專利名稱：刀鱭性別特異srap標記帶的篩選方法及性別鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種刀鱭性別特異SRAP標記帶的篩選方法及性別鑒定方法，屬于漁業生物技術領域。
背景技術：
刀魴(<Sbi7ia ectenes Jordan et Seale)又名長頜魴,俗稱刀魚、毛刀魚，隸屬鯡形目(Clupeiformes),鯡科(Clupeidae),魴屬(Coilia)。其肉質細嫩,味道鮮美,是長江中下游重要的洄游性經濟魚類。由于多年持續高強度捕撈及水域環境污染等原因，刀鱭自然資源量銳減，洄游群體低齡化趨勢明顯。為了保護和利用刀鱭資源，近年來不少科研單位開始嘗試刀鱭的池塘養殖和人工繁殖。要實現刀鱭的人工繁殖，需要對灌江納苗養殖的刀鱭后備親魚進行雌雄配對和注射催產激素。刀鱭的性成熟期為2-3年，由于刀鱭雌雄魚 沒有明顯形態差異，只在繁殖季節成熟雌、雄魚腹部膨脹隆起的輪廓略有差異。傳統的性別鑒定方法主要靠解剖性腺組織和在成熟期進行外部形態觀察。但是，解剖法對魚體有致命的傷害，外部形態觀察只能在繁殖季節對性成熟親魚進行鑒定。對未達性成熟或非繁殖季節的成熟刀鱭，沒有有效的方法來進行性別鑒定；現有性別鑒定技術嚴重制約了刀鱭的人工繁殖及池塘養殖技術的發展。SRAP (sequence-related amplified polymorphism)是由美國加州大學 Li 與Quiros博士開發出的新型DNA分子標記技術。其原理是利用獨特的正反引物設計，對開放閱讀框進行擴增，因不同個體的內含子、啟動子與外顯子間隔區長度不同而產生多態性。該分子標記技術有簡便、快速、穩定、不需預知序列信息等優點，不僅廣泛應用于植物的遺傳多樣性分析、基因定位和遺傳圖譜構建等，近年來已在水產動物遺傳多樣性及相關分子標記的篩選等方面得到廣泛應用。

發明內容
本發明的目的提供一種刀鱭性別特異SRAP標記帶的篩選方法及分子水平的刀鱭性別鑒定方法，克服了刀鱭現有性別鑒定技術的局限和不足，提供了一種準確、便捷的性別鑒定方法。刀鱭性別特異SRAP標記帶的篩選方法，包括以下步驟
(I)采集刀鱭樣本，解剖魚體進行性別鑒定，分別提取雌、雄樣本總DNA ；(2)設計SRAP引物序列(見表I) 14條共49對，分別進行SRAP-PCR擴增，篩選出雌、雄性別特異標記帶SRAPl 和 SRAP2 ；
表I用于刀鱭SRAP-PCR反應的引物信息
權利要求
1.一種刀鱭性別特異SRAP標記帶的篩選方法，其特征在于包括以下步驟 (I)采集刀鱭樣本，解剖魚體進行性別鑒定，分別提取雌、雄樣本總DNA ；(2)設計SRAP引物序列(見表I) 14條共49對，分別進行SRAP-PCR擴增，篩選出雌、雄性別特異標記帶SRAPl 和 SRAP2， 正向引物(5' —3') me I TGAGTCCAAACCGGATA me2 TGAGTCCAAACCGGAGC me3 TGAGTCCAAACCGGAAT me4 TGAGTCCAAACCGGACC me5 TGAGTCCAAACCGGAAG me6 TGAGTCCAAACCGGTAA me7 TGAGTCCAAACCGGTCC 反向引物(5' — 3') eml GACTGCGTACGAATTAAT em2 GACTGCGTACGAATTTGC em3 GACTGCGTACGAATTGAC em4 GACTGCGTACGAATTTGA em5 GACTGCGTACGAATTAAC em6 GACTGCGTACGAATTGCA em7 GACTGCGTACGAATTCAA ； (3)回收性別特異標記帶SRAP1、SRAP2，測序。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述SRAP-PCR反應體系為25yL的PCR體系中含有Mg2+ I. 5 mmol/L、Taq酶O. 5U、模板DNA 60ng、dNTPs O. 20mmol/L、引物O. 2 μ mol/L0
3.一種刀鱭性別鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 (I)采集未知性別的刀鱭樣本，提取樣本總DNA ;(2)分別以引物對P1F/P1R、P2F/P2R為引物，以樣本總DNA為模板進行PCR擴增；(3)電泳檢測擴增產物，能擴增出如權利要求I中所述的SRAPl標記帶的即為雌刀鱭，能擴增出如權利要求I中所述的SRAP2標記帶的即為雄刀鱭。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的PCR反應體系為25μ L的PCR體系中含有 Mg2+ I. 5 mmol/L、Taq 酶 O. 5U、模板 DNA 60ng、dNTPs O. 20mmol/L、引物 O. 2 μ mol/L0
全文摘要
本發明公布了一種刀鱭性別特異SRAP標記帶的篩選方法及性別鑒定方法，通過49對引物對的SRAP-PCR反應，篩選刀鱭性別特異SRAP標記帶，然后用特異引物對擴增性別未知刀鱭的DNA樣品，通過能否擴增出相應特異條帶來鑒別刀鱭的性別。本發明克服了刀鱭現有性別鑒定技術的局限和不足，提供了一種準確、便捷的性別鑒定方法。
文檔編號C12N15/11GK102899321SQ20121038230
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者張敏瑩, 施煒綱, 徐東坡, 劉凱, 段金榮, 方第安 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心