比較有顯著意義，P < O. 05(見表I)。表I : MTT法檢測轉染后樹突狀細胞對LOVO細胞的毒性作用(％，s 士 s)
Fl基因組 Traii對照基因組對照組24h25.41士2.05 24.84±2.625.50±0.47 48h 39.85士3.58 38.66±3.71 5.72±0.65
▲應用MTT法檢測轉染后樹突狀細胞對LOVO細胞的毒性作用，通過FL基因組、Trail對照基因組分別和對照組比較，可以看出FL基因組和Trail基因組腫瘤細胞死亡率均顯著高于對照組，P < O. 05。四、結腸癌動物模型腫瘤殺傷機制探討I、動物模型的建立及載基因樹突狀細胞的移植裸鼠腋下皮下注射LOVO細胞，20天左右注射部位出現明顯的種植瘤結節。觀察瘤結節的形狀，記錄瘤結節體積大小。收集陽性DC，調節DC密度，采用直接注射法自動物模型瘤體附近皮下不同部位注射lOOul。將動物模型隨機分為4組，一組注射攜帶FL基因的DC, 一組注射攜帶對照基因TRAIL的DC，另一組同時注射攜帶FL基因和TRAIL基因的DC，對照組注射等量含空白納米脂質體的DC。2、結腸癌動物模型腫瘤殺傷機制探討 ①腫瘤腫塊直徑變化的測定移植后第3、6、9、2和15天，分別測量各組裸鼠腫瘤的長軸(a)和短軸(b)，按公式V=ab2X π/6計算腫瘤體積，結果如圖7所示，對照組腫瘤體積增長最快，FL基因組腫瘤體積增長較慢。②腫瘤細胞中FLmRNA和TRAILmRNA的測定設計FL和TRAIL引物，用實時熒光定量PCR儀進行檢測FL和TRAIL基因在腫瘤細胞中的表達。引物及TaqMan探針由上海生物工程有限公司設計合成。結果如圖8所示，通過實時熒光定量PCR可以在FL組檢測到FLmRNA水平，而在對照組則沒有檢測到FL mRNA。③移植后LOVO細胞凋亡情況的檢測應用流式細胞儀FCM技術，取腫瘤細胞離心后加碘化丙啶Iml染色30分鐘，過濾后上機檢測。結果顯示，FL基因組腫瘤細胞凋亡率顯著高于對照組，而腫瘤細胞的增殖指數明顯低于對照組(見表2)。表2 :注射載基因DC后腫瘤細胞凋亡率和增值指數的變化
Fl基因組Trail對照基因組復合基因組對照組凋亡率(％)8.72±1.67 7.31士1.4940.86±3.17 0.69±0.51
增值指數(％)31.07±1.68 33.21士 1.52 15.41 士1.38 36.54士 2.25▲應用流式細胞儀分析腫瘤細胞的凋亡率和增值指數，通過FL基因組、Trail對照基因組分別和對照組比較，可以看出FL基因組和Trail基因組腫瘤細胞凋亡率均顯著高于對照組，而腫瘤細胞的增殖指數明顯低于對照組，P < O. 05 ;而復合基因組和對照組比較，P < O. 01.④MTT法檢測細胞死亡率分別取轉染后第24h、48h、96h腫瘤細胞，加入MTT及無酚紅RPMI-1640，繼續孵育后加入DMS0，在酶聯免疫儀上測定光吸收值，按下列公式計算細胞死亡率細胞死亡率=(I-實驗組平均D值/對照組平均D值)χ100%ο實驗結果顯示移植后第24h. 48h和96h，FL基因組腫瘤細胞死亡率顯著高于對照組，且隨時間增加腫瘤細胞死亡率也增高(見表3)。表3 =MTT法檢測注射載基因DC后腫瘤細胞死亡率
權利要求
1.攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體,其特征是，由Lipofectamine2000和攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cl-FL構成；所述攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cl_FL為將FL基因克隆至pEGFP-cl載體中制得。
2.如權利要求I所述的攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體，其特征是，Lipofectamine2000和攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cl-FL的比例為8:1，其中Lipofectamine 2000以體積μ I計,攜帶FL基因的重組質粒pEGFP_cl_FL以質量μ g計。
3.一種制備權利要求I或2所述的攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體的方法，其特征是， (1)基因的合成化學合成如SEQ-I所述的FL基因序列，將合成的基因進行序列測定； (2)重組質粒puc57-FL的制備將FL基因克隆至puc57載體的SalI和BamH I之間，并將克隆有FL基因的重組質粒pUC57-FL進行酶切驗證及序列測定； (3)重組質粒puc57-FL亞克隆至pEGFP-cl載體構建重組質粒pEGFP-cl-FL:以Sal I和BamH I同時對重組質粒puc57_FL及pEGFP-c I載體進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別回收酶切產物；將puc57-FL的酶切產物連接到pEGFP-c I載體酶切產物中，然后轉化大腸桿菌感受態細胞，提取質粒，經Sal I和BamH I雙酶切鑒定正確后，并對陽性菌種提取的重組質粒pEGFP-cl-FL進行測序； (4)攜帶重組質粒陽離子納米脂質體的制備取Lipofectamine2000加入無血清RPMI1640培養基；取步驟(3)構建的重組質粒pEGFP-c I-FL用無血清RPMI1640培養基稀釋后，將兩者混勻后，然后室溫下孵育20±5min，即得攜帶FL基因重組質粒的納米陽離子脂質體。
4.權利要求I或2所述的攜帶FL基因重組體的納米陽離子脂質體在抑制腫瘤生長方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種攜帶FL基因重組質粒的納米陽離子脂質體、制備方法及應用，屬于生物醫藥領域。該脂質體是依據靜電吸附原理，由Lipofectamine 2000和攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cl-FL構成；所述攜帶FL基因的重組質粒pEGFP-cl-FL為將FL基因克隆至含有綠色熒光蛋白報告基因的pEGFP-c1載體中制得。本發明的納米級陽離子脂質體具有制備方法簡單、低毒、低免疫原性、緩釋、高效靶向的特性，特別適合于作為體內外轉染和基因治療的基因載體，在腫瘤及其他領域的基因研究方面具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102876697SQ20121035270
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者孫念峰, 田愛玲, 胡三元, 陳景波, 黃慶先 申請人:孫念峰