發酵法木聚糖酶的一種制備方法
【專利摘要】本發明涉及發酵法木聚糖酶的一種制備方法，首先將從土壤樣品中分離的木聚糖酶產生菌株mtr127用低能離子注入和DEs進行誘變，篩選出高酶活菌株MJT36；其次將MJT36孢子懸液進行發酵，發酵后粗酶液經過分級沉淀、疏水層析、凝膠過濾層析、陰離子交換柱層析等技術進行純化，冷凍干燥后制得木聚糖酶，活性達到100000IU/g以上。本發明選育的菌株遺傳性能穩定、產酶活力高、工藝流程合理，提供了一種生產上可行的木聚糖酶的制備方法。
【專利說明】發酵法木聚糖酶的一種制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及高產木聚糖酶菌株的誘變選育及利用該菌株發酵制備高活性木聚糖酶的方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]國外對木聚糖酶的研究較早，應用與生產技術已逐漸趨向成熟，細菌、真菌和放線菌木聚糖酶都得到了廣泛而深入的關注和研究，并且在1992年就已實現了木聚糖酶的工業化生產。目前，國外對木聚糖酶的研究已達到了分子水平，研究工作主要集中在對微生物木聚糖酶的誘導與調節機理研究，以及酶的提純、鑒定方法、木聚糖酶基因分子的克隆和表達等。自上世紀七十年代末開展木聚糖酶基因的研究工作以來，已有150多種來自真菌和細菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達。
[0003]我國在·木聚糖酶方面的研究起步較晚，但發展迅速。目前，我國對木聚糖酶的研究大多停留在產酶菌株的篩選和馴化、木聚糖酶的純化和理化性質研究方面，部分課題已涉及木聚糖酶的分子生物學研究、木聚糖酶基因克隆、表達和重組。不同菌株產木聚糖酶的能力存在差異，對木聚糖酶分離提純工藝開展深入細致的研究，為我國木聚糖酶制劑生成提供新的酶源。上世紀八十年代初期，中國科學院微生物所在張樹政院士的帶領下，開始了我國對木聚糖酶的早期研究工作，首次從海率曲酶(Aspergillus phoenicis)中純化得到了四種木聚糖酶:酶1、酶I1、酶III和酶IV，并深入研究了活力較高的組分酶III的酶學性質。山東大學微生物系國家重點實驗室研究獲得產酸性木聚糖酶的菌株黑曲霉An-76和產堿性木聚糖酶的菌株嗜堿細菌Cb-2，搖床試驗產木聚糖酶分別為350u/mL和300u/mL。無錫江南大學早在2000年就已報道:經UV和NTG方法誘變篩選出一株假單細胞菌，命名為WLUN024,發酵初始PH6.5-8.5，發酵最適溫度37 °C。
[0004]木聚糖酶的純化技術與純度是決定其生產成本及市場競爭力的重要因素。在傳統工藝中，微生物產木聚糖酶大部分是通過色譜法得到純化。雖然色譜法具有較高的分辨率，但多步純化耗時、回收率低，不適合高純度木聚糖酶的產業化生產。目前，研究者在研究基于雙水相純化技術(Aqueous Two-Phase System, ATPS)的衍生技術、三相分離體系(Three-phase partitioning, TPP)和擴張床吸附技術(Expanded bed adsorption, EBD)。Aparna等通過TPP純化Aspergillus niger木聚糖酶,活性回收率達60%,純化倍數達95倍。Roy等先將Aspergillus niger木聚糖酶用8M尿素/IOOmM 二硫蘇糖醇變性,再進行TPP純化，木聚糖酶達到了 93%的活性回收率和21倍純化，且實現了該酶變性后的復性。Santos等嘗試用擴張床吸附技術純化木聚糖酶，雖然最大只有21.8%的活性回收率和30倍純化，但該技術有經濟、省時、木聚糖酶發酵液不需沉淀澄清等優點。
[0005]隨著基因突變技術和蛋白質高級結構研究技術的進展，大量性質各異的木聚糖酶，尤其是在極端微生物中獲得的具有極端性質的木聚糖酶，有望使木聚糖酶的結構與功能研究取得突破性進展。可以預期，在微生物學、生物化學、細胞生物學、分子生物學、動物營養學等學科的協作下，不久的將來，性能更加優良，技術更加成熟，使用更加有效，效益更加明顯的木聚糖酶將在飼料、食品、造紙、紡織、醫藥及能源等領域發揮更大的作用。
[0006]目前，木聚糖酶的工業化生產與廣泛應用還受到制約，如應用在紙漿漂白過程中的木聚糖酶需要具有耐高溫、耐堿以及分子量低的特性，但絕大多數微生物的木聚糖酶為中低溫或偏酸性，在工業應用上收到了很大限制。當前構建木聚糖酶基因工程高產菌至今尚未取得突破性進展，因此，采用傳統的物理或化學方法進行誘變育種以及尋找合適的發酵工藝條件，仍然是發酵法生產木聚糖酶和改變其性質應用于工業化生產的重要手段之
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[0007]本發明采用現代誘變育種方法，在短時間內篩選出一株產木聚糖酶酶量高且性能穩定的高產菌株，研究該高產菌株生產木聚糖酶的發酵工藝和分離純化工藝，為進一步開發和利用木聚糖酶提供科學依據。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種由微生物菌種發酵液產生、分離純化制備高酶活木聚糖酶的新工藝。
[0009]本發明所述的木聚糖酶的制備方法由如下步驟組成:
[0010]1、高產菌株的選育
[0011]采用低能離子注入和硫酸二乙酯(DES)復合誘變處理從土壤樣品中分離的木聚糖酶產生菌株mtr 127。注入離子選擇誘變育種常用的N+，注入離子能量為lOKev、15Kev，N+注入量為 5.6 X IO14 ions/cm2、1.12 X IO15 ions/cm2、1.62 X 1015ions/cm2、2.12 X IO15 ions/cm2,2.62X IO15 ions/cm2 共 5 個處理，DES 溶液選擇 0.01%,0.05%的濃度。
[0012]2、發酵培養基組分和培養條件的確定
[0013]利用誘變后的高產菌株MJT36(16S rDNA鑒定為類芽孢桿菌)(CGMCC N0.6410)發酵制取木聚糖酶，同時對發酵條件進行優化。麩皮量對酶活的影響:選擇1、1.5、2、2.5、3g添加量接菌培養72h，其他條件不變。碳源對酶活的影響:在液體發酵培養基中添加0.1%的葡萄糖、蔗糖、木糖、木聚糖、淀粉接菌培養72h，其他條件不變。氮源對酶活的影響:在液體發酵培養基中添加1%的蛋白胨、草酸銨、酵母粉、硫酸銨、檸檬酸三銨、尿素接菌培養72h，其他條件不變。吐溫-80比例對酶活的影響:分別添加0、0.1%,0.2%,0.3%,0.4%Bi溫-80，接菌培養72h，其他條件不變。pH對酶活的影響:選擇pH為4、5、6、7、8等5個梯度接菌培養72h，其他條件不變。搖瓶裝液量對酶活的影響:添加30、40、50、60、70、80mL液體發酵培養基接菌培養72h，其他條件不變。培養時間對酶活的影響:選擇60、72、84、96h接菌培養，其他條件不變。
[0014]3、木聚糖酶發酵液的分離純化
[0015]粗酶液的制備:發酵液4000r/min低溫離心15min，收集上清液為粗酶液。硫酸銨沉淀:取IOmL上清液，加入固體硫酸銨邊攪拌至飽和度為50%、55%、60%、65%、70%、75%，4°C過夜。于4°C、8000r/min離心15min，收集沉淀，4°C保存備用。疏水層析:用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解上述沉淀，加入固體硫酸銨使其終濃度為0.8mol/L，再于8000r/min離心IOmin,上清液加入到用起始緩沖液平衡好的Phenyl-Sepharose CL-4B、Phenyl-Sepharose 6FF>Pheny1-Sepharose 4FF 疏水柱中，依次用含 0.8,0.4 和 0mol/L 硫酸銨緩沖液階段洗脫(流速0.4?0.6mL/min)，DNS法測定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。凝膠過濾層析:將收集的酶液用硫酸銨按55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %飽和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C離心15min,將沉淀用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解,力口入到用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡好的S印hadex G_25、G_50、G-70分子篩柱中，同一緩沖液洗脫(流速0.4?0.6mL/min)和收集(I管/lOmin)，檢測酶活，合并具有較高酶活性的洗脫液。陰離子交換層析:將收集的酶液用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液透析24h，濃縮后上DEAE-Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱,用含 O ?0.2mol/L NaCl 的 ρΗ6.8、20mmol/L 憐酸鹽緩沖液進行梯度洗脫(流速0.4?0.6mL/min)和分部收集(I管/5min),合并具有較高酶活性的洗脫液。
[0016]洗脫液用S印hadexG-25脫鹽、聚乙二醇濃縮，冷凍干燥后制得木聚糖酶。
[0017]本發明選育菌株遺傳性能穩定、產酶活力高、工藝流程合理，技術先進可靠，操作簡單，總體技術達國際先進水平。
【具體實施方式】
[0018]實施例1發酵法木聚糖酶的一種制備方法，按以下步驟依次進行:
[0019]1、低能離子注入-DES復合誘變
[0020]單孢子懸浮液的制備:取培養成熟的新鮮斜面，加入IOmL無菌水，用接種鏟刮下孢子，用玻璃珠將孢子打散后，再用濾紙過濾，即得到單孢子懸浮液，調整孢子濃度為IO6個
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[0021]低能離子注入誘變:取0.1mL孢子懸`液于無菌空平皿中涂均勻，用無菌風吹干。然后放入離子注入機的靶室進行離子注入。注入離子選擇誘變育種常用的N+，注入離子能量為 10Kev、15Kev, N+注入量為 5.6X IO14 ions/cm2、l.12X 1015ions/cm2、1.62X IO15 ions/cm2、2.12X IO15 ions/cm2、2.62 X IO15 ions/cm2共5個處理。注入完畢后，用無菌水洗脫，稀釋涂平皿，置恒溫培養箱中30°C培養60h。等待單菌落生成后，轉接于斜面培養基上，每次所挑的單菌落不少于300個。
[0022]DES誘變:按上述方法制備單孢子懸液。選擇0.01 %、0.05% DES溶液，然后取等體積的DES溶液和單孢子懸液混和，30°C振蕩培養60h后，將處理后的孢子懸液涂布于平皿，30°C培養72h左右，挑取長出的單菌落進行搖瓶初篩、復篩。
[0023]初篩:將經誘變處理過的孢子懸浮液稀釋適當倍數后涂布于分離培養基平板上，30°C恒溫培養60h后，挑取生長旺盛且透明圈與菌落直徑比大者接種斜面培養基。
[0024]復篩:250mL三角瓶中加入50mL液體發酵培養基，pH6.0，滅菌降到室溫，將初篩所獲菌株接入搖瓶發酵進行復篩，每瓶接1-2環，接種后在30°C、220r/min的搖床中培養84h后，4000r/min將發酵液離心lOmin，采用DNS3，5- 二硝基水楊酸法測定上清液酶活力，與出發菌株作對照，酶活超過出發菌株者為正突變株。篩選出木聚糖酶高產菌株MJT36，并經傳代試驗表明，該突變菌株連續傳6代穩定。
[0025]2、發酵
[0026]將lmLMJT36孢子懸液(IO6個/mL)接入裝有50mL產酶培養基(2g麩皮，0.1 %的葡萄糖，I % 的蛋白胨，0.2%吐溫-80，0.2% KH2PO4,0.05% MgSO4.7Η20，起始 pH5)的 250mL三角瓶中，振蕩培養72h。
[0027]3、酶的分離純化[0028]發酵液4000r/min低溫離心15min，收集上清液為粗酶液。取IOmL上清液，加入固體硫酸銨邊攪拌至飽和度為60%,4°C過夜。于4°C、8000r/min離心15min,收集沉淀存備用。用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解上述沉淀，加入固體硫酸銨使其終濃度為0.8mol/L,再于8000r/min離心IOmin,上清液加入到用起始緩沖液平衡好的Phenyl-Sepharose6FF疏水柱中，依次用含0.8，0.4和Omol/L硫酸銨緩沖液階段洗脫(流速0.5mL/min)，DNS法測定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。將收集的酶液用硫酸銨按65%飽和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C離心15min,將沉淀用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解,加入到用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡好的G-50分子篩柱中，同一緩沖液洗脫(流速0.5mL/min)和收集(I管/lOmin)，檢測酶活，合并具有較高酶活性的洗脫液。將收集的酶液用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液透析24h,濃縮后上DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱,用含O?0.2mol/L NaCl的pH6.8、20mmol/L磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫(流速0.5mL/min)和分部收集(I管/5min)，合并具有較高酶活性的洗脫液。
[0029]洗脫液用S印hadexG-25脫鹽、聚乙二醇濃縮，冷凍干燥后制得木聚糖酶。
[0030]經測定，木聚糖酶酶活性為100158IU/g。
[0031]實施例2發酵法木聚糖酶的一種制備方法，按以下步驟依次進行:
[0032]1、低能離子注入-DES復合誘變
[0033]同實施例1。
[0034]2、發酵
[0035]將lmLMJT36孢子懸液(IO6個/mL)接入裝有60mL產酶培養基(1.5g麩皮，0.1%的木聚糖，I % 的硫酸銨，0.1 % 吐溫-80，0.2% KH2PO4,0.05% MgSO4.7Η20，起始 ρΗ6)的 250mL三角瓶中，振蕩培養84h。
[0036]3、酶的分離純化
[0037]發酵液4000r/min低溫離心15min，收集上清液為粗酶液。取IOmL上清液，加入固體硫酸銨邊攪拌至飽和度為65%,4°C過夜。于4°C、8000r/min離心15min,收集沉淀存備用。用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解上述沉淀，加入固體硫酸銨使其終濃度為0.8mol/L,再于8000r/min離心IOmin,上清液加入到用起始緩沖液平衡好的Phenyl-SepharoseCL-4B疏水柱中，依次用含0.8，0.4和Omol/L硫酸銨緩沖液階段洗脫(流速0.6mL/min)，DNS法測定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。將收集的酶液用硫酸銨按70%飽和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C離心15min,將沉淀用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解,力口入到用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡好的G-75分子篩柱中，同一緩沖液洗脫(流速0.6mL/min)和收集(I管/lOmin)，檢測酶活，合并具有較高酶活性的洗脫液。將收集的酶液用
0.02mol/L磷酸鹽緩沖液透析24h,濃縮后上DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱,用含O?0.2mol/L NaCl的pH6.8、20mmol/L磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫(流速0.6mL/min)和分部收集(I管/5min)，合并具有較高酶活性的洗脫液。
[0038]洗脫液用S印hadexG-25脫鹽、聚乙二醇濃縮，冷凍干燥后制得木聚糖酶。
[0039]經測定，木聚糖酶酶活性為128146IU/g。
[0040]實施例3發酵法木聚糖酶的一種制備方法，按以下步驟依次進行:
[0041]I)低能離子注入-DES復合誘變
[0042]同實施例1。[0043]2)發酵
[0044]將lmLMJT36孢子懸液(IO6個/mL)接入裝有70mL產酶培養基(2.5g麩皮，0.1 %的蔗糖，I % 的酵母粉，0.2% 吐溫-80，0.2% KH2PO4,0.05% MgSO4.7Η20，起始 ρΗ8)的 250mL三角瓶中，振蕩培養96h。
[0045]3)酶的分離純化
[0046]發酵液4000r/min低溫離心15min，收集上清液為粗酶液。取IOmL上清液，加入固體硫酸銨邊攪拌至飽和度為70%，4°C過夜。于4°C、8000r/min離心15min，收集沉淀，4°C保存備用。用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解上述沉淀，加入固體硫酸銨使其終濃度為0.8mol/L,再于8000r/min離心IOmin,上清液加入到用起始緩沖液平衡好的Phenyl-Sepharose4FF疏水柱中，依次用含0.8，0.4和Omol/L硫酸銨緩沖液階段洗脫(流速0.4mL/min)，DNS法測定酶活，收集具有酶活性的酶液(I管/lOmin)。將收集的酶液用硫酸銨按75%飽和度沉淀酶蛋白，8000r/min于3°C離心15min,將沉淀用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解,加入到用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡好的G-25分子篩柱中，同一緩沖液洗脫(流速0.4mL/min)和收集(I管/lOmin)，檢測酶活，合并具有較高酶活性的洗脫液。將收集的酶液用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液透析24h,濃縮后上DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱,用含O?
0.2mol/L NaC I的pH6.8、20mmol/L磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫(流速0.4mL/min)和分部收集(I管/5min)，合并具有較高酶活性的洗脫液。
[0047]洗脫液用S印hadexG-25脫鹽、聚乙二醇濃縮，冷凍干燥后制得木聚糖酶。
[0048]經測定，木聚 糖酶酶活性為104753IU/g。
【權利要求】
1.發酵法木聚糖酶的一種制備方法，主要包括以下步驟: 1)復合誘變:將從土壤樣品中分離的木聚糖酶產生菌株mtrl27用無菌水制成孢子懸浮液，采用低能離子注入和DES進行誘變。經培養后，進行初篩和復篩，最終篩選出高酶活菌株MJT36 (CGMCC N0.6410)，并進行菌種的鑒定，保藏和傳代試驗。 2)發酵:將MJT36孢子懸液接入裝有產酶培養基的三角瓶中，搖瓶振蕩培養。 3)酶的分離純化:①硫酸銨沉淀:發酵液低溫離心后收集上清液(粗酶液)，加入固體硫酸銨，過夜后離心，收集沉淀；②疏水層析:用磷酸鹽緩沖液溶解上述沉淀，加入固體硫酸銨，離心后上清液加入到用起始緩沖液平衡好的疏水柱中，硫酸銨緩沖液階段洗脫，收集具有酶活性的酶液凝膠過濾層析:將收集的酶液用硫酸銨沉淀酶蛋白，離心后沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，加入到用磷酸鹽緩沖液平衡好的分子篩柱中，同一緩沖液洗脫和收集，檢測酶活，合并具有較高酶活性的洗脫液；④陰離子交換層析:將收集的酶液用磷酸鹽緩沖液透析，濃縮后上陰離子交換柱，用含NaCl的磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫和分部收集，合并具有較高酶活性的洗脫液。 4)冷凍干燥:洗脫液用S印hadexG-25脫鹽、聚乙二醇濃縮，冷凍干燥后制得木聚糖酶，活性達到100000IU/g以上。
2.根據權利要求1所述的誘變方法，其特征在于:低能離子注入和DES復合誘變:注入離子選擇誘變育種常用的N+，注入離子能量為lOKev、15Kev, N+注入量為5.6 X IO14 ions/cm2、L 12 X IO15 ions/cm2、1.62 X IO15 ions/cm2、2.12 X 1015ions/cm2、2.62 X IO15 ions/cm2共5個處理。DES溶液選擇0.01%、0.05% 2個濃度。
3.根據權利要求1所述的發酵條件，其特征在于:將lmLMJT36孢子懸液(IO6 個/mL)接入裝有30、40、50、60、70、80mL產酶培養基(1,1.5、2、2.5、3g麩皮，0.1 %的葡萄糖、蔗糖、木糖、木聚糖、淀粉，I %的蛋白胨、草酸銨、酵母粉、硫酸銨、檸檬酸三銨、尿素，0、0.1 %、.0.2%,0.3%,0.4%吐溫-80，0.2% KH2PO4j0.05% MgSO4.7Η20，起始ρΗ4、5、6、7、8)的 250mL三角瓶中，振蕩培養60、72、84、96h。
4.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于:硫酸銨沉淀后，用磷酸鹽緩沖液溶解上述沉淀，加入固體硫酸銨，離心后上清液加入到用起始緩沖液平衡好的Phenyl-Sepharose CL-4B、Phenyl-Sepharose 6FF> Phenyl-Sepharose 4FF 等疏水柱中，硫酸銨緩沖液階段洗脫(流速0.4?0.6mL/min)。將收集的酶液用硫酸銨按55%、60%、.65%,70%,75%、80%飽和度沉淀酶蛋白，離心后沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，加入到用磷酸鹽緩沖液平衡好的Shadex G-25、G_50、G-70分子篩柱中，同一緩沖液洗脫(流速0.4?.0.6mL/min)和收集。將收集的酶液用磷酸鹽緩沖液透析，濃縮后上陰離子交換柱，用含NaCl的磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫(流速0.4?0.6mL/min)和分部收集，合并具有較高酶活性的洗脫液。
【文檔編號】C12N15/01GK103436522SQ201210388616
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年10月15日 優先權日:2012年10月15日
【發明者】李林香, 潘莉 申請人:合肥朗肽生物技術有限公司