專利名稱：D4去飽和酶和d5延伸酶的制作方法
D4去飽和酶和D5延伸酶本申請為分案申請，其原申請的申請日為2007年10月31日，申請號為200780100540.5 (國際申請號為PCT/IB2007/004553)，名稱為“D4去飽和酶和D5延伸酶”。1.背景有壓倒性的科學證據表明，(n-3)高級不飽和脂肪酸諸如二十二碳六烯酸(DHA)對心血管循環疾病、慢性炎癥和腦功能障礙有積極作用。另一方面，已經注意到(n-6)脂肪酸諸如二十碳五烯酸(EPA)在類花生酸類固醇諸如前列腺素、白細胞三烯或類似的類花生酸類固醇中作為中間代謝產物。目前，這些高級不飽和脂肪酸的主要來源是魚，注意到EPA和DHA在各種海洋魚類(blue fish)(諸如沙丁魚和金槍魚)中分別以大約20%和10%的量存在。認為這樣一種脂肪酸譜是通過在每種魚類中自然選擇最佳表現的最佳比例而發生的。然而，如果人們想要使用魚油作為這些脂質的唯一來源，還存在許多缺陷，諸如味道污染的問題，可獲得性的不可控的波動，和天然魚油成分的變化性。此外，如果人們想要從這些來源獲得高度純化的(n-3)或(n-6)油，很難優先分離并純化它們。此前公開了能夠產生高量DHA和EPA以及其它首選脂肪酸的破囊壺菌目(Thraustochytriales)真核生物0NC-T18和相關有機體。0NC-T18公開在國際申請PCT/IB2006/003977和美國臨時串請60/751401和60/821084，這些都通過參考至少涉及0NC-T18和其中產生的脂肪酸的信息的方式并入本文。期望操縱DHA和EPA途徑。本文公開了來自0NC-T18、牽涉在這些途徑中的兩種酶D4去飽和酶和D5延伸酶的分離和表征。I1.概述公開了涉及0NC-T18、D4-去飽和酶、D5延伸酶和分離、表征、產生、鑒定它們的方法和組合物，和它們用于脂 肪酸產生的應用，以及包含這些組合物的有機體和表達這些組合物的有機體。II1.附圖簡述并入本文并構成說明書一部分的附圖，闡釋了多種實施方式，并連同描述闡釋了公開的組合物和方法。

圖1顯示EPA和DHA產生的途徑。圖2A顯示分離的D4去飽和酶的系統進化(phylogentic)樹，圖2B顯示分離的D5-延伸酶的系統進化(phlogenetic)樹。圖3顯示分離的D4去飽和酶的圖示遺傳概述。圖4顯示分離的D5延伸酶的圖示遺傳概述。IV.詳述公開和描述本發明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法之前，應理解的是，除非另外指明，否則它們不限于具體合成方法或具體重組生物技術方法，或除非另外指明，否則不限于具體試劑，因為本發明的這些化合物、組合物、物品、裝置和/或方法當然都可以變化。還應理解的是，本文所用的術語僅是為了描述具體實施方案的目的，不意為限制。A.定義
在說明書和所附的權利要求書中所用的，除非上下文另外清楚地指明，否則單數形式“一個”、“一種”和“該”包括多數指示物。因此，例如，提到“一種藥物運載體”包括兩種或多種所述運載體(carrier)的混合物,等等。本文中范圍可表示為從“約” 一個具體值和/或到“約”另一個具體值。當表示這種范圍時，另一實施方案包括從一個具體值和/或到另一個具體值。類似地，當數值通過使用先行詞“約”表示為近似值時，應理解的是，該具體值形成另一實施方案。進一步應理解的是，每個范圍的端點在相對于另一端點和獨立于另一端點兩種情況下都是有意義的。還應理解的是，本文公開了許多數值，每個數值除了該數值本身，還在本文公開為“約”該具體值。例如，如果公開數值“10”，那么還公開了“約10”。還應理解的是，當公開數值時，還公開了“小于或等于”該數值、“大于或等于該數值”和數值之間的可能范圍，如本領域技術人員適當地理解的。例如，如果公開“10”，則還公開了 “小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應理解的是，在本申請中，數據以多種不同形式提供，且該數據代表端點和起點，以及數據點的任何組合的范圍。例如，如果公開具體數據點“ 10”和具體數據點15,則應理解的是，認為公開了大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10與15之間。還應理解的是，還公開了兩個具體單位之間的每個單位。例如，如果公開10和15，那么還公開7 11、12、13 和 14。 在說明書和所附的權利要求書中，將提及許多術語，這些術語應被界定為具有以下含義:“任選”或“任選地”是指其后描述的事件或情況可能發生或可能不發生，該描述包括其中所述事件或情況發生的情形和所述事件或情況不發生的情形。“引物”是能夠支持一些類型的酶促操縱并能與靶核酸雜交以使酶促操縱可發生的探針亞組。引物可從本領域可獲得而不干擾酶促操縱的核苷酸或核苷酸衍生物或類似物的任何組合制備。“探針”是能夠與靶核酸相互作用的分子，所述相互作用典型地是以序列特異性方式例如經由雜交。核酸的雜交是本領域熟知的，并在本文討論。典型地探針可從本領域可獲得的核苷酸或核苷酸衍生物或類似物的任何組合制備。在本申請中，參照了多種出版物。這些出版物的公開完整地通過參考并入本申請，以更完全地描述本申請所屬領域的技術狀態。公開的參考文獻還單獨和具體地通過參考包含在其中的材料而并入本文，所述材料在參考文獻所依賴的語句中討論。公開了將用于制備公開的組合物的組分以及將用于本文公開的方法的組合物本身。本文公開這些和其它材料，應理解的是，當公開這些材料的組合、亞組、相互作用、組等等時，盡管可能沒有明確地公開具體地提及這些化合物的每種不同的單獨和共同的組合和排列，但本文具體地預期并描述每一種。例如，如果公開和討論具體的D4去飽和酶和D5延伸酶，并討論可對包括D4去飽和酶和D5延伸酶的大量分子進行的大量修飾，則具體地預期D4去飽和酶和D5延伸酶的每一種和每種組合和排列以及可能的修飾，除非具體地指明相反。因此，如果公開一類分子A、B和C以及一類分子D、E和F并公開組合分子A-D的一個實例，那么即使沒有單獨地提及每一種，也單獨和共同地預期每一種，即認為公開了組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-EjP C-F。類似地，還公開了這些的任何亞組或組合。因此，例如，將認為公開了 A-E、B-FjP C-E的亞組。這一概念應用到本申請的所有方面，包括但不限于制備和使用公開的組合物的方法的步驟。因此，如果有可進行的多個另外步驟，應理解的是，這些另外步驟的每一個可與公開的方法的任何具體的實施方案或實施方案的組合一起進行。B.組合物在強化某些食品以促進健康飲食方面，ω-3濃縮物(二十碳五烯酸EPA，即20:5η-3，和二十二碳六烯酸DHA，即22:6η-3)的使用已經變得重要。破囊壺菌Thraustochytrid是天然地產生DHA的海洋原生生物,產生的DHA達其生物量的20%。發酵這些有機體的能力提供了這些ω-3油的可再生的、長期來源。脂肪酸代謝途徑的表征(圖1)揭示了負責延伸EPA為二十二碳五烯酸(DPA、22:5n-3)的D5-延伸酶、以及牽涉在去飽和DPA為DHA的D4-去飽和酶的重要性。操縱特定酶活性可以影響由我們的0NC-T18菌株產生EPA和DHA的產率，如由市場和我們的顧客的需要所要求的。使用從不同破囊壺菌Thraustochytrid菌株(用于D4-去飽和酶的破囊壺菌 Thraustochytrium sp.(CS020087)、金黃色破囊壺菌 Thraustochytriumaureum(AF391546)、破囊壺菌 Thraustochytrium sp.ATCC34304(AF391543)、破囊壺菌 Thraustochytrium sp.ATCC21685(AF489589)和破囊壺菌 Thraustochytriumsp.FJN-1O (DQ133575);用于 D5-延伸酶的破囊壺菌 Thraustochytrium sp.(CS160897)和金黃色破囊壺菌Thraustochytrium aureum(CS160879))的酶的基因序列中的保守區域構建的簡并引物，從ONC T-18分離了 D4-去飽和酶和D5延伸酶。進一步PCR擴增來自基因組DNA的基因的一部分(分別是967bp和593bp)。基因組步移(APAgene GOLD試劑盒，BIOS&T, Montreal, Quebec)用于延伸已知序列以摻入完整的開放閱讀框，并進一步延伸以鑒定任一側上的相鄰基因以及啟動子區域。隨后對完整序列構建引物以產生摻入完整的開放閱讀框的全基因PCR產物(分別是1758bp和1099bp)。將PCR產物克隆到pT7_Blue3載體(Novagen, San Diego, California)并轉化到大腸桿菌 NovaBlue (DE3) (Novagen, SanDiego, California),隨后測序。

使用UltraClean6Minute Mini 質粒制備試劑盒(MO BIOLaboratories, Inc., Solana Beach, California)純化獲得的基因質粒。隨后使用限制酶BamHI和NotI切下基因插入片段并克隆到pYES2酵母表達載體(Invitrogen, Carlsbad, California)。隨后使用 S.c.EasyComp 轉化試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, California),在半乳糖啟動子Gall控制下，轉化鑒定為pYDes(D4-去飽和酶)和pYElo (D5-延伸酶)的新載體構建體到釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl 陰性對照菌株是包含未改變的pYES2載體的INVScI，使這些菌株同時生長。使用酵母菌株的尿嘧啶營養缺陷型進行載體篩選，并使用無尿嘧啶的SC培養基。使用酵母表達體系確定D4-去飽和酶和D5延伸酶的活性和特異性。轉化的酵母在包含2%葡萄糖、l%Tergitol NP-40的SC-U培養基中在30°C 150RPM下生長48hr。制備包含SC-U、2%半乳糖、1%棉子糖、l%Tergitol NP-40和500 μ M特定自由脂肪酸的底物培養基。將轉化的酵母培養物以0.5的0D600接種到IOOml底物培養基，并將培養物在20°C培養5天。以2000RPM離心5min，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌一次，隨后冷凍干燥來回收生物量。其后進行脂肪酸甲基酯氣相色譜以確定脂肪酸去飽和與延伸的效率。通過計算(產物)/ (底物+產物)*100而確定底物的轉化百分比。
BLASTx結果顯不，ONC T-18D4去飽和酶與破囊壺菌Thraustochytriumsp.ATCC2168OT4-去飽和酶96%相似。圖2A顯示當與0NC-T18D4-去飽和酶序列相比時的置根鄰接系統進化樹(rooted neighbour-joining phylogenetic tree),該系統進化樹使用ClustalX，使用BLASTx搜尋結果的自展分析(IOOOx)確定。D4-去飽和酶基因具有1560bp的開放閱讀框，轉錄519氨基酸的蛋白。該蛋白的分析顯示細胞色素b5結構域、三個組氨酸盒基序和四個跨膜區，所有元件都是前端去飽和酶的特征。與該基因相鄰的是五個推定的TATA盒、多個重復區、兩個啟動子和上游鑒定的蛋白激酶以及下游的AP2結合蛋白(圖3)。相反，BLASTx搜尋鑒定D5-延伸酶蛋白為與破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-1O多不飽和的脂肪酸延伸酶具有89%的同一性。圖2B顯示當與0NC-T18D5-延伸酶序列相比時的置根鄰接系統進化樹，該系統進化樹使用ClustalX，使用BLASTx搜尋結果的自展分析(IOOOx)確定。進一步分析確定該831bp長的延伸酶編碼276氨基酸的蛋白，包含對線粒體特異性的四個跨膜區、和一個組氨酸盒基序。該D5-延伸酶區的上游組分包含線粒體輸入受體之前的單個TATA盒、多個重復區和啟動子，而在下游鑒定了膜占據和識別連結(recognition nexus)基序的開始(圖4)。n-3和n-6途徑的pYDes的表征(表I)顯示14%的DPA n_3或二十二碳四烯酸(DTA 22:4 n-6)分別轉化為 DHA 或 DPA n_6。復I: D4-去飽和酶的酶活性和表征
權利要求
1.一種組合物，其包含D5延伸酶，其中所述D5延伸酶與SEQ ID NO: 15具有至少或大于 70%、80%、89%、90%、95%、96%、97% 的同一性。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中不同于SEQID NO: 15的任何變化是保守性變化。
3.一種包含核酸的組合物，其中所述核酸編碼權利要求1-2任一項所述的D5延伸酶。
4.根據權利要求3所述的組合物，其還包含載體。
5.一種包含細胞的組合物，其中所述細胞包含權利要求1-4任一項所述的組合物。
6.根據權利要求5所述的組合物，其中所述細胞是真核生物、原核生物、破囊壺菌(Thraustochytrid)、酵母或大腸桿菌。
7.一種包含非人類動物的組合物，其中所述非人類動物包含權利要求1-6任一項所述的組合物。
8.根據權利要求5-7任一項所述的組合物，其中所述組合物比不存在D5延伸酶的組合物產生更多的多不飽和的脂肪酸。
9.根據權利要求8所述的組合物，其中所述脂肪酸是EPA或DHA。
10.根據權利要求1-9任一項所述的組合物，其中所述延伸酶是在延伸酶底物存在下。
11.根據權利要求1-10任一項所述的組合物，其中所述底物具有至少100μΜ、200μΜ、300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ Μ、800 μ Μ、900 μ M 或 1000 μ M 的濃度。
12.根據權利要求1-11任一項所述的組合物，其中所述底物是二十碳五烯酸(20:5η-3)或花生四烯酸(20:4η-6)。
13.根據權利要求1-12任一項所述的組合物，其中所述延伸酶轉化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95% 的可獲得的底物。
14.根據權利要求1-13任一項所述的組合物，其中所述組合物是分離的。
15.一種產生多不飽和的脂肪酸的方法，包括使用權利要求1-14任一項所述的組合物中的一種或多種。
16.根據權利要求15所述的方法，其中產生的所述脂肪酸是EPA或DHA。
17.—種產生權利要求1-14任一項所述的組合物的方法,其包括分離權利要求1-14任一項所述的組合物。
全文摘要
本發明公開了涉及ONC-T18、D4-去飽和酶、D5延伸酶和分離、表征、產生、鑒定它們的方法和組合物，和它們用于脂肪酸產生的應用，以及包含這些組合物的有機體和表達這些組合物的有機體。
文檔編號C12N1/19GK103074312SQ20121057916
公開日2013年5月1日 申請日期2007年10月31日 優先權日2007年7月13日
發明者A·M·伯杰, G·S·吉魯阿德, H·瑞迪亞寧塔斯 申請人:加拿大海洋營養食品有限公司