專利名稱：一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置及檢測方法
技術領域：
本發明涉及細胞培養、組織工程領域，更具體地涉及一種能夠檢測組織工程生物反應器中組織培養物或組織植入物上活細胞生長情況的檢測裝置及檢測方法，用于在線或離線連續定量檢測組織培養過程中細胞在某一個特定的組織工程支架或組織植入物上生長和存活的真實情況，評估組織培養中細胞生長與存活的影響因素，對樣品進行質量控制。
背景技術：
組織工程技術的一個重要應用就是體外構建組織植入物，即用組織工程方法體外構建組織植入物是將體外培養的種子細胞，接種于天然或人工合成的組織工程支架上，在體外培養后，再移植到體內，以替代病損的組織。組織工程技術的發展為先天性疾病和獲得性疾病的治療創造了前所未有的機會。組織植入物上的活細胞量是一個非常重要的參數，它是分析細胞生長、存活和代謝的基礎，是控制組織培養過程的首要參數，也是評估組織植入物是否具有生理功能的重要指標。在組織植入物的培養過程中，經常需要及時地、定量地了解細胞的生長情況，以便對培養過程進行監控。但是目前的組織工程反應器缺乏能夠對培養中的組織培養物進行在線、連續、定量檢測的裝置，在組織培養中大多數情況下只能對細胞在組織植入物上的生長情況進行非連續的、非動態的終點檢測，而不能進行連續的、動態的檢測。如果要連續觀察細胞生長及存活情況，需要同時培養大量樣品，在培養過程中取出培養物進行終點檢測。這會造成支架、種子細胞、培養基及培養設備的大量浪費。對于種子細胞稀缺、培養過程復雜、培養困難的組織培養過程，受到培養規模的限制，培養過程中細胞生長和存活的連續檢測和評估就更加難以實現。因此，在組織工程領域迫切需要建立簡單快速、能夠在不損傷細胞活性及生理功能，不中斷培養過程的前提下進行`活細胞定量的檢測裝置和檢測方法。中國專利申請(200680041273.4)公開了一種用于檢測活細胞活性的裝置和方法，使用成像傳感器分析細胞在熒光染料刺激后的熒光圖像，獲得細胞活性的檢測數據。本發明的目的在于提供了一種能夠在線或離線的、連續的、定量的檢測組織工程反應器中培養的組織植入物上細胞活性和生長情況的裝置和相應的檢測方法。與現有技術相比，本發明的優點在于該裝置具有一個與組織培養回路相并聯的檢測回路和一個與組織培養回路相并聯的沖洗回路，能夠在不中斷培養過程的情況下檢測細胞活性和細胞生長情況，并且能夠及時去除檢測試劑對細胞的危害；另一個優點是該裝置和方法簡單有效容易實施，對組織培養設備和檢測設備的要求也不高。其實施效果在于能夠實現組織培養過程中細胞生長的可控化、可監測化，有利于為組織植入物的臨床應用、制定相關的GLP和GMP規范提供依據。

發明內容
根據本發明的一個方面，提供了一種能夠在線或離線的、連續的、定量的檢測組織工程反應器中培養的組織植入物上細胞活性和生長情況的裝置，其特征在于包括:一個與組織工程反應器的培養回路并聯的檢測回路和一個與組織工程反應器的培養回路并聯的沖洗回路。檢測回路和沖洗回路通過閥門和管路組合在一起，并通過閥門開閉控制檢測回路和沖洗回路的切換。所述的與組織工程反應器的培養回路并聯的檢測回路，包括一個檢測液儲液瓶，通過管路與組織培養腔相連；一個液體驅動泵設置在檢測液儲液瓶和組織培養腔之間，用于驅動液體在回路中流動；一個檢測器，設置在組織培養腔下游，用于檢測信號變化；在檢測過程中恒流泵驅動檢測液在該封閉的回路中循環。所述的與組織工程反應器的培養回路并聯的沖洗回路，包括一個沖洗液儲液瓶，通過管路依次與組織培養腔、檢測器相連；一個設置在檢測器下游的廢液瓶，一個恒流泵設置在沖洗液儲液瓶和組織培養腔之間，用于驅動液體從沖洗液儲液瓶依次流經組織培養腔和檢測器，流入廢液瓶，完成對檢測回路的沖洗；一個本發明的另一個方面，提供了一種能夠在線的、連續的、定量的檢測組織工程反應器中培養的組織植入物上細胞活性和生長情況的方法，其特征在于包括:1、關閉組織培養回路上下游2、切換至沖洗回路；

3、沖洗組織培養物；4、關閉沖洗回路，開啟檢測回路；5、將檢測試劑注入到組織培養腔內；6、讓檢測試劑在檢測回路中循環，檢測初始狀態的光密度或熒光強度作為初始值(參比)；7、讓檢測試劑在檢測回路中循環，讓檢測試劑反應至規定的時間；8、檢測反應結束時的光密度或熒光強度，將檢測到的信號與參比對照，計算活細胞量；9、切換至沖洗回路10、沖洗組織培養物；11、關閉沖洗回路，切換至培養回路，繼續組織培養。在一個實施方案中，所述的反應試劑可以是對細胞無毒或低毒的試劑包括:含有刃天青(Resazurin)染料的試劑如Alamar Blue,含有二乙酰突光素(FDA)染料的試劑，含有乳酸脫氫酶的試劑，含有氟衍生物(fuo derivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、口引哚衍生物(indo derivate)、rhod_2、鈣綠和quin-2組成的試劑。在一個實施方案里所述的組織培養物111上的細胞包括:原代培養的各種組織細胞、連續培養的細胞系、具有多種分化潛能或單一分化潛能的干細胞。這些細胞生長在組織工程支架上或微載體上。所述的組織培養物111可以是固定在組織工程反應器的組織培養腔中，也可以是在組織培養腔中懸浮狀態培養。


圖1示意顯示了根據本發明的一個實施例的活細胞檢測裝置中沖洗回路的結構；圖2示意顯示了根據本發明的一個實施例的活細胞檢測裝置中檢測回路的結構；
圖3示意顯示了根據本發明的一個實施例的用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置的結構，其中沖洗回路和檢測回路在一條通路上；圖4示意顯示了根據本發明的一個實施例的三通閥的結構和流路方向的切換；圖5示意顯示了根據本發明的一個實施例的帶有細胞截留裝置的組織培養腔的結構；圖6顯示了根據本發明的一個實施例的進行活細胞檢測的流程圖。
具體實施例方式如圖1所示，根據本發明的一個實施例的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置包括一個與組織培養回路并聯的沖洗回路包括:一個沖洗液儲液瓶101，一個三通閥102，一個液體驅動泵103，一個三通閥104，一個組織培養腔105，組織培養物111、一個三通閥106，一個檢測腔107，一個三通閥108，一個廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個回路。用于在檢測之前沖洗組織培養物111及檢測回路，去除影響檢測反應的培養液；或在檢測活細胞量之后沖洗洗組織培養物111及檢測回路，去除檢測液，消除檢測液長期存在對細胞的影響。所述的組織培養物111位于組織培養腔內105，可以是固定在組織培養腔105內培養，也可以是懸浮在組織培養腔105內培養。所述的三通閥用于控制流路或流路組件的開閉，從而完成流路的切換。其中所述的三通閥104和106分別位于組織培養腔105的上下游，完成流路在組織培養回路112與檢測或沖洗回路之間的切換；三通閥102位于沖洗液儲液瓶上游，用于控制沖洗液儲液瓶的開閉。所述的液體驅動泵 103設置在沖洗液儲液瓶101和組織培養腔105之間，用于驅動液體從沖洗液儲液瓶101依次流經組織培養腔105和檢測腔107，流入廢液瓶109，完成對組織培養物的沖洗。在沖洗的具體實施過程中:(I)旋轉三通閥102至沖洗液儲液瓶101和液體驅動泵103之間流路暢通；旋轉三通閥104至液體驅動泵103、組織培養腔105之間流路暢通，組織培養回路112上游與組織培養腔105之間流路關閉；旋轉三通閥106至組織培養腔105與檢測腔107之間流路暢通，組織培養腔105組織培養回路112下游之間流路關閉；旋轉三通閥108至檢測腔107與廢液瓶109之間流路暢通。(2)開啟液體驅動泵103，使沖洗液逐漸替換流路的其它液體，直至沖洗液完全充滿流路，在此過程中液體流入廢液瓶109。如圖2所示，根據本發明的一個實施例的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置包括一個與組織培養回路并聯的檢測回路包括:一個檢測液儲液瓶201，一個三通閥202，一個液體驅動泵103，一個三通閥104，一個組織培養腔105，組織培養物111，一個三通閥106，一個檢測器203，檢測器中與檢測管路相連接的檢測腔107，一個三通閥108，一個廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個回路，檢測器與一個計算機204連接，通過計算機204控制檢測器并進行檢測數據的處理和輸出。三通閥202位于檢測液儲液瓶201和液體驅動泵103之間，完成流路在檢測回路、檢測循環回路或沖洗回路之間的切換；三通閥104和106分別位于組織培養腔105的上下游，完成流路在組織培養回路與檢測或沖洗回路之間的切換；三通閥108位于廢液瓶109和檢測液儲液瓶101之間，完成流路在檢測回路或檢測循環回路之間的切換。在檢測的具體實施過程中:(I)旋轉三通閥202至檢測液儲液瓶201和液體驅動泵103之間流路暢通，檢測液儲液瓶201和廢液瓶109之間流路關閉，旋轉三通閥104至液體驅動泵103、組織培養腔105之間流路暢通，組織培養回路112上游與組織培養腔105之間流路關閉；旋轉三通閥106至組織培養腔105與檢測腔107之間流路暢通，組織培養腔105組織培養回路112下游之間流路關閉；旋轉三通閥108至檢測腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與檢測液儲液瓶201之間流路關閉。(2)開啟液體驅動泵103，使檢測液逐漸替換流路的其它液體，直至檢測液完全充滿流路，在此過程中液體流入廢液瓶109。(3)旋轉三通閥202至檢測液儲液瓶201關閉，液體驅動泵103和檢測液儲液瓶201下游之間流路暢通；旋轉三通閥108至廢液瓶109關閉，液體驅動泵103和檢測腔107之間流路暢通，從而形成一個封閉的回路，檢測液由液體驅動泵103驅動，在組織培養腔105和檢測腔107中循環流動，使得在規定的反應時間內體積的檢測劑與組織植入物上的細胞充分反應；檢測液的循環流動起到傳質和混合的作用，使檢測液反應更充分，提高反應的信號，防止營養物耗竭，代謝廢物運出。其中所述的管路110是由無毒的、能夠耐受濕熱滅菌或化學滅菌如環氧乙烷、酒精滅菌的軟管或硬管組成，管子的直徑在0.1mm到3mm之間。其中所述的檢測腔107是能夠進行熒光、吸光度、或化學發光檢測的腔體；檢測器110是可進行熒光、吸光度、或 化學發光檢測的設備模塊；檢測器與一個計算機112連接，通過計算機112控制檢測器，并進行檢測數據的處理和輸出。其中所述的檢測液可以是對細胞無毒或低毒的試劑包括:含有刃天青(Resazurin)染料的試劑如Alamar Blue,含有二乙酰突光素染料的試劑,含有乳酸脫氫酶的試劑，含有氟衍生物(fluo derivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、卩引哚衍生物(indo derivate)、rhod_2、|丐綠和quin_2組成的試劑。并且檢測液含有對應的組織細胞維持代謝必需的營養物質和PH環境，例如與待測細胞培養條件一致的細胞培養液或D-Hanks液、PBS液等，并且這些物質不影響檢測反應的進行和信號的檢測。如圖3所示，根據本發明的一個實施例的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其中沖洗回路和檢測回路整合在在一條通路上，包括:一個沖洗液儲液瓶101，一個三通閥102，一個檢測液儲液瓶201，一個三通閥202，一個液體驅動泵103，一個三通閥104，一個組織培養腔105，組織培養物111，一個三通閥106，一個檢測器203，檢測器中與檢測管路相連接的檢測腔107，一個三通閥108，一個廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個回路，檢測器與一個計算機204連接，通過計算機204控制檢測器并進行檢測數據的處理和輸出。所述的檢測液儲液瓶201、沖洗液儲液瓶101、廢液瓶109依次設置于液體驅動泵103的上游，分別通過三通閥202、102、108與液體驅動泵103上游的管路相連，通過三通閥的開閉控制檢測回路和沖洗回路的切換。
所述的沖洗回路和檢測回路組合方式可以簡化活細胞檢測裝置，在活細胞檢測過程中通過流路切換方便地完成樣品的沖洗和檢測。如圖4所示，根據本發明的一個實施例的三通閥，通過三通閥內部閥芯的旋轉，控制液體流路在兩個或三個方向上暢通，從而完成流路的切換。值得注意的是，也可以用在回路上設置兩個兩通閥來代替所述的三通閥，只要其能夠完成相應的流路切換的過程。如圖5所示，根據本發明的一個實施例的組織培養腔105，在其出口處有一個細胞截留裝置501，當組織植入物懸浮生長在組織工程反應器中時，細胞截留裝置501使沖洗液、檢測液等液體通過組織培養腔105流入下游檢測腔107而細胞被截留在培養腔內。所述的細胞截留裝置可以是砂 芯、濾器或篩網，其截留孔徑在1-10 μ m。如圖6所示，根據本發明的一個實施例的進行活細胞檢測的流程圖。在一個結合圖3裝置的具體檢測的實施過程中:(I)旋轉三通閥104至組織培養回路112上游與組織培養腔105之間流路關閉，液體驅動泵103、組織培養腔105之間流路暢通；旋轉三通閥106至組織培養腔105組織培養回路112下游之間流路關閉，組織培養腔105與檢測腔107之間流路暢通；從而關閉組織培養回路。(2)旋轉三通閥102至沖洗液儲液瓶101和液體驅動泵103之間流路暢通；旋轉三通閥202至檢測液儲液瓶201關閉，沖洗液儲液瓶101與液體驅動泵103之間流路暢通；旋轉三通閥108至檢測腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與沖洗液儲液瓶201之間流路關閉；從而使沖洗回路暢通。(3)開啟液體驅動泵103，使沖洗液逐漸替換流路的其它液體，直至沖洗液完全充滿流路，在此過程中液體流入廢液瓶109，從而完成組織培養物的沖洗。(4)旋轉三通閥202至檢測液儲液瓶201和液體驅動泵103之間流路暢通，檢測液儲液瓶201和沖洗液儲液瓶101之間流路關閉；旋轉三通閥108至檢測腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與沖洗液儲液瓶101之間流路暢通；旋轉三通閥102關閉沖洗液儲液瓶101，沖洗液儲液瓶101和液體驅動泵103之間流路暢通；從而完成沖洗回路到檢測回路的切換。(5)開啟液體驅動泵103，使檢測液逐漸替換流路的其它液體，直至檢測液完全充滿流路，在此過程中液體流入廢液瓶109，從而完成檢測液的導入。(6)旋轉三通閥202至檢測液儲液瓶201關閉，液體驅動泵103和檢測液儲液瓶201下游之間流路暢通；旋轉三通閥108至廢液瓶109關閉，液體驅動泵103、組織培養腔105和檢測腔107之間流路暢通，從而形成一個封閉的回路，檢測液由液體驅動泵103驅動，在組織培養腔105和檢測腔107中循環流動；從而完成檢測液在檢測回路內的循環。(7)檢測通過檢測器的反應信號，如吸光度、熒光強度、化學發光強度等信號的變化作為初始信號，傳遞到計算機204，從而完成初始信號的采集。(8)檢測液由液體驅動泵103驅動，在組織培養腔105和檢測腔107中循環流動規定的反應時間，使檢測劑與組織植入物上的細胞充分反應；檢測器檢測反應信號，把信號傳遞到計算機204，經過計算機處理獲得活細胞量的數據。值得注意的是，所述的檢測液的循環流動起到傳質和混合的作用，使檢測液反應更充分，提高反映的信號，防止營養物耗竭，方便代謝廢物運出。所述的反應時間為0.5-4小時；所述的反應信號包括:吸光度、熒光強度、化學發光強度等；所述的信號檢測包括在反應期間連續檢測通過檢測腔的信號變化，或者只檢測反應終點時檢測腔的信號。(9)檢測結束，旋轉三通閥102至沖洗液儲液瓶101和液體驅動泵103之間流路暢通；旋轉三通閥202至檢測液儲液瓶201關閉，沖洗液儲液瓶201與液體驅動泵103之間流路暢通；旋轉三通閥104至液體驅動泵103、組織培養腔105之間流路暢通，組織培養回路112上游與組織培養腔105之間流路關閉；旋轉三通閥106至組織培養腔105與檢測腔107之間流路暢通，組織培養腔105組織培養回路112下游之間流路關閉；旋轉三通閥108至檢測腔107與廢液瓶109之間流路暢通，廢液瓶109與沖洗液儲液瓶201之間流路關閉；從而完成檢測回路到沖洗回路的切換。(10)開啟液體驅動泵103，使沖洗液逐漸替換流路的其它液體，直至沖洗液完全充滿流路，在此過程中液體流入廢液瓶109，從而完成組織培養物的沖洗。(11)關閉液體驅動泵103，旋轉旋轉三通閥104和106至組織培養回路112上、下游與組織培養腔105之間流路暢通，沖洗和檢測回路關閉，從而將反應器切換到組織培養回路。實施例1在組織培養過程中檢測培養的血管組織上的活細胞量( I)旋轉三通閥切換流路，使組織培養腔105上下游的組織培養回路關閉，檢測劑儲液瓶201關閉，沖洗回路暢通；(2)開啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲液瓶101流出，流經組織培養腔105、檢測腔107，再流入廢液瓶，從而完成對組織培養腔及培養物中溶液的置換，排除培養液中物質(如脫落細胞等)對檢測的干擾；

(3)沖洗完成后，旋轉三通閥切換流路，使沖洗液儲液瓶101關閉，檢測液儲液瓶201通暢，開啟恒流泵103，使檢測液從檢測液儲液瓶流出，流經組織培養腔105、檢測腔107，再流入廢液瓶，從而完成檢測液對組織培養腔及培養物中沖洗液的置換，使整個檢測回路中的液體為濃度均一的，未經稀釋的檢測液；(4)旋轉三通閥切換流路，使廢液儲液瓶109關閉，從而使檢測液在封閉回路中循環，保持檢測液中含有維持細胞正常代謝的成分(如培養基、Hanks液成分等)，保證細胞在檢測期間維持正常的生理狀態，保證在檢測期間細胞基本的營養需求。回路封閉循環，保證反應體系的傳質，防止局部物質過濃，影響反應結果。(5)檢測反應初始時刻的通過檢測器的反應信號作為初始信號，傳遞到計算機204，從而完成初始信號的采集。(6)讓檢測液在回路中循環規定的時間，在反應結束時，檢測器檢測反應信號，把信號傳遞到計算機204，經過計算機處理獲得活細胞量的數據。(7)在反應結束時，將三通閥切換至洗液回路暢通；(8)開啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲液瓶101流出，流經組織培養腔105，再流入廢液瓶109，從而完成對組織培養腔及培養物的沖洗。(9)關閉恒流泵103，旋轉三通閥關閉檢測回路上下游，切換至培養回路，使培養回路暢通；繼續組織培養。實施例2在組織培養過程中檢測懸浮培養的微載體上的細胞活力
(I)旋轉三通閥切換流路，使組織培養腔105上下游的組織培養回路關閉，檢測劑儲液瓶201關閉，沖洗回路暢通；(2)開啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲液瓶101流出，流經組織培養腔105、組織培養腔出口的細胞截留器501、檢測腔107，再流入廢液瓶，從而完成對組織培養腔及培養物中溶液的置換，排除培養液中物質對檢測的干擾；(3)沖洗完成后，旋轉三通閥切換流路，使沖洗液儲液瓶101關閉，檢測液儲液瓶201通暢，開啟恒流泵103，使檢測液從檢測液儲液瓶流出，流經組織培養腔105、組織培養腔出口細胞截留器501、檢測腔107，再流入廢液瓶，從而完成檢測液對組織培養腔及培養物中沖洗液的置換，使整個檢測回路中的液體為濃度均一的，未經稀釋的檢測液；(4)旋轉三通閥切換流路，使廢液儲液瓶109關閉，從而使檢測液在封閉回路中循環，保持檢測液中含有維持細胞正常代謝的成分(如培養基、Hanks液成分等)，保證細胞在檢測期間維持正常的生理狀態，保證在檢測期間細胞基本的營養需求。回路封閉循環，保證反應體系的傳質，防止局部物質過濃，影響反應結果。(5)檢測反應初始時刻的通過檢測器的反應信號作為初始信號，傳遞到計算機204，從而完成初始信號的采集。(6)讓檢測液在回路中循環規定的時間，在反應期間，檢測器連續檢測反應信號，把信號傳遞到計算機204，經過計算機處理獲得細胞活力的數據。(7)在反應結束時，將三通閥切換至沖洗回路暢通；(8)開啟恒流泵103，使沖洗液從沖洗液儲液瓶101流出，流經組織培養腔105，組織培養腔出口的細胞截留器501、再流入廢液瓶109，從而完成對組織培養腔及培養物的沖洗。(9)關閉恒流泵103，旋轉三`通閥關閉檢測回路上下游，切換至培養回路，使培養回路暢通；繼續組織培養。
權利要求
1.一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，包括一個與組織工程反應器的培養回路并聯的檢測回路和一個與組織工程反應器的培養回路并聯的沖洗回路。檢測回路和沖洗回路通過三通閥和管路組合在一起，并通過閥門開閉控制檢測回路和沖洗回路的切換。
所述的沖洗回路包括一個沖洗液儲液瓶101，一個三通閥102，一個液體驅動泵103，一個三通閥104，一個組織培養腔105，組織培養物111、一個三通閥106，一個檢測腔107，一個三通閥108，一個廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個回路； 所述的檢測回路包括一個檢測液儲液瓶201，一個三通閥202，一個液體驅動泵103，一個三通閥104，一個組織培養腔105，組織培養物111、一個三通閥106，一個檢測器203，檢測器中與檢測管路相連接的檢測腔107，一個三通閥108，一個廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個回路，檢測器與一個計算機204連接。
2.根據權利要求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其特征在于進一步包括一個與組織工程反應器的培養回路并聯的沖洗回路: 所述的組織培養物111位于組織培養腔內105 ； 所述的三通閥104和106分別位于組織培養腔105的上下游，完成流路在組織培養回路與檢測或沖洗回路之間的切換；三通閥102位于沖洗液儲液瓶上游，用于控制沖洗液儲液瓶的開閉； 所述的液體驅動泵103設置在沖洗液儲液瓶101和組織培養腔105之間，用于驅動液體從沖洗液儲液瓶101依次流經組織培養腔105和檢測腔107，流入廢液瓶109，完成對組織培養物的沖洗。
3.根據權利要求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其特征在于進一步包括一個與組織工程反應器的培養回路并聯的檢測回路: 所述的三通閥202位于檢測液儲液瓶201和液體驅動泵103之間，完成流路在檢測回路、檢測循環回路或沖洗回路之間的切換；三通閥104和106分別位于組織培養腔105的上下游，完成流路在組織培養回路與檢測或沖洗回路之間的切換；三通閥108位于廢液瓶109和檢測液儲液瓶101之間，完成流路在檢測回路或檢測循環回路之間的切換； 所述的檢測器，設置在組織培養腔下游，用于檢測信號變化；在檢測過程中恒流泵103驅動檢測液在該封閉的回路中循環。
4.根據權利要求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其特征在于進一步包括檢測回路和沖洗回路通過三通閥和管路組合在一起，并通過閥門開閉控制檢測回路和沖洗回路的切換: 一個沖洗液儲液瓶101，一個三通閥102，一個檢測液儲液瓶201，一個三通閥202，一個液體驅動泵103，一個三通閥104，一個組織培養腔105，一個三通閥106，一個檢測器203，檢測器中與檢測管路相連接的檢測腔107，一個三通閥108，一個廢液瓶109，管路110把上述部件連接成一個回路，檢測器與一個計算機204連接，通過計算機204控制檢測器并進行檢測數據的處理和輸出； 所述的檢測液儲液瓶201、沖洗液儲液瓶101、廢液瓶109依次設置于液體驅動泵103的上游，分別通過三通閥202、102、108與液體驅動泵103上游的管路相連，通過三通閥的開閉控制檢測回路和沖洗回路的 切換。
5.根據權利要求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，檢測組織工程生物反應器中組織植入物上細胞生長及細胞活性的方法，其特征在于包括: (1)關閉組織培養回路上下游 (2)切換至沖洗回路； (3)沖洗組織培養物； (4)關閉沖洗回路，開啟檢測回路； (5)將檢測試劑注入到組織培養腔內； (6)讓檢測試劑在檢測回路中循環，檢測初始狀態的光密度或熒光強度作為初始值(參比)； (7)讓檢測試劑在檢測回路中循環，讓檢測試劑反應至規定的時間； (8)檢測反應結束時的光密度或熒光強度，將檢測到的信號與參比對照，計算活細胞量; (9)切換至沖洗回路 (10)沖洗組織培養物； (11)關閉沖洗回路，切換至培養回路，繼續組織培養。
6.根據權利要 求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其特征在于所述的管路所述的管路110是由無毒的、能夠耐受濕熱滅菌或化學滅菌如環氧乙烷、酒精滅菌的軟管或硬管組成，管子的直徑在0.1mm到3mm之間。
7.根據權利要求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其特征在于所述的檢測腔107是能夠進行熒光、吸光度、或化學發光檢測的腔體；檢測器110是可進行熒光、吸光度、或化學發光檢測的設備模塊；檢測器與一個計算機112連接，通過計算機112控制檢測器，并進行檢測數據的處理和輸出。
8.根據權利要求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其特征在于所述的檢測液可以是對細胞無毒或低毒的試劑包括:含有刃天青(Resazurin)染料的試劑如Alamar Blue，含有二乙酰熒光素染料的試劑，含有乳酸脫氫酶的試劑，含有氟衍生物(fluoderivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、卩引哚衍生物(indo derivate)、rhod_2、|丐綠和quin-2組成的試劑。并且檢測液含有對應的組織細胞維持代謝必需的營養物質和pH環境，例如與待測細胞培養條件一致的細胞培養液或D-Hanks液、PBS液等，并且這些物質不影響檢測反應的進行和信號的檢測。
9.根據權利要求1所述的一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置，其特征在于所述的組織培養物111可以是固定在組織工程反應器的組織培養腔中，也可以是在組織培養腔中懸浮狀態培養。
全文摘要
本發明提供了一種用于組織工程反應器的活細胞檢測裝置及檢測方法，可在不損傷細胞活性及功能，不中斷培養過程的前提下檢測組織工程生物反應器中組織培養物的細胞生長情況。根據本發明的一個實施例的活細胞檢測裝置包括與組織工程反應器的培養回路并聯的一個沖洗回路和一個檢測回路，兩者通過三通閥和管路組合在一起，通過閥門開閉控制回路之間的切換。沖洗回路包括一個沖洗液儲液瓶101，一個液體驅動泵103，一個廢液瓶109，完成檢測前后對組織培養物111的沖洗；檢測回路包括一個檢測液儲液瓶201，一個液體驅動泵103，一個檢測器203和一個計算機204，一個廢液瓶109，完成對組織培養物111上活細胞的檢測。
文檔編號C12M3/02GK103074213SQ201210579150
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者貢向輝, 樊瑜波 申請人:北京航空航天大學