專利名稱：草莓黃萎病的膏狀生防制劑、制備方法、應用及其專用菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，具體而言，涉及一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑、
制備方法、應用及其專用菌株。
背景技術：
草莓(Fragaria ananassa)屬于薔薇科(Rosaceae)草莓屬多年生草本植物，目前世界草莓每年的產量已經超過500萬噸，在世界小漿果生產中其產量榮居首位，近年來大棚栽培草莓在逐漸興起，種植面積逐漸擴大，但卻存在著輪作換地與設施固定的矛盾，連作 障礙日益明顯，草莓連作病害是目前制約草莓生產的主要因素，尤其是草莓黃萎病，世界各國草莓產區普遍流行此病，該病害的發生，輕者導致減產減收，重者絕收，嚴重制約了草莓的可持續發展。草莓黃萎病(Fusariumoxysporum Schl. f. sp.1agenaria Winks et Wi)是草莓種植中一種常見的土傳性病害，由大麗花輪枝孢菌(Verticllium albo-atrum Reinke dtBerthold和Verticillium dahliae Klrmahn)病原菌侵染引起病害。據調查顯不，第二年連茬栽種草莓地草莓黃萎病發病率達82.9%，第三年發病率可達100 %。為此，草莓黃萎病的生物防治特別是生物農藥的研究與開發是草莓生產可持續發展的需要。微生物農藥對環境的選擇壓力較小，且不易使靶標病原菌產生抗藥性，因此，生物源農藥的研究將會為人們提供更安全更高效的防治草莓黃萎病的途徑。現在已用于防治草莓黃萎病的微生物主要有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)、沙雷氏菌(Serratia sp. )、VAM 真菌等，劑型主要為可濕性粉劑、懸浮劑、油懸浮劑等。但是到目前為止，尚沒有用棘孢木霉菌株(Trichoderma asperellum)及其膏狀生防制劑防治草莓黃萎病的相關報道。

發明內容
本發明的目的在于解決上述現有技術中存在的不足和問題，提供一種用于防治高效防治草莓黃萎病的基因工程菌菌株、含該菌株的膏狀生防制劑及其制備方法和應用。為了實現本發明的目的，本發明提供了一株基因工程菌菌株，其分類命名為棘孢木霉(Jrichoderma asperellum) GY20,其保藏編號為CGMCC NO :4899。本發明還提供了一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑，其中，所述制劑的活性成分為上述提及的所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌絲與厚垣孢子。進一步地，所述菌絲與厚垣孢子的比例，由以下培養方法決定
將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上長好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用無菌水洗下，調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬
鈴薯葡萄糖液體培養基中，振蕩培養48小時；將上步所得培養液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養基中振蕩培養48小時進一步擴增后，再將所得培養液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發酵培養液的發酵罐中進行發酵培養后離心得到。
優選地，所述發酵罐中的發酵培養液各組分的重量份含量為甜菜液380-420、七水硫酸鎂3-5、磷酸二氫鉀38-42 ;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為300-400轉/分，發酵溫度25-27攝氏度，發酵時間48小時，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養的條件均為140-160轉/分、25-27攝氏度；所述發酵培養后離心的條件為7500-8500轉/分，離心10分鐘。最佳條件為所述發酵罐中的發酵培養液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉/分，發酵溫度26攝氏度，發酵時間48小時，pH 7.0-7. 2。優選地，所述振蕩培養的條件均為150轉/分、26攝氏度；所述發酵培養后離心的條件為8000轉/分離心10分鐘。 優選地，所述膏狀生防制劑還包括O. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑。優選地，所述膏狀生防制劑還包括5 10%的可溶性淀粉。優選地，所述可溶性淀粉為土豆淀粉。本發明還提供了一種制備上述草莓黃萎病的膏狀生防制劑的方法，其中，所述方法包括
I)將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上長好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GY20孢子用無菌水洗下，調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，振蕩培養48小時；將上步所得培養液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養基中振蕩培養48小時進一步擴增后，再將所得培養液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發酵培養液的發酵罐中進行發酵培養后離心得到。2)調節pH值將上述菌絲與厚垣孢子混合體的pH值調節為3. (Γ4. O ；
3)制得膏狀生防制劑向所述步驟2)得到的混合體中加入0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即可。優選地，所述發酵罐中的發酵培養液各組分的重量份含量為甜菜液380-420、七水硫酸鎂3-5、磷酸二氫鉀38-42 ;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為300-400轉/分，發酵溫度25-27攝氏度，發酵時間48小時，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養的條件均為140-160轉/分、25-27攝氏度；所述發酵培養后離心的條件為7500-8500轉/分，離心10分鐘。最佳條件為所述振蕩培養的條件均為150轉/分、26攝氏度；所述發酵罐中的發酵培養液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉/分，發酵溫度26攝氏度，發酵時間48小時，pH 7. 0-7. 2 ；所述發酵培養后離心的條件為8000轉/分離心10分鐘；所述可溶性淀粉為土豆淀粉。再者，本發明還提供了所述的基因工程菌菌株棘孢木mTrichodermaasperellum) GY20及所制得的膏狀生防制劑在防治草莓黃萎病中的應用。本發明用于防治草莓黃萎病的含基因工程菌菌株棘孢木霉(Trichodermaasperellum^ GY20的膏狀生防制劑與現有的“EM菌根”相比，具有以下優點1、本發明膏狀生防制劑由活性組分與輔料組成，活性組分為棘孢木霉(Tri ch ο dermaasperellum)GY20菌絲與厚垣孢子,其厚垣孢子分散在木霉菌絲中,其制備成的膏狀生防制劑產品質量穩定，可室溫保存18個月，冷藏條件下保存3年；2、本發明膏狀生防制劑對草莓黃萎病有良好防效溫室試驗結果表明，GY20對草莓黃萎病的防治效果均可達90%以上，顯著高于“EM菌根”對草莓黃萎病的防治效果45. 93% ；
3、無公害本發明棘孢木霉(TricAoofezmaGY20可安全釋放的真菌,故不會因農藥的使用帶來的一系列環境負效應，同時含該木霉的膏狀生防制劑的使用極大的減少了草莓生產中化學農藥的施用量，不會產生任何廢水廢氣廢渣，為草莓無公害生物防治提供可靠保證，造福于現代高效農業；
4、成本較低本發明棘孢木霉(TricAoofezmaGY20及其膏狀生防制劑生產成本很低，企業獲取的利潤空間極大。。
具體實施例方式本發明的生物材料棘孢木霉asperellum) GY20的保藏日期為2011年5月25日，保藏單位全稱為中國微生物生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為北京.中國科學院微生物研究所，其保藏編號為CGMCC NO :4899。 所述棘孢木霉GY20具有如下特征25°C黑暗條件下培養4d，菌落直徑53-55mm，菌絲體白色，絮狀，茂盛；分生孢子結構大量產生，產孢區均勻分布，灰綠色；瓶梗式產孢，分生孢子橢圓形、近球形，表面有細刺。木霉菌對多種重要植物病原真菌有作用，如腐霉菌、輪枝菌、鐮刀菌、長孺孢菌、交鏈孢菌、絲核菌、葡萄孢菌等。一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑，其中，所述制劑的活性成分為權利要求1所述棘抱木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌絲與厚垣抱子。其中，所述菌絲與厚垣孢子的比例，由以下培養方法決定
將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上長好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用無菌水洗下，調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，振蕩培養48小時；將上步所得培養液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養基中振蕩培養48小時進一步擴增后，再將所得培養液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發酵培養液的發酵罐中進行發酵培養后離心得到。其中，所述發酵罐中的發酵培養液含量為甜菜液400.(^、七水硫酸鎂4.(^、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉/分，發酵溫度26攝氏度，發酵時間48小時，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養的條件均為150轉/分、26攝氏度；所述發酵培養后離心的條件為8000轉/分離心10分鐘。進一步地，所述膏狀生防制劑的PH值為3. (Γ4. O，優選PH值為3. 5。進一步地，所述膏狀生防制劑還包括0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，優選所述膏狀生防制劑包括0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，優選0. 01%的MDA-5。進一步地，所述膏狀生防制劑還包括5 10%的可溶性淀粉。優選地，所述膏狀生防制劑還包括5 10%的可溶性淀粉。優選地，所述可溶性淀粉為8%的土豆淀粉。另一方面，本發明保護一種制備上述所述的草莓黃萎病的膏狀生防制劑的方法，其中，所述方法包括
I)將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上長好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GY20孢子用無菌水洗下，調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，振蕩培養48小時；將上步所得培養液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養基中振蕩培養48小時進一步擴增后，再將所得培養液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發酵培養液的發酵罐中進行發酵培養后離心得到。2)調節pH值將上述菌絲與厚垣孢子混合體的pH值調節為3. (Γ4. O ；
3)制得膏狀生防制劑向所述步驟2)得到的混合體中加入O. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即可。其中，所述振蕩培養的條件均為150轉/分、26攝氏度；所述發酵罐中的發酵培養液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉/分，發酵溫度 26攝氏度，發酵時間48小時，pH 7. 0-7. 2 ;所述發酵培養后離心的條件為8000轉/分離心10分鐘；所述可溶性淀粉為土豆淀粉。具體地，本發明的防治草莓黃萎病菌株GY20制備的膏狀生防制劑，其制備方法包括以下步驟
(A)菌液的獲得
用無菌接種刀挑取事先在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上培養好的GY20孢子，用無菌水洗下調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于裝有200ml馬鈴薯葡萄液體培養基(PD)的容積為750 ml的三角瓶中，于26 °C >150 rpm/min條件下振蕩培養48 h，將上步所得培養液200 ml等份接種于4個裝有500ml PD培養液的容積為2000 ml的三角瓶中，150 rpm、26°C條件下振蕩培養48 h ;把所得的2000ml培養液接種于裝有20L培養液的容積為30L的發酵罐(鎮江東方GUS-30)，20L發酵培養液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. 0g，設置發酵條件為溶氧100%，攪拌速度為350rpm，發酵溫度26 °C，發酵時間48 h，pH 7· 0_7· 2。(B)膏狀生防制劑加工工藝
將發酵好的發酵液按如下方法加工成膏狀生防制劑先將發酵液在8000rpm/min條件下離心lOmin，得菌絲及厚垣孢子混合體，用鹽酸調節pH至3. 0^4. O,并加入0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即制成了膏狀生防制劑。優選地，上述步驟(B)中用鹽酸調節菌絲及厚垣孢子混合體pH至3. (Γ4. O后，力口入0. 001%的銅離子抑制劑，最后加入8%的可溶性淀粉。再一方面，本發明保護的是所述的基因工程菌菌株棘孢木霉(Trichodermaasperellum) GY20及上述任一所述的膏狀生防制劑在防治草莓黃萎病中的應用。根據以下實施例，可以更好的理解本發明。實施案例中所描述的具體的物料配比，工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1膏狀生防制劑及其制備方法 膏狀生防制劑的組分為
活性組分棘孢木霉(Trichoderma asperellum ) GY20菌絲及厚垣孢子混合體94. 999%
銅離子抑制劑MDA-5 0. 001%
土豆淀粉5%
PH值3
上述所述百分比為重量百分比。
上述膏狀生防制劑的制備方法包括以下步驟
(A)菌液的獲得
用無菌接種刀挑取事先在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上培養好的GY20孢子，用無菌水洗下調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于裝有200ml馬鈴薯葡萄液體培養基(PD)的容積為750 ml的三角瓶中，于26 °C >150 rpm/min條件下振蕩培養48 h，將上步所得培養液200 ml等份接種于4個裝有500ml PD培養液的容積為2000 ml的三角瓶中，150 rpm、26°C條件下振蕩培養48 h ;把所得的2000ml培養液接種于裝有20L培養液的容積為30L的發酵罐(鎮江東方GUS-30)，20L發酵培養液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. 0g，設置發酵條件為溶氧100%，攪拌速度為350rpm，發酵溫度26 °C，發酵時間48 h，pH 7· 0_7· 2。 (B)膏狀生防制劑加工工藝
將發酵好的發酵液按如下方法加工成膏狀生防制劑先將發酵液在8000rpm/min條件下離心lOmin，得菌絲及厚垣孢子混合體，用鹽酸調節pH至3. O,并加入O. 001%的銅離子抑制劑，最后加入5%的可溶性淀粉，攪拌均勻即制成了膏狀生防制劑。實施例2-3
按照實施例1的方法制備實施例2-3，不同之處如表I所示。
表I實施例2-3制備方法
權利要求
1.一株基因工程菌菌株，其分類命名為棘孢木霉aricAoiferffla asperellum) GY20, 其保藏編號為CGMCC NO :4899。
2.—種草莓黃萎病的膏狀生防制劑，其特征在于，所述制劑的活性成分為權利要求1 所述棘抱木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌絲與厚垣抱子。
3.根據權利要求2所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述菌絲與厚垣孢子的比例， 由以下培養方法決定將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上長好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用無菌水洗下，調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按V/V 5%接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，振蕩培養48小時；將上步所得培養液以V/V 10%的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養基中振蕩培養48小時進一步擴增后，再將所得培養液以V/V 10% 的接種量再次接種于含20L發酵培養液的發酵罐中進行發酵培養后離心得到。
4.根據權利要求3所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述發酵罐中的發酵培養液各組分的重量份含量為甜菜液380-420、七水硫酸鎂3-5、磷酸二氫鉀38-42 ;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為300-400轉/分，發酵溫度25-27攝氏度，發酵時間48小時， pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養的條件均為140-160轉/分、25-27攝氏度；所述發酵培養后離心的條件為7500-8500轉/分，離心10分鐘。
5.根據權利要求4所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述發酵罐中的發酵培養液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發酵的條件為溶氧100%， 攪拌速度為350轉/分，發酵溫度26攝氏度，發酵時間48小時，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養的條件均為150轉/分、26攝氏度；所述發酵培養后離心的條件為8000轉/分離心10分鐘；所述膏狀生防制劑還包括重量百分比0. OOfO. 05%的銅離子抑制劑。
6.根據權利要求2或5所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述膏狀生防制劑還包括重量百分比5 10%的可溶性淀粉；所述的銅離子抑制劑為MDA-5。
7.根據權利要求6所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述可溶性淀粉為土豆淀粉。
8.一種制備權利要求2 7所述的草莓黃萎病的膏狀生防制劑的方法，其特征在于，所述方法包括1)將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上長好的棘孢木霉(Trichodermaasperellum) GY20 孢子用無菌水洗下，調節成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按V/V 5%接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，振蕩培養48小時；將上步所得培養液以V/V 10%的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養基中振蕩培養48小時進一步擴增后，再將所得培養液以V/V 10% 的接種量再次接種于含20L發酵培養液的發酵罐中進行發酵培養后離心得到；2)調節pH值將上述菌絲與厚垣孢子混合體的pH值調節為3.(Γ4. O ；3)制得膏狀生防制劑向所述步驟2)得到的混合體中加入0.00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即可。
9.根據權利要求8所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述振蕩培養的條件均為150 轉/分、26攝氏度；所述發酵罐中的發酵培養液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、 磷酸二氫鉀40. Og;所述發酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉/分，發酵溫度26攝氏度，發酵時間48小時，pH 7. 0-7. 2 ;所述發酵培養后離心的條件為8000轉/分離心10 分鐘；所述可溶性淀粉為土豆淀粉。
10.權利要求1所述的基因工程菌菌株及權利要求2 7任一所述的膏狀生防制劑在防治草莓黃萎病中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑、制備方法、應用及其專用菌株。所述專用菌株分類命名為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GY20,其保藏編號為CGMCCNO4899。本發明膏狀生防制劑的所述制劑的活性成分為上述所述棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GY20的菌絲與厚垣孢子。本發明的膏狀生防制劑最大的優點是產品質量穩定，可室溫保存18個月，冷藏條件下保存3年，且對草莓黃萎病有良好防效，不產生任何廢水廢氣廢渣，利于環境保護。
文檔編號C12R1/885GK103013838SQ201210541989
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者李楠, 張海軍, 羅志會, 劉慕蘭, 李惠 申請人:江蘇耕耘化學有限公司