一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，包括以下步驟：（1）以紅霉素生產菌為出發菌株，將紅霉素生產菌在斜面培養基上預培養6-7天。（2）預培養后的紅霉素生產菌進行紫外線誘變：用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下照射2分鐘進行誘變，誘變后立即涂培養基平板。（3）誘變后活菌落進行離子束輻照誘變：誘變溫度為25℃，誘變劑量為50Gy，誘變后再經培養基平板初篩和搖瓶發酵方法復篩，所得活菌落即為高產的突變紅霉素生產菌。通過本方法，得到高產的突變紅霉素生產菌，實驗結果證明，誘變處理后的突變紅霉素生產菌抗生素產量得到提高，100L發酵罐放罐效價達到15600u/ml，發酵液中A組分含量由原來的72%提高到85%，B組分含量由原來的2.7%降低到1.1%，為發酵液的后續處理帶來了極大方便，產品質量和純度得到提高，降低了生產成本。
【專利說明】一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002]紅霉素屬大環內酯類抗生素，具有廣譜抗菌作用。對G+菌有強大抗菌作用，尤其對耐青霉素的金葡菌有效。對立克次體、支原體、螺旋體有較強的抑制作用。對阿米巴原蟲、滴蟲也有抑制作用。
[0003]紅霉素是白色或類白色的結晶性粉末，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類、丙酮、氯仿、酯類(如乙酯、丁酯、戊酯等)，微溶于乙醚。紅霉素在水中極微溶解，其溶解度隨溫度的升聞而減小，以55°C時為最小。
[0004]紅霉素是從紅霉素鏈霉菌的培養液中分離出來的一種堿性抗生素，我國于1957年試制成功后并逐步投入生產。后來從發酵液中分離出來紅霉素A、B、C、D、E等組分，其中以紅霉素A為主要組分， 抗菌活性強、且毒副作用較小；其它組分抗菌活性弱，而毒副作用又較A大。
[0005]紅霉素B的理化性狀與紅霉素A很相似，溶點為198°C，紫外吸收峰在286nm (甲醇)處。比較難溶于水，極易溶于乙醚、丙酮、氯仿和乙酸乙酯，并且和酸類結合成的鹽易溶于水。
[0006]通常所稱的紅霉素即指紅霉素A及其鹽類。但是在紅霉素生產中，發酵液中同時含有紅霉素A、B、C、D、E等組分，這為后續的提純處理增加了困難，而且紅霉素B的含量控制是產品質量控制的重要指標。國內外抗生素工業發展歷史證明，菌種的不斷更新換代，是生產水平大幅度提高，是抗生素工業迅速發展的關鍵之一。由于新的高產菌株不斷用于生產，所以青霉素、鏈霉素、土霉素、四環素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢菌素C等產品的發酵單位，都比他們的原始菌種提高幾十倍、幾百倍、甚至幾千倍，與此同時，菌種選育在提高產品質量、擴大品種、改善工藝條件等方面也發揮了重大作用。菌種選育是抗生素工業生產及科研工作的主要環節，既是關鍵又是基礎。
[0007]根據誘發突變機理，利用物理或化學的因素處理微生物群體細胞，使其中部分細胞的遺傳物質發生改變，從而引起微生物的性狀變異。然后從群體中挑選出少數具有優良性狀的菌株。經特性考察和復試用于生產，這個過程稱為誘變育種。誘變育種的主要環節是:以合適的誘變劑處理大量而分散的微生物細胞(一般處理孢子懸液)，在引起絕大多數細胞致死的同時，使變異率大大提高，然后通過有效的篩選方法淘汰負變菌株，留用變異幅度最大的正變菌株。目前誘變育種是提高菌種生產能力、提高產品質量、擴大品種和簡化工藝的主要育種方法。
[0008]紅霉素是紅霉素生產菌在發酵過程中產生的一種次級代謝產物，隨著發酵周期的延長，紅霉素在發酵液中含量逐步增多，與此同時，其他次級代謝產物也在不斷的積累，這些都使發酵液中的環境越來越不利于菌體產素，對產量的提高有著較大的制約。紅霉素生產菌經過誘變后，利用含有紅霉素的培養基篩選，篩選出的菌體對自身所產紅霉素的耐受程度提高，從而使菌體的產素能力以及產量得到提高。誘變后的菌株用于生產，發酵液中A組分含量提高，B組分含量降低，為發酵液的后續處理帶來了極大的方便，降低了雜質含量，使廣品質量得到提聞。

【發明內容】

[0009] 目前，提高紅霉素生產菌產紅霉素的能力，仍以誘變育種為主要手段。針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法。
[0010]本發明的一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其包括以下步驟:
(1)將紅霉素生產菌在斜面培養基上培養，培養6-7天后獲得新鮮成熟孢子；
(2)將紅霉素生產菌新鮮成熟斜面制成孢子懸液，孢子量在IX IO6個/mL，取5mL孢子懸液移至培養皿中，于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射2分鐘，誘變后進行梯度稀釋立即涂培養基平板；
(3)挑取步驟(2)誘變后活菌落進行離子束輻照誘變:誘變溫度為25°C，誘變劑量為50Gy，誘變后進行梯度稀釋涂培養基平板初篩。挑單菌落至斜面培養基，34 土 1°C，培養6_7天，再經搖瓶發酵方法進行復篩，所得突變菌即為高產紅霉素生產菌。
[0011](4)步驟(1)或步驟(3)斜面養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g,氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。步驟(2)的平板培養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。
[0012](5)步驟(3)平板培養基配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。
[0013](6)步驟(3)的搖瓶發酵是將紅霉素生產菌在種子培養基中培養成熟的種子液接入發酵搖瓶培養基。
[0014](7)步驟(3)種子培養基配方為:玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g，硫酸銨1.2g,硝酸銨1.2g,氯化鈉3g,玉米楽；7.5g,分析純碳酸韓6g,豆油2ml,加水定容至1000ml，調pH值至7.0。種子液培養條件為:34± 1°C，220轉/分，振蕩培養42_46h。
[0015](8)搖瓶發酵培養基配方為:玉米淀粉18g，糊精24g，中溫黃豆餅粉18g，硫酸銨2g，輕質碳酸鈣6g，豆油4ml，紅霉素標準品20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。
[0016](9)按照搖瓶發酵培養基配方配制搖瓶發酵液50mL，放入500mL帶擋板的三角瓶中。
[0017](10)將培養成熟的紅霉素生產菌種子液5mL接入發酵搖瓶中，34土 TC，260轉/分，振蕩培養7天左右，得紅霉素，利用HPLC測定效價。
[0018](11)發酵罐培養基配方為:玉米淀粉1.5kg，糊精0.25kg，中溫黃豆餅粉1.29kg，硫酸銨0.1kg,氯化鈉0.15kg,玉米衆0.85kg,輕質碳酸韓0.3kg,豆油350ml,加水定容至60L，調 pH 值至 7.0。
[0019](12)將培養成熟的紅霉素生產菌種子液按照10% (V/V)的接種量接入100L發酵罐中，34± I °C，培養7天左右，得紅霉素，利用HPLC測定效價。
[0020]本發明的優點:本發明通過兩種誘變、兩次篩選，得到對較高濃度紅霉素充分耐受的突變紅霉素生產菌。提高了紅霉素生產菌對自身所產抗生素的耐受性，使菌體穩定產素期延長，從而使菌體的產素能力以及產量得到提高。誘變后的菌株用于生產，發酵液中A組分提高，B組分降低，為發酵液的后續處理帶來了極大的方便，更重要的是降低了雜質含量，使產品質量得到提高，IOOL發酵罐放罐效價達到15600 u/ml，發酵液中A組分含量由原來的72%提高到85%，B組分含量由原來的2.7%降低到1.1%，為發酵液的后續處理帶來了極大方便，產品質量和純度得到提高，降低了生產成本。
【具體實施方式】
[0021]普通紅霉素生產菌在發酵過程中，隨著發酵周期的延長，次級代謝產物不斷的積累，發酵液中的環境變得不利于紅霉素生產菌的生長和產素，穩定產素的時間相對較短。將紅霉素生產菌誘變后會形成表型各異的紅霉素生產菌突變庫，其中很可能含有少量對自身所產抗生素耐受者，關鍵是將這部分在突變庫中占極少比例的自身所產抗生素耐受型突變紅霉素生產菌從大量無義突變中篩選出來，如果自身所產抗生素耐受型突變紅霉素生產菌確實在突變庫中存在，將突變庫接入高濃度紅霉素培養基后，自身所產抗生素耐受型突變紅霉素生產菌就會生長，而大量無義突變紅霉素生產菌則死亡，從而通過誘變及篩選得到自身所產抗生素耐受型突變紅霉素生產菌。
[0022]以下通過實施例進一步對本發明進行描述:
實施例1:
第一次誘變與篩選:將紅霉素生產菌在斜面培養基上培養，培養6-7天后獲得新鮮成熟孢子；利用紅霉素生產菌新鮮成熟斜面制IOml孢子懸液，孢子量在I X IO6個/mL，分成兩份。
[0023]取一份(作為對照)涂 平板培養基，平板培養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品15g，加水定容至1000ml，調pH值至
7.2，分析純碳酸鈣2.5g。培養6-7天，顯示紅霉素生產菌未生長。
[0024]另取一份(作為誘變份)孢子懸液移至培養皿中，于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射2分鐘，誘變后進行梯度稀釋立即涂培養基平板，平板培養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。在平板上生長的菌落即為初次誘變成功的能耐受1.5%紅霉素的突變紅霉素生產菌。
[0025]第二次誘變與篩選:對第一次誘變成功的能耐受1.5%紅霉素的初次突變紅霉素生產菌進行離子束輻照誘變。將初次突變紅霉素生產菌在斜面培養基上培養，培養6-7天后獲得新鮮成熟孢子；利用初次突變紅霉素生產菌新鮮成熟斜面制IOml孢子懸液，孢子量在IX IO6個/mL，分成兩份。取一份(作為對照)涂平板培養基，平板培養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g,硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。培養6_7天，顯示紅霉素生產菌未生長。一份(作為誘變份)進行離子束輻照誘變，誘變溫度為25°C，誘變劑量為50Gy。誘變后進行梯度稀釋立即涂培養基平板，平板培養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。在平板上生長的菌落即為再次誘變成功的能耐受2.0%紅霉素的突變紅霉素生產菌。將第二次篩選出的耐自身所產抗生素的紅霉素生產菌進行遺傳穩定性試驗，共轉接10代，證明其是否是遺傳穩定的耐自身所產抗生素的突變紅霉素生產菌。將第二次篩選出的耐自身所產抗生素的紅霉素生產菌和初次突變紅霉素生產菌分別接入種子瓶培養基，種子培養基配方為:玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g，硫酸銨1.2g，硝酸銨1.2g，氯化鈉3g,玉米衆7.5g,分析純碳酸Ii6g,豆油2ml，加水定容至1000ml,調pH值至7.0。34±1°C,220轉/分，振蕩培養42-46h。按照搖瓶發酵培養基配方配制搖瓶發酵液50mL，放入500mL帶擋板的三角瓶中。將第二次篩選出的耐自身所產抗生素的紅霉素生產菌和初次突變紅霉素生產菌在種子培養基中培養成熟的種子液接入發酵搖瓶培養基，搖瓶發酵培養基配方為:玉米淀粉18g，糊精24g，中溫黃豆餅粉18g，硫酸銨2g，輕質碳酸鈣6g，豆油4ml，紅霉素標準品20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。34± 1°C，260轉/分，振蕩培養5天左右，顯示初次突變紅霉素生產菌未能生長，菌絲斷裂嚴重，自溶，第二次篩選出的耐自身所產抗生素紅霉素生產菌生長。
[0026]實施例2: 將第二次篩選出的耐自身所產抗生素的紅霉素生產菌的種子液，接入發酵搖瓶培養基中，34 ± I °C，260轉/分，振蕩培養7天左右，紅霉素含量達到8200u/ml。
[0027]普通的紅霉素生產菌用此方法，紅霉素含量只達到5600u/ml。
[0028]實施例3:
將第二次篩選出的耐自身所產抗生素的紅霉素生產菌的種子液，接入含100L發酵罐中培養，34 ± I °C，7天左右，放罐效價可達到15600u/ml，發酵液中A組分含量由原來的72%提高到85%，B組分含量由原來的2.7%降低到1.1%。
[0029]普通的紅霉素生產菌用此方法，紅霉素含量只達到8900u/ml。
[0030]最后，還需注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然，本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征依次包括以下步驟: (1)將紅霉素生產菌在斜面培養基上培養，34土 1°C，培養6-7天后獲得新鮮成熟孢子； (2)將紅霉素生產菌新鮮成熟斜面制成孢子懸液，孢子量在IX IO6個/mL，取5mL孢子懸液移至培養皿中，于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射2分鐘，誘變后進行梯度稀釋立即涂培養基平板； (3)挑取步驟(2)誘變后活菌落進行離子束輻照誘變:誘變溫度為25°C，誘變劑量為50Gy，誘變后進行梯度稀釋涂培養基平板初篩；挑單菌落至斜面培養基，34土 1°C，培養6_7天，再經搖瓶發酵方法進行復篩，所得突變菌即為高產的紅霉素生產菌。
2.根據權利要求1所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:步驟(1)或步驟(3)斜面養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g ;步驟(2)的平板培養基的配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。
3.根據權利要求1所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:步驟(3)是將步驟(2)誘變后的活菌落在斜面培養基上培養6-7天后制成孢子懸液，進行離子束輻照誘變。
4.根據權利要求1所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:步驟(3)平板培養基配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，紅霉素標準品20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g ;搖瓶發酵培養基配方為:玉米淀粉18g，糊精24g，中溫黃豆餅粉18g，硫酸銨2g，輕質碳酸鈣6g，豆油4ml，紅霉素標準品20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。
5.根據權利要求3所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:其所用培養基配方為:可溶性淀粉6g，玉米漿7.2g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。
6.根據權利要求1所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:步驟(3)的搖瓶發酵是將紅霉素生產菌在種子培養基中培養成熟的種子液接入發酵搖瓶培養基。
7.根據權利要求6所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:種子培養基配方為:玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g，硫酸銨1.2g，硝酸銨1.2g,氯化鈉3g,玉米衆7.5g,分析純碳酸|丐6g,豆油2ml,加水定容至1000ml,調pH值至7.0 ;種子液培養條件為:34±1°C，220轉/分，振蕩培養42_46h。
8.根據權利要求6所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:按照搖瓶發酵培養基配方配制搖瓶發酵液50mL，放入500mL帶擋板的三角瓶中。
9.根據權利要求6所述的通過紅霉素生產菌誘變提高抗生素產量的方法，其特征在于:將培養成熟的紅霉素生產菌種子液5mL接入發酵搖瓶中，34±1°C,260轉/分,振蕩培養7天左右，得紅霉素，測定效價。
【文檔編號】C12N15/01GK103667248SQ201210363098
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月26日 優先權日:2012年9月26日
【發明者】張麗麗, 于新令, 王鳳灘 申請人:山東方明藥業集團股份有限公司