專利名稱：一種基于定向點突變的革蘭陰性菌無疤痕基因敲除方法
技術領域：
本發明涉及革蘭陰性菌基因敲除技術，尤其涉及的是一種基于定向點突變的革蘭陰性菌無疤痕基因敲除方法。
背景技術：
革蘭陰性菌是人和動物常見的病原細菌，腸桿菌科的大腸桿菌和沙門菌可引起人和動物不同的疾病，如腹瀉、出血性腸炎等。而研究這些病原菌的毒力基因及其功能可為這些疾病的免疫防制奠定理論基礎。基因敲除技術是研究基因功能的一種常用方法。常規的基因敲除技術是基于同源重組的雙交換或者單交換，將靶基因用特定的標記基因(如抗性基因)替換，以達到完全去除靶基因的目的。但由于基因在染色體上是以雙鏈的形式存在，當同源重組交換目的基因時，將目的基因的正反向鏈同時交換去除，因此獲得的突變體實際上是兩條單鏈的同時缺失，而突變體所表現出的表型也是正反兩條單鏈上的基因共同缺失所表現出來的。所以，常規的同源重組基因敲除技術還需做回復突變以驗證目的基因的功能。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種基于定向點突變的革蘭陰性菌無疤痕基因敲除方法。本發明的技術方案如下一種基于定向點突變的革蘭陰性菌無疤痕基因敲除方法，以質粒pKD267為模板，選目的基因上下游各500 bp 處的序列50 nt加pKD267上的序列20 nt用以擴增質粒上的抗性基因(kan)和細胞死亡控制基因(ccdB)，采用電轉法將PCR產物轉化入目的菌，該目的菌已經被提前轉入PKD46，并在30°C條件下，以阿拉伯糖誘導讓其大量表達Red重組酶，以卡那抗性篩選陽性克隆。分別在目的基因上下游各500bp和目的基因開放閱讀框內設計引物，同時在目的基因的開放閱讀框引入點突變，使其起始密碼和其互補鏈相應位置突變為AAA。進行兩次PCR,引物5a-REC0-RED和IuxS-RECO-RED擴增IuxS上游500bp和IuxS基因，在起始密碼ATG的互補鏈上引入點突變AAA。引物3a-REC0-RED和luxS_5a_RED擴增IuxS下游500bp和IuxS基因，在編碼鏈起始密碼ATG處引入點突變AAA。兩次PCR產物混合后進行第三次PCR，獲得的長片段，再利用同源重組技術，將PCR產物直接轉化第一次的陽性克隆菌(此時的目的菌已經被提前轉入PKD46，并在300C條件下，以阿拉伯糖誘導讓其大量表達Red重組酶)，以鼠李糖培養基篩選陽性克隆；第三次 PCR 采用引物對5a-REC0-RED :5’ -CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-REC0_RED 5’ -CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。由于細胞死亡因子啟動子是鼠李糖誘導的，因此重組成功的克隆不含ccdB基因，可以在限制性培養基上生長，從而獲得只有一條正向單鏈發生點突變的突變體，而其互補鏈上的基因序列除了引入的點突變外，未發生任何改變。


圖1為本發明基于無疤痕突變的定向突變技術策略；圖2為第一次插入突變菌落PCR鑒定結果；M DNA Marker ;泳道1_17 :待檢菌落；泳道18 :SL1344野生株；圖3為回復突變菌落PCR鑒定結果；M DNA Marker ;泳道1_10 :待檢菌落；泳道
11:陽性對照；泳道12 :陰性對照；圖4為A1-2實驗結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。一、材料與方法1.菌株與培養條件所有的質粒保存在T0P10E. coli中，S. typhimurium SL1344作為突變的對象。帶有PKD46的細菌培養在30°C，質粒去除及其它細菌培養在37°C。LB培養基用于常規的細菌培養，SOC培養基用于電轉后的恢復培養基。抗生素濃度為氨芐青霉素100μ g/ml，卡那青霉素的濃度為50 μ g/ml ο2.質粒質粒pKD46 和 pKD267 (pKD267 公開文獻Shoji M, Ratnayake D, Shi Y,KadowakiT, Yamamoto K, Yoshimura F, Akifumi A, Curtis M, and NakayamaK.Construction andcharacterization of a nonpigmented mutant of Porphyromonasgingivalis cell surfacepoIysaccharide as an anchorage for gingipains.Microbiology，2002，148 :1183-1191.)用于本研究。質粒 pKD46 編碼 λ-Red 重組酶系統，它可介導線性DNA分子與染色體DNA的同源重組，同時包含一個氨芐抗性基因，為溫度敏感型質粒，需要細胞維持在30°C。質粒pKD267用作模板擴增卡那霉素抗性基因盒和ccdB基因，后者用于后續的篩選。3. PCR 反應本發明中所有用于PCR反應的引物列于表I。50 μ L PCR體系中包含O.1 μ gDNA模板(可以采用純化的基因組DNA、質粒DNA或PCR產物作模板)，IXPhusionDNA聚合酶緩沖液，5U Phusion DNA 聚合酶(Finnzymes), 1mM dNTPs (Sigma), 2 μ M 引物。所用 PCR 儀為Bio-Rad熱循環儀。以PKD267為模板的擴增，條件為5個循環，每個循環94°C變性30s，53°C退火30s，72。。延伸2. 5min ;25個循環，每個循環94°C變性30s，65°C退火30s，72。。延伸2. 5min ；最后72°C延伸5min。其它PCR程序條件為98°C預變性30s ;35個循環，每個循環98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸lmin/lkb ;最后72°C延伸lOmin。獲得的PCR產物純化后用50 μ l EB緩沖液洗脫后用于overlapping extension PCR,純化后用于S. typhimuriumSL1344的電轉。表1.引物序列
權利要求
1. 一種基于定向點突變的革蘭陰性菌無疤痕基因敲除方法，其特征在于，包括以下步驟 Al，以質粒pKD267為模板，選目的基因上下游各500bp處的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以擴增質粒上的抗性基因(kan)和細胞死亡控制基因(ccdB)，采用電轉法將PCR產物轉化入目的菌，該目的菌已經被提前轉入PKD46，并在30°C條件下，以阿拉伯糖誘導讓其大量表達Red重組酶，以卡那抗性篩選陽性克隆； A2，分別在目的基因上下游各500bp和目的基因開放閱讀框內設計引物，同時在目的基因的開放閱讀框引入點突變，使其起始密碼和其互補鏈相應位置突變為AAA;進行兩次PCR,引物5a-REC0-RED和IuxS-RECO-RED擴增IuxS上游500bp和IuxS基因，在起始密碼ATG的互補鏈上引入點突變AAA ;引物3a-REC0-RED和luxS_5a_RED擴增IuxS下游500bp和IuxS基因，在編碼鏈起始密碼ATG處引入點突變AAA ； A3，步驟A2中的兩次PCR產物混合后進行第三次PCR，獲得的長片段，再利用同源重組技術，將PCR產物直接轉化第一次的陽性克隆菌，以鼠李糖培養基篩選陽性克隆；第三次 PCR 采用引物對5a-REC0-RED :5’ -CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-REC0_RED 5’ -CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。
全文摘要
本發明公開了一種基于定向點突變的革蘭陰性菌無疤痕基因敲除方法，第一次PCR設計引物時，以質粒pKD267為模板，選目的基因上下游各500bp處的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以擴增質粒上的抗性基因(kan)和細胞死亡控制基因(ccdB)；第二次PCR設計引物時，分別在目的基因上下游各500bp和目的基因開放閱讀框內設計引物，同時在目的基因的開放閱讀框引入點突變，使其起始密碼和其互補鏈相應位置突變為AAA；兩次PCR產物混合后進行第三次PCR，獲得的長片段，再利用同源重組技術，將PCR產物直接轉化第一次的陽性克隆菌，以鼠李糖培養基篩選陽性克隆。
文檔編號C12N15/09GK103031299SQ201210578928
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者陳偉 申請人:塔里木大學