專利名稱：一類酶敏感的超分子水凝膠納米材料及凝膠因子及其制法的制作方法
技術領域：
本發明屬于超分子水凝膠納米材料技術領域，具體涉及可用于輔助細胞存活的酶敏感的超分子水凝膠及凝膠因子及其制備方法。
背景技術：
芴甲氧羰基保護的寡肽作為凝膠因子的超分子水凝膠曾見于美國化學學會的雜志《美國化學學會會志》(J. Am. Chem. Soc.，2009，131，11286-11287)的報道，該技術應用了磷酸酶調節的成膠過程，將生物過程整合其中，但并未進一步檢測該材料在活體細胞層面的生物應用研究，在生物相容性及降解性方面未見相關報道。半胱天冬酶3在超分子水凝膠降解過程中的應用研究見于英國皇家化學學會的雜志《芯片實驗室》(LabChip, 2010, 10，1946-1951)的報道，其中所使用的超分子水凝膠由丙烯酸酯化的聚乙二醇及相應修飾的多肽片段作為單體發生聚合反應而成，涉及到眾多化合物，合成過程復雜且不易控制，文中雖然研究了所形成的超分子水凝膠的降解性，但未見其生物相容性的報道。采用可被半胱天冬酶3降解的芴甲氧羰基保護的寡肽作為凝膠因子的超分子水凝膠，用于檢測細胞凋亡相關的特定酶活性及其對細胞的生物相容性方面的研究工作至今尚未見到文獻報道。
發明內容
本發明的目的是提出一類酶敏感的超分子水凝膠納米材料的凝膠因子及其制備方法，以獲得酶敏感的超分子水凝膠納米材料，克服現有相關超分子水凝膠材料制備過程復雜且不易控制的缺點，從而可以進一步在活體細胞層面用于檢測凋亡相關的特定酶活性及在細胞培養中輔助細胞存活 。本發明的酶敏感的超分子水凝膠納米材料的凝膠因子的制備方法，其特征在于先分別合成兩段寡肽序列，按將I毫摩爾2-氯三苯甲基氯樹脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶脹4-8分鐘后，加入2毫摩爾N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩爾N，N- 二異丙基乙胺，反應2-3小時后，用100微升甲醇反應5-10分鐘，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第二個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，力口入活化的1. 6毫摩爾第三個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1.6毫摩爾第四個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，切去天冬氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第五個氨基酸纈氨酸反應2-3小時，切去纈氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第六個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，最后加入活化的1. 6毫摩爾第七個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應3-4小時，切去最后一個氨基酸天冬氨酸的保護基，加2-3毫摩爾醋酐反應20-30分鐘，最后用體積濃度為1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液從該樹脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷凍離心并傾倒除去上層乙醚，乙醚揮發干后所得白色固體粉末即為多肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-谷氨酸-天冬氨酸；再按將I毫摩爾2-氯三苯甲基氯樹脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶脹4-8分鐘后，加入2毫摩爾N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩爾N，N- 二異丙基乙胺，反應2-3小時后，用100微升甲醇反應5-10分鐘，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第二個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第三個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第四個氨基酸纈氨酸反應2-3小時，切去纈氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第五個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，切去天冬氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第六個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，最后加入活化的1. 6毫摩爾第七個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應3-4小時，切去最后一個氨基酸天冬氨酸的保護基，加2-3毫摩爾醋酐反應20-30分鐘，最后用體積濃度為1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液從該樹脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷凍離心并傾去上層乙醚，乙醚揮發干后所得白色固體粉末即為寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸；將上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩爾溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩爾N，N-二異丙基乙胺、O. 12毫摩爾苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽及O. 12毫摩爾
1-羥基苯并三唑活化半小時后，加入O.12毫摩爾N-芴甲氧羰基-乙二胺，室溫攪拌反應
2-3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分，即為第一種初產物X1 ；將上述合成的多肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩爾溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩爾N，N-二異丙基乙胺、O. 12毫摩爾苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽及O. 12毫摩爾
1-羥基苯并三唑活化半小時后，加入O.12毫摩爾N-芴甲氧羰基-乙二胺，室溫攪拌反應
2-3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分，即為第二種初產物X2 ;將上述制備的第一種初產物X1溶解在10毫升體積濃度為95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中攪拌反應3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分即為第一種純化合物Y1 ;將第二種初產物X2溶解在10毫升體積濃度為95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中攪拌反應3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分即為第二種純化合物Y2 ；
Q其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基
權利要求
1.一類酶敏感的超分子水凝膠納米材料的凝膠因子的制備方法，其特征在于 先分別合成兩段寡肽序列，按將I毫摩爾2-氯三苯甲基氯樹脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶脹4-8分鐘后，加入2毫摩爾N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩爾N，N- 二異丙基乙胺，反應2-3小時后，用100微升甲醇反應5-10分鐘，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第二個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第三個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第四個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，切去天冬氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第五個氨基酸纈氨酸反應2-3小時，切去纈氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第六個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，最后加入活化的1. 6毫摩爾第七個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應3-4小時，切去最后一個氨基酸天冬氨酸的保護基，加2-3毫摩爾醋酐反應20-30分鐘，最后用體積濃度為1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液從該樹脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷凍離心并傾倒除去上層乙醚，乙醚揮發干后所得白色固體粉末即為多肽序列一甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-谷氨酸-天冬氨酸；再按將I毫摩爾2-氯三苯甲基氯樹脂在2-3毫升N，N- 二甲基甲酰胺里溶脹4-8分鐘后，加入2毫摩爾N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩爾N，N- 二異丙基乙胺，反應2-3小時后，用100微升甲醇反應5-10分鐘，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第二個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第三個氨基酸甘氨酸反應2-3小時，切去甘氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第四個氨基酸纈氨酸反應2-3小時，切去纈氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第五個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，切去天冬氨酸的保護基，加入活化的1. 6毫摩爾第六個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反應2-3小時，最后加入活化的1. 6毫摩爾第七個氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反應3-4小時，切去最后一個氨基酸天冬氨酸的保護基，加2-3毫摩爾醋酐反應20-30分鐘，最后用體積濃度為1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液從該樹脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷凍離心并傾倒除去上層乙醚，乙醚揮發干后所得白色固體粉末即為寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸； 將上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩爾溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩爾N，N-二異丙基乙胺、O. 12毫摩爾苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽及O. 12毫摩爾1-羥基苯并三唑活化半小時后，加入O. 12毫摩爾N-芴甲氧羰基-乙二胺，室溫攪拌反應2-3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分，即為第一種初產物X1 ; 將上述合成的多肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸取O.1毫摩爾溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入O. 12毫摩爾N，N-二異丙基乙胺、O. 12毫摩爾苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽及O. 12毫摩爾1-羥基苯并三唑活化半小時后，加入O. 12毫摩爾N-芴甲氧羰基-乙二胺，室溫攪拌反應2-3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分，即為第二種初產物X2 ;將上述制備的第一種初產物X1溶解在10毫升體積濃度為95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中攪拌反應3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分即為第一種純化合物1 ;將第二種初產物X2溶解在10毫升體積濃度為95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中攪拌反應3小時，經過高效液相色譜分離提純，收集在紫外波段300納米處有特征吸收的組分即為第二種純化合物Y2 ; 其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基
2.權利要求1所述方法制備的兩種超分子水凝膠納米材料的凝膠因子，即第一種純化合物Y1和第二種純化合物Y2，其特征在于結構分別為
3.一種以權利要求1方法制備的超分子水凝膠納米材料的凝膠因子即第一種純化合物Y1調制成的酶敏感的超分子水凝膠納米材料，其特征在于按照如下配比進行調節成膠將I毫克的第一種純化合物Y1溶于100微升的電阻率為18. 3歐·米的去離子水中后，力口入碳酸鈉固體粉末調節溶液PH至第一種純化合物Y1完全溶解形成無色透明溶液，再加入濃鹽酸調節溶液PH至1，振蕩溶液使之混合均勻，至形成超分子水凝膠納米材料。
4.一種以權利要求1方法制備的超分子水凝膠納米材料的凝膠因子即第二種純化合物Y2調制成的酶敏感的超分子水凝膠納米材料，其特征在于按照如下配比進行調節成膠將I毫克的第二種純化合物Y2溶于100微升的電阻率為18. 3歐·米的去離子水中后，力口入碳酸鈉固體粉末調節溶液PH至第二種純化合物Y2完全溶解形成無色透明溶液，再加入濃鹽酸`調節溶液PH至1，振蕩溶液使之混合均勻，至形成超分子水凝膠納米材料。
全文摘要
本發明公開了一類合成簡單的酶敏感超分子水凝膠納米材料及凝膠因子及其制備方法，特征是通過簡單的固相多肽合成及常規的液相羧氨縮合反應合成凝膠因子，成膠和溶膠通過調節pH的方式控制，同時由于凝膠因子含有半胱天冬酶3特異性識別的寡肽序列，可以被細胞凋亡過程產生的半胱天冬酶3剪切，能夠延長細胞的存活時間。與傳統的超分子水凝膠納米材料相比，本發明的酶敏感超分子水凝膠納米材料的優勢在于不需要復雜的反應條件，凝膠因子合成簡單，成膠條件容易控制；對細胞凋亡過程中產生的特定酶半胱天冬酶3敏感，對細胞有良好的生物相容性，可在活體細胞層面用于檢測凋亡相關的特定酶活性及在細胞培養中輔助細胞存活。
文檔編號C12N5/00GK103030682SQ20121054103
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者梁高林, 唐安明 申請人:中國科學技術大學